멀티 타겟 원체 전체 마운트 현장에서 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교 초파리 배아

Chromogenic Multi-target WISH의 전반적인 목표는 온전한 초파리 배아 내에서 mRNA 분포 패턴의 매핑을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 동일한 배아 내에서 세 가지 다른 유전자의 mRNA 국소화를 직접 비교할 수 있습니다. Multi-color WISH는 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 개발 중인 유기체의 유전자 발현 맵을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 유전자 조절 상호작용, 활성 및 배아 발달 또는 기관 형성에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 유전자의 mRNA 발현 패턴이 독특하고 대조되는 색상으로 시각화된다는 것입니다. 이러한 방식으로 고유하고 중복되는 발현 부위를 높은 정확도로 강조 표시할 수 있습니다. 표준 절차를 사용하여 필요한 배아를 수집, 탈각, 고정 및 분리합니다. 필요할 때까지 메탄올에 넣어 냉동실에 보관한다. 이제 실온에서 배아부터 시작합니다. 12웰 플레이트의 첫 번째 웰에 인서트를 끼우고 2밀리리터의 메탄올을 추가합니다. 원하는 양의 배아를 삽입물로 옮기고, 삽입물은 절차 전반에 걸쳐 배아를 운반하는 데 사용됩니다. 이제 감소하는 메탄올 시리즈에서 3분 배양을 사용하여 배아를 재수화합니다. PBS에 있는 75%methanol로 시작하십시오. PBS-T에 50% 메탄올을 첨가하십시오. 그런 다음 PBS-T에 25% 메탄올을 사용하고 순수 PBS-T에서 두 번의 배양으로 마무리합니다. 다음으로, 실온에서 20분 동안 PBS의 4%파라포름알데히드를 배아에 접두어로 붙입니다. PBS-T에서 4회 세척하여 정착액을 제거합니다. 세척 단계에서 Proteinase K 및 글리신에 대한 작업 용액을 해동하고 준비합니다. 세척 후 갓 준비한 Proteinase K에 배아를 실온에서 3분 동안 투과시킵니다. 갓 준비한 글리신을 1분 동안 두 번 씻어 반응을 멈춥니다. 그런 다음 PBS에서 만든 4% 파라포름알데히드에 배아를 실온에서 20분 동안 접미사합니다. 파라포름알데히드는 PBS-T로 3분씩 4회 세척하여 씻어냅니다. 그런 다음 배아를 prehybridization buffer로 옮깁니다. 필요할 때까지 냉동실에 보관할 수 있습니다. prehy buffer에 있는 배아를 2ml 튜브에 분배하는 것으로 시작합니다. 약 15마이크로리터의 침전된 배아를 각 튜브에 분주합니다. 이제 65