인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

먼저, 단세포 인간 만능 줄기 세포 또는 HPSC 현탁액을 200배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세척 배지를 흡인하고 응집 배지에서 1.2 곱하기 10의 밀도에서 밀리리터당 6번째 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 준비된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 시딩하고 세포를 고르게 분포시킵니다.

많은 수의 웰을 파종하려면 침전을 방지하기 위해 세포 현탁액을 주기적으로 와류로 처리하십시오. 파종 후 200 회 g에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 스핀 후 현미경으로 플레이트를 관찰하여 세포가 각 마이크로웰의 바닥으로 회전했는지 확인합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 5%C-O 2, 5%O 2 저산소 인큐베이터에서 배양합니다. 응집 하루 후 현미경으로 응집체를 검사합니다. 원심분리 직후 응집과 비교했을 때, 가장자리가 매끄럽고 온전하게 나타나야 합니다.

마이크로웰 플레이트를 수평으로 잡고 P-1000 마이크로피펫터의 팁을 배양 배지 표면과 웰 가장자리에 대고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 매체를 천천히 제거하고 마이크로웰 바닥의 응집체를 방해하지 않도록 주의하십시오. 질감이 있는 마이크로웰 표면에서 매체 수준을 약 1-2mm로 줄인 후 플레이트를 천천히 기울이고 웰에서 나머지 매체를 천천히 흡인합니다.

피펫 팁을 웰의 내부 가장자리에 대고 웰의 내부 벽에 배지를 매우 천천히 분배하여 갓 준비된 예열된 1단계 유도 배지 1밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 3일 동안 저산소 상태에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 4일차에는 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 마이크로웰 플레이트의 각 웰에서 응집체를 채취합니다.

15ml 원추형 튜브에 최대 10웰의 골재 현탁액을 수집합니다. 응집체가 저산소 인큐베이터에서 15분 동안 침전되도록 합니다. 응집체가 침전된 후 상층액을 조심스럽게 흡인하고 예열된 세척 매체 10ml에 응집체를 다시 현탁시켜 잔류 유도성 사이토카인을 제거합니다.

골재를 50배 g에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 펠릿화된 응집체를 예열된 2단계 유도 매체에 다시 현탁시킵니다. 골재 현탁액을 웰당 1ml의 24웰 초저 부착 플레이트로 옮깁니다.

현미경으로 응집체를 균일한 밀착 세포 클러스터로 관찰합니다. 6일째까지 저산소 상태에서 배양합니다. 6일차에는 이전과 같이 15ml 원뿔형 튜브당 최대 10ml의 골재를 풀링합니다.

응집체가 침전된 후 상층액을 흡인하고 예열된 3단계 유도 매체에서 응집체를 다시 현탁시킵니다. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 응집체를 웰당 1ml의 24웰 초저 부착 플레이트에 재분배합니다. 배양 10일째에 완전한 매체 변화를 수행합니다.

12일째에 남은 배양 기간 동안 세포를 산소 20%와 이산화탄소 5%의 정상 산소 배양 조건으로 전환합니다. 심장 유도 단계에서 6일에 해당하는 12일의 분화 후 3번의 중간적이고 강력한 응집체 전체 수축이 관찰되었습니다. 17일째에 세포의 74.8%가 히스토그램의 채워진 부분에서 알 수 있듯이 유세포 분석에 의해 심장 트로포닌 T에 대해 양성입니다.

또한 2차 항체만으로 염색된 세포도 표시되며, 이는 히스토그램의 채워지지 않은 부분으로 표시됩니다. 이 절차를 시도하는 동안, 심장 유도를 희생하면서 미량의 사이토카인, 특히 내배엽 분화를 촉진하는 activin-A를 제거하기 위해 4일째에 응집체를 잘 세척하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 응집체 내 유도 세포 유형의 냉각 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 이웃 배아 조직의 부분비 신호가 심장 계통으로의 인간 만능 줄기 세포 분화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.