인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화
2016년 9월 25일
기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다.
먼저, 단세포 인간 만능 줄기 세포 또는 HPSC 현탁액을 200배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세척 배지를 흡인하고 응집 배지에서 1.2 곱하기 10의 밀도에서 밀리리터당 6번째 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 준비된 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 시딩하고 세포를 고르게 분포시킵니다.
많은 수의 웰을 파종하려면 침전을 방지하기 위해 세포 현탁액을 주기적으로 와류로 처리하십시오. 파종 후 200 회 g에서 5 분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 스핀 후 현미경으로 플레이트를 관찰하여 세포가 각 마이크로웰의 바닥으로 회전했는지 확인합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 5%C-O 2, 5%O 2 저산소 인큐베이터에서 배양합니다. 응집 하루 후 현미경으로 응집체를 검사합니다. 원심분리 직후 응집과 비교했을 때, 가장자리가 매끄럽고 온전하게 나타나야 합니다.
마이크로웰 플레이트를 수평으로 잡고 P-1000 마이크로피펫터의 팁을 배양 배지 표면과 웰 가장자리에 대고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 매체를 천천히 제거하고 마이크로웰 바닥의 응집체를 방해하지 않도록 주의하십시오. 질감이 있는 마이크로웰 표면에서 매체 수준을 약 1-2mm로 줄인 후 플레이트를 천천히 기울이고 웰에서 나머지 매체를 천천히 흡인합니다.
피펫 팁을 웰의 내부 가장자리에 대고 웰의 내부 벽에 배지를 매우 천천히 분배하여 갓 준비된 예열된 1단계 유도 배지 1밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 3일 동안 저산소 상태에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 4일차에는 5ml 혈청학 피펫을 사용하여 마이크로웰 플레이트의 각 웰에서 응집체를 채취합니다.
15ml 원추형 튜브에 최대 10웰의 골재 현탁액을 수집합니다. 응집체가 저산소 인큐베이터에서 15분 동안 침전되도록 합니다. 응집체가 침전된 후 상층액을 조심스럽게 흡인하고 예열된 세척 매체 10ml에 응집체를 다시 현탁시켜 잔류 유도성 사이토카인을 제거합니다.
골재를 50배 g에서 2분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 펠릿화된 응집체를 예열된 2단계 유도 매체에 다시 현탁시킵니다. 골재 현탁액을 웰당 1ml의 24웰 초저 부착 플레이트로 옮깁니다.
현미경으로 응집체를 균일한 밀착 세포 클러스터로 관찰합니다. 6일째까지 저산소 상태에서 배양합니다. 6일차에는 이전과 같이 15ml 원뿔형 튜브당 최대 10ml의 골재를 풀링합니다.
응집체가 침전된 후 상층액을 흡인하고 예열된 3단계 유도 매체에서 응집체를 다시 현탁시킵니다. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 응집체를 웰당 1ml의 24웰 초저 부착 플레이트에 재분배합니다. 배양 10일째에 완전한 매체 변화를 수행합니다.
12일째에 남은 배양 기간 동안 세포를 산소 20%와 이산화탄소 5%의 정상 산소 배양 조건으로 전환합니다. 심장 유도 단계에서 6일에 해당하는 12일의 분화 후 3번의 중간적이고 강력한 응집체 전체 수축이 관찰되었습니다. 17일째에 세포의 74.8%가 히스토그램의 채워진 부분에서 알 수 있듯이 유세포 분석에 의해 심장 트로포닌 T에 대해 양성입니다.
또한 2차 항체만으로 염색된 세포도 표시되며, 이는 히스토그램의 채워지지 않은 부분으로 표시됩니다. 이 절차를 시도하는 동안, 심장 유도를 희생하면서 미량의 사이토카인, 특히 내배엽 분화를 촉진하는 activin-A를 제거하기 위해 4일째에 응집체를 잘 세척하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 응집체 내 유도 세포 유형의 냉각 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 이웃 배아 조직의 부분비 신호가 심장 계통으로의 인간 만능 줄기 세포 분화에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 다른 질문에 답할 수 있습니다.
개요
본 논문은 크기가 제어된 응집체를 생성하기 위해 마이크로웰을 사용하여 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)를 심근세포로 분화시키는 강력한 방법을 제시합니다. 이 방법은 기존 기술과 관련된 배양 불균질성 문제를 해결합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 줄기세포 생물학
- 심장 분화
- 조직 공학
배경
- 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)는 심근 세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있습니다.
- 기존 방법은 종종 다양한 크기와 모양의 응집체를 형성하여 분화 결과에 영향을 미칩니다.
- 마이크로웰 기술은 균일한 응집체를 생성하기 위한 해결책을 제공합니다.
- 효과적인 분화를 위해서는 심장 분화 촉진 조건이 필수적입니다.
연구 목적
- 크기가 조절된 hPSC 응집체를 생성하는 방법을 개발합니다.
- 심장 분화 결과의 일관성을 개선합니다.
- 심장 조직 공학에 관한 추가 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 응집체를 형성하기 위한 hPSC 현탁액의 원심분리.
- 응집체 크기 조절을 위한 마이크로웰 플레이트 사용.
- 심장 분화를 촉진하기 위한 저산소 조건에서의 배양.
- 분화 단계를 유도하기 위한 순차적인 배지 교체.
주요 결과
- 분화 과정 전반에 걸쳐 균일한 응집체가 형성 및 유지되었습니다.
- 분화된 세포에서 cardiac troponin T의 유의미한 발현이 관찰되었습니다.
- 유도 사이토카인의 제거 효율을 높여 심장 계보로의 분화 전향을 강화했습니다.
- 분화 12일 후에 응집체 전체의 수축이 확인되었습니다.
결론
- 마이크로웰 방법은 hPSC의 심근 분화를 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 크기가 조절된 응집체는 더욱 일관된 분화 결과를 도출합니다.
- 이 기술은 심장 발달 및 질환 모델링에 관한 추가 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
현탁 배양 기반의 심장 분화 과정에서 응집체 크기를 제어하는 것은 hPSC 유래 심근세포 생산의 핵심 병목 구간인 배양 이질성으로 인한 가변적 수율 문제를 해결합니다. 마이크로웰 기술을 통해 균일한 응집체 형성을 강제함으로써, 이 방법은 분화 결과에 대한 예측 신뢰도를 높여 확장 가능하고 재현 가능한 전임상 모델 생성을 지원합니다. 이는 초기 발굴 및 중개 연구 워크플로우에서 심장 계통 분화의 리스크를 줄이는 전략적 도구로서의 입지를 제공합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 심장 유도 과정에서 크기에 따른 신호 전달 경로의 조사를 가능하게 하여, 세포 계통 분화의 기전적 동인을 규명합니다.
- 운영적 가치: 응집체 형성의 가변성을 줄여, 실험 및 팀 간의 재현성을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: 응집체의 기하학적 구조를 제어 변수로 표준화함으로써 형태 형성 인자(morphogen) 노출에 대한 용량-반응 모델링을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 고해상도 이미지 분석 및 유세포 분석 기반의 심근세포 정량 분석에 적합한 균일한 마이크로 조직을 생성합니다.
- 확장성: 마이크로웰 플레이트 형식을 통해 여러 조건이나 유전적 배경을 병렬로 처리하여 비교 스크리닝이 가능합니다.
- 정량적 출력: 화합물 또는 유전자 섭동 연구의 기능적 판독값으로서 cardiac troponin T 양성 세포를 일관되게 측정할 수 있습니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련 시스템: 유전성 심근병증 또는 약물 유발 심독성을 모델링하기 위해 확장 가능하고 균질한 심장 응집체를 생성합니다.
- 중개적 연속성: 배치 간 일관된 세포 물질을 제공함으로써 발견 단계의 분화와 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기전적 위험 감소: 응집체 크기의 불균질성으로 인한 혼란 변수를 최소화하여 표현형-유전자형 연관성에 대한 신뢰도를 높입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 표준화된 hPSC 분화를 가능하게 함으로써 질환 모델링, 안전성 약리학 및 재생 의학 후보 물질 평가와 같은 하위 응용 단계로 이어지는 발견-전임상 연속체 과정에 부합합니다.
- 발견 생물학: 응집체의 크기와 모양을 정밀하게 제어함으로써 심장 계통 결정 과정의 생물물리학적 신호에 관한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 응집체 가변성으로 인한 노이즈를 줄여, 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 재현 가능한 미세조직 어레이를 제공합니다.
- 분석: 세포 집단의 균질성 덕분에 신호 대 잡음비가 개선되어, 정량적 유세포 분석 및 이미징 판독(예: cardiac troponin T)을 용이하게 합니다.
- 중개 연구: 수축력 및 전기생리학을 포함한 전임상 기능 분석을 위해 확장이 가능한 심근세포 공급원을 제공합니다.
- 기업 내 재사용: 마이크로웰 플레이트는 여러 프로젝트와 세포주에 걸쳐 재사용할 수 있어, 줄기세포 분화 워크플로우의 플랫폼 수준 표준화를 지원합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 응집체 크기 변동으로 인한 생물학적 노이즈를 최소화하여 분화 결과에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화되고 확장 가능한 응집체 형성을 통해 재현성과 처리량을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 비효율적인 분화로 인한 위음성을 줄임으로써 초기 심장 프로그램의 go/no-go 결정 신뢰도를 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 신뢰할 수 있는 심근세포 수율 지표를 기반으로 위험 조정된 자원 배분을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- hPSC 배양, 응집체 처리 및 저산소 배양 시스템에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 정해진 웰 크기와 저부착 표면을 갖춘 마이크로웰 플레이트의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 세척 단계에서 응집체 붕괴를 방지하기 위해 표준화된 배지 교체 프로토콜이 필수적입니다.
- 크기와 분화 효율 간의 관계가 일관되게 유지되는지 확인하기 위해 다양한 hPSC 라인에 걸친 검증이 필요합니다.
- 특수 장비(저산소 배양기, 저부착 플레이트)의 필요성과 비표적 분화를 방지하기 위한 최적화된 사이토카인 세척 단계로 인해 제한됩니다.
