Name: 간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 미세유체 기술을 이용한 세포 공학에서 나노입자 분리 정화 방법을. 관성 포커싱 효과로 고효율 처리가 가능하며 재생의학 연구에 활용됩니다.

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Mark Chong 박사의 THP-1 세포에 대한 <jove_content> 친절한 선물과 Yuejun Kang 박사와 Nishanth V. Menon 박사(난양기술대학교 화학 및 생물의학 공학부)의 미세 가공 지원에 큰 감사를 표했습니다. 이 프로젝트는 NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine(Nanyang Technological University)의 지원을 받았습니다. H.W.H.는 Lee Kong Chian School of Medicine(LKCMedicine) 박사후 연구원의 지원을 받았습니다.

중간 엽 줄기 세포와 단핵구 1. 나노 입자 (NP에) 라벨링 <ol><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)은 종래 라벨링 ≥80 %의 컨 플루 언시에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충. 마찬가지로, 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)에서 배양 THP-1 세포 (ATCC)는 1640 배지는 10 ~ 106 세포 / ml의 농도로 10 % FBS가 보충. </li><li> 로드 실리카 NP는 (~ 500 μm의) 밤새 교반 칼 세인을 사용하여 염료 용액 (200 μM)과. 앞에서 설명한 프로토콜 사용 PLGA-칼 세인의 AM (CAM)을 제작한다. (22) <ol><li> 250 μg의의 CAM과 4 ° C에서 클로로포름 100 mg의 PLGA (50:50)을 녹인다. </li><li> 실온에서 고속 균질화 (13,600 × g으로 60 초)를 사용하여 단일 에멀젼 NPS를 생성한다. (더블 disti을 (3,400 XG 5 분) 원심 분리를 이용하여 세척 수집하기 전에 화학 후드 (≥3 시간)에 클로로포름을 증발채워진 물), 동결 건조 및 저장을 -20 ° C에서. </li></ol></li><li> 20 분 - CAM-PLGA NP에 (1 mg)을 15 시간 동안 실온에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 (PLL) 용액에 칼 세인 실리카 NP는 (150 μg의)을 인큐베이션. </li><li> 5 분 3,400 XG에 원심 분리기는 각각의 배지 1 ㎖에 NP에 재 부유하기 전에 초과 PLL 상층 액을 제거합니다. </li><li> 약 24 시간 (0.1 mg을 · ml의 -1 라벨 농도)에 대한 - 세포 (총 2 × 10 6 세포 중간 엽 줄기 세포 또는 THP-1 ~ 1)로 NPS를 품어. </li><li> 해리 0.25 % 트립신 (5 분, 37 ° C) 2 ㎖를 사용하여 표지 부착 엽 줄기 세포를 수확 DMEM 6 ㎖로 급냉. 미세 가공 106 세포 / ㎖ - 105의 농도로 상기 세포 (1,000 × g으로 4 분)을 재현 탁 스핀. 직접 마이크로 유체 정제 - (10 6 세포 / ml 10 5) 표시 THP-1 세포를 사용합니다. </li></ol> 2. 미세 유체 장치 준비 <ol><li> 디바이스 제조 <ol><li> 나선 마이크로 유체 소자를 제작 (500 μm의 115 ㎛의 (H) × (w)) 표준 소프트 리소그래피 공정을 사용하는 상업적 키트 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과. 23 </li><li> 기본 예비 중합체 30 g 및 무게 보트에 철저 경화제 3g을 섞는다. 탈 가스를 60 분 동안 데시 케이 터의 혼합물을 임의의 기포를 제거한다. </li><li> 10mm - 신중 ~ (5)의 높이로 나선형 채널 디자인 패터닝 실리콘 웨이퍼 매스터 주형 상에 PDMS 액을 붓는다. </li><li> 탈 가스를 60 분 동안 데시 케이 진공에서 혼합물을 다시 공기 방울을 제거한다. 모든 거품이 제거 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> PDMS의이 설정 될 때까지 2 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 PDMS 혼합물을 경화. 웨이퍼가 일정한 장치 높이로 경화시 틸팅되지 않도록. </li><li> 메스를 사용하여 PDMS 나선형 장치를 잘라 조심스럽게 마스터 몰드에서 PDMS의 슬래브를 껍질. </li><li> TR본딩 매끄러운 표면을 보장하기 위해 메스 장치의 에지 임. </li><li> 입구에 대한 두 개의 구멍 (1.5 mm) 및 1.5 mm 생검 펀치를 사용하여 PDMS 장치의 출구에 대한 두 개의 구멍 (1.5 mm)를 펀치. </li><li> 5 분 동안 80 ℃ 오븐에서 장치 이물질을 제거하고 건조 이소프로판올 (IPA)로 장치를 세척한다. </li><li> 마스킹 테이프 사용 (채널 기능)이 PDMS 장치의 바닥면을 청소합니다. </li><li> 마스킹 테이프를 사용하여 ( &quot;3로&quot;2) 유리 슬라이드를 청소 한면. </li><li> 조심스럽게 놓고 플라즈마 클리너 챔버 내의 PDMS 장치와 슬라이드 글라스의 세정 표면을 노출 60 초 동안 진공을 가하지. 다음으로, 최대 플라즈마 전원 스위치 챔버 컬러로 핑크 될 때까지 챔버 압력을 낮 춥니 다. <ol><li> 60 초 동안 공기 플라즈마 표면을 노출. 령하게되면 플라즈마가 단단한 결합을 가능하게 PDMS와 유리의 노출 된 표면에 반응 종을 생성알 접촉. 플라즈마 전원을 끄고 장치 및 유리 슬라이드를 검색 할 수있는 플라즈마 청소기의 압력을 놓습니다. </li></ol></li><li> 단단히 플라즈마에 노출 된 표면을 가압하고 기포는 두 표면 사이에 포집되지 않도록하여 함께 PDMS 장치 및 유리 슬라이드 접합. </li><li> 본딩을 강화하기 위해 2 시간 동안 80 ℃로 설정된 핫 플레이트를 이용하여 접합 장치를 가열한다. </li></ol></li><li> 장치 작동 <ol><li> 입구 주사기 20cm 각 튜브의 일단에 주사기 팁 (23 게이지)을 부착 - ~ (15)의 튜브의 두 개 (1.52 mm의 OD)를 잘라. </li><li> 출구 10 cm이고 PDMS 장치의 상기 출구 구멍에 부착 - ~ 5의 튜브의 두 개 (1.52 mm의 OD)를 잘라. </li><li> 그 출구 관 밖으로 흘러 나올 때까지 수동 프라임, 70 % 에탄올을 함유하는 주사기를 사용하는 장치를 실행을 샘플링 이전. 장치를 소독하는 1 분 30 초 동안 에탄올 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 필터링 된 30 ml의로드(0.2 ㎛의 세공) 시스 완충액 60 ml의 시린지에 (0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 인산 완충 용액 (PBS)) 및 주사기 펌프의 주사기를 고정. 올바른 설정으로 펌프 (60 ml의 볼륨 : 60,000 μL 주사기 크기)를 설정합니다. 주 : PBS에 BSA의 첨가는 세포 - 세포 결합 및 세포와 PDMS 장치 간의 비특이적 결합을 최소화하는 것이다. </li><li> 로드 3 ML의 주사기로 표지 된 세포의 3 ㎖ 별도의 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다. 올바른 설정으로 펌프 (: 3 ㎖, 볼륨 : 3,000 μL 주사기 크기)를 설정합니다. </li><li> 기포가 안정적인 흐름을 보장하기 위해 주사기에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. 부드럽게 노즐에서 액체 몇 방울을 분사하여 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 주사기로 주입 주사기 팁과 튜브를 연결하고 장치 (외장 및 샘플 입구)의 각각의 입구에 삽입. 튜브를 따라 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 반전에 장치를 장착셀 정렬 과정에서 실시간 이미징을위한 에드 위상차 현미경. </li><li> 접착제를 사용하여 현미경 무대 장치에 가까운 작은 폐기물 비커와 두 개의 15 ml의 튜브를 고정합니다. </li><li> 폐기물 비커에 출구 호스를 놓습니다. </li><li> 1:10 시스 버퍼 샘플의 유동 비율을 설정하고, 선별 과정이 시작 두 시린지 펌프를 시동 (예 : 120 μL / 분 샘플 주사기 1200 μL위한 / 분 쉬스 주사기, 채널 유속 ~ 0.38 m / 초 ). </li><li> 유량이 안정화 1.5 분간 실행 장치. 이것은 고속 카메라를 사용하여 위상차와 시야 아래 채널 내벽 근처 관성 포커싱 세포의 존재에 의해 확인 될 수있다 (~ 5000 - 초당 10,000 프레임 (fps), 노광 시간 : 10 내지 50 마이크로 초). </li><li> 셀 콘센트 및 폐기물 콘센트에서 용리액를 수집하기 위해 다른 튜브로 배출 호스를 놓습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+technology+for+tracking+cells%27+status+%26+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Ther%22%5BJournal%5D)">Aptamer technology for tracking cells' status & function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).</li>
<li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosensors+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li>
<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li>
<li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles%3A+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li>
<li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicity%3A+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li>
<li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1%2FTh2+immunity+and+strain+background%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li>
<li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li>
<li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+metamaterials%3A+Microfabricated+arrays+to+steer%2C+refract%2C+and+focus+streams+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li>
<li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng.+Med.+Biol.+Mag%22%5BJournal%5D)">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li>
<li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengin%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li>
<li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826(2013).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+of+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259(2013).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li>
<li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference-free+Micro%2Fnanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li>
<li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 기술 된 셀 DFF 정화 기술은 높은 처리량의 방식으로 표지 된 세포의 신속한 연속 분리 할 수​​있다. 이 분리 방법은 많은 샘플 량 또는 높은 세포 농도 시료 처리에 적합하고, 장시간 사용 후에 막히는 경향이 종래의 막 여과 계보다 낫다. 마찬가지로, 선호도 기반의 자기 분리가 힘들고 비용이 추가 셀 라벨 단계가 필요합니다. 정제 된 세포 (채널 내에 때문에 짧은 체류 시간에 자신의 레이블 에이전트와 잘 세포 형태 최소 유량 / 전단 유발 효과 (그림 3) (전단 응력 τ ~ 200-250 다인 / ㎝ 2)를 유지하기 위해 표시됩니다 &lt; 1 초) 20, 24. 또한, 사용자는 단순히 원하는 미디어 또는 완충액 시스 완충액 (식염수)를 대입하여 정렬 표지 된 세포의 용출 용액을 선택할 수있다. 그것은이 중요하다나쁜 세포 초점을 맞추고 행동에 영향을 미칠 수있는 마이크로 이전에 사용에는 먼지 나...

에이전트로드 마이크로 / 나노 입자 NPS ()에 의해 세포를 엔지니어링하는 bioimaging 기능을 강화하고 재생 의학에 네이티브 치료 특성을 보충 / 보강하는 간단한, 게놈 통합이없는, 그리고 다양한 방법입니다. 1-3 세포 변형이 라벨에 의해 달성된다 에이전트로드 NP에 과량의 농도와 세포막이나 세포질은 결합 부위를 포화합니다. 그러나,이 방법의 주요 단점은 변형이 포함 된 NP에 상당한 잠재적으로 입자 조작 된 세포의 정확한 식별을 혼동 또는 치료 결과를 복잡하게. 4,5 또한 수 셀 라벨 처리 후 용액에 남아있는 언 바운드 입자의 양, 노출입니다 과도하게 높은 농도의 제 (성장 인자, 스테로이드 등) 비 표적 세포에 대한 의도하지 않은 결과를 유발할 수 잘못 전달 독성 및 노출을 야기 할 수있다. O를 포함하더라도 입자 캐리어f를 &quot;생체 적합성&quot;재료 [예를 들어, 폴리 (유산 공동 글리콜 산), PLGA]는 강력한 면역 세포의 특정 조건에서 반응뿐만 아니라 선동 할 수 있습니다. (6)이 손상된 면역 (예를 들어, 류마티스 관절염) 잠재적으로 지연을 가진 개인에서 특히 위험하다 전신 나노 틈새. (7) 따라서, 종래의 입자 공학 세포 도입 자유 입자의 효율적인 제거는 독성 프로파일을 최소화하고 생체 내에서 에이전트로드 입자 잘못 전달 노출을 줄이기 위해 매우 중요하다. 종래 구배 원심 분리는 종종 자유 입자로부터 설계된 세포를 분리하는 데 사용하지만 수고하고 배치 모드에서 작동된다. 또한, 고속 원심 동안 세포와 세포의 무결성 및 / 또는 영향 셀의 동작을 손상시킬 수있는 밀도 구배 매질의 성분에 의해 경험되는 전단 응력. 8은 미세 유체 SEV 매력적인 대안결정 론적 측면 변위 (DLD) 9, 10, 11을 dieletrophoresis 작은 입자의 분리 및 버퍼 교환 응용 프로그램 개발 (12) acoustophoresis 포함 대한 일반적인 분리 기술. 그러나 이러한 방법은 낮은 처리량 고통 (1-10 μL · 분 - 1) 문제를 막힘하는 경향이 있습니다. 이러한 유전 기반의 방법으로 활성 분리는 또한 고유의 유전 세포 표현형 또는 분리를 달성하기 위해 추가 셀 라벨 단계의 차이를 필요로한다. 에서 입자 또는 세포의 측면 이동을 때문에 높은 유동 조건과 우수한 크기의 해상도로 인해 높은 레이놀즈 수 (재) 13에서 지배적 인 리프트 힘 (F의 L)에 별개의 위치에 초점을 간소화 - 더 유망한 접근 방식은 관성 미세 유체를 포함한다. , 그것은 종종 크기 기반의 세포 분리 14, 15 및 버퍼 교환 애플리케이션에 이용되고있다. 16 ~ 18 Howeve분리 된 세포는 일반적으로 원본과 새로운 버퍼 용액과의 경계 부근에 남아있는 (R), 버퍼 교환 성능은 ~10-30 % 오염물 용액 여전히 좋지. 16-18 더 중요한 표적 세포의 크기 분포를 달성하기 위해 유사하게 보유 특히 중간 엽 줄기 세포와 같은 이종 크기의 세포 유형 (MSCS)의 처리에 문제를 제기 원래 완충 용액에서 정확한 초점을 맞추고 관성 및 분리. (19) 우리는 이전에 새로운 관성 미세 유체 세포 분류 기법은 2 유입구,이 출구 나선형 마이크로 채널 장치를 사용하여 순환 성 종양 세포 (CTCS) 전혈 20 세균 21 단리 딘 흐름 분획 (DFF)을 지칭 개발 하였다. 이 비디오 프로토콜에서는 라벨 THP-1 (인간 급성 단핵구 백혈병 세포주) 현탁 단핵 세포 (~ 15 μm의) 및 칼 세인 -1-와 중간 엽 줄기 세포 (10 ~ 30 μm의) 프로세스를 설명한다oaded NP에 표시된 세포와 결합되지 않은 NP에 제거의 효율적인 복구를위한 DFF 나선형 마이크로 디바이스의 제조 및 작동 하였다. (22)이 한 단계 정화 전략 레이블 서스펜션과 원심 분리하지 않고 신선한 완충 용액에 현탁 부착 세포의 연속 재생을 할 수 있습니다. 또한, 천만 세포 · 용액 -1, 셀 밀도 재생 의학의 응용에 대한 의무까지 처리 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>세포주 & 매체</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>중간엽 줄기세포(MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocyte cells (THP-1)</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td><td>Lonza</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Reagents & 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01% 폴리-L-라이신(PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3ml 주사기</td><td>BD</td><td>302113</td><td>주사기 3ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>60ml 주사기</td><td>BD</td><td>309653</td><td>주사기 60ml Luer-Lock</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Calcein, AM (CAM)</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Chemical</td><td>#P/7507/17</td><td>HPLC 등급 2.5L</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516Q/12</td><td></td></tr><tr><td>일반 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-550D</td><td>75 x 25 x 1mm3</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>3M</td><td>21200702044</td><td>18 mm x 25 m</td></tr><tr><td>실리카 NPs (&sim; 200 &뮤; m)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>748161</td><td>기공 크기 4 nm</td></tr><tr><td>주사기 팁</td><td>JEC 기술</td><td>7018302</td><td>23 G 0.013 x 0.25</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25 %)</td><td>생명 기술</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Spectra-Teknik</td><td>06419-01</td><td>0.02 x 0.06 " 100</td></tr><tr><td>폴리 (D, L- 락타이드 - 코 글리콜 라이드) (PLGA; 50 : 50)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>P2191</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Harris Uni-Core</td><td>69036-15</td><td>1.50 mm</td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Scienceware</td><td>111/4 IN OD</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>팬텀&nbsp;</td><td>V9.1</td><td></td></tr><tr><td>반전 위상차 현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>이클립스 Ti</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>해릭 플라즈마</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx</td><td>CX Fusion 200</td><td></td></tr></tbody></table>

간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

활성 성분 로딩 마이크로 / 나노 입자 공학 세포 (NPS는) 고유 치료 특성을 향상 바이오 이미징 활성화 및 세포 표현형을 제어하기 점점 더 많이 사용되는 방법이되고있다. 중요한 아직 부적절하게 해결 문제는 쉽게 기존의 원심 분리로 제거 할 수없는 셀 라벨 후 언 바운드 남아있는 입자의 상당수입니다. 이 생체 촬상 배경 잡음의 증가를 초래하고 인접 비 표적 세포 상 변화시키는 효과를 부여 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 효율적으로 높은 처리량 방식으로 무료 NP에에서 표지 세포를 분리 딘 흐름 분획 (DFF) 되나 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략을 제시한다. 결합되지 않은 형광 염료 또는 염료 로딩 된 NP (SIL의&gt; 95 % 고갈을 달성하면서 개발 된 나선형 마이크​​로 디바이스는, 새로운 완충액에 현탁 정제 세포 (THP-1 및 중간 엽 줄기 세포)의 연속 컬렉션 (&gt; 90 %의 세포 복구)을 용이ICA 또는 PLGA). 이 단일 단계 크기 기반 셀 정제 전략은 높은 셀 처리량 (106 세포 / 분)을 가능하게하며, 무 간섭 임상 적용을 달성하기 위해, 마이크로 / 나노 공학 세포의 대용량 전지의 정제에 매우 유용하다.

밤새 바이오 영상 화제 장착 된 NP와 세포를 라벨링 한 후, 표지 된 세포 (유리 입자를 포함) 수확 단일 단계 공정 (도 1a)에 자유 NPS를 제거 DFF 나선형 마이크로 디바이스에 의해 정제 하였다. 2 입구, 2 콘센트에 나선 마이크로은 SU-8 포토 레지스트를 사용하여 엔지니어링 소프트웨어에 의해 설계 및 마이크로 제조된다. 패턴 화 된 실리콘 웨이퍼를 다음 소프트 리소그래피 기술 (도 1b)를 이용하여 PDMS 복제 성형 용 주형으로 사용한다. 내벽 입구는 세포 샘플의 흐름을 끼지 높은 유량 (1시 10분) 신선한 완충액을 실행하면서 세포의 선별을 수행하기 위해, 세포 샘플을 나선형 마이크​​로 디바이스의 외벽 유입구로 펌핑된다. 분리 관성이 내벽과 외벽 (도 2A)를 향해 작은 비 결합 된 NP 딘 유도 재순환에 큰 표지화 된 세포의 초점을 맞춤으로써 달성된다. 이...

이 프로토콜은 언 바운드 입자의 효율적인 고갈과 마이크로 / 나노 입자 설계 세포를 정화하는 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략의 사용을 설명합니다.

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

이 절차의 전반적인 목적은 나노입자를 이용한 세포 공학 이후, 세포로부터 유리 나노입자를 분리하기 위한 편리하고 효율적이며 고처리량인 미세유체 정제 기술을 시연하는 것입니다. 이 기술의 주요 목적은 세포 작업 절차 후 결합되지 않은 나노입자를 빠르고 효율적으로 제거하는 것입니다. 우리는 모든 분리 과정을 수집합니다. 이 미세유체 세포 정제 기술은 나선형 미세 장치 내에서 세포와 나노입자의 서로 다른 관성 집중 효과를 이용하여 효율적인 크기 기반 분리를 달성합니다.이 장치는 10 million cells/mL 농도까지 처리할 수 있어 재생 의학뿐만 아니라 대용량 세포 처리에도 매우 유용합니다. 이 기술은 이미징 목적이나 기능 제어를 위해 나노입자를 사용하여 세포를 라벨링하는 세포 공학 분야에서 매우 수요가 높습니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 연구 보조원인 Hui Min Tay와 Xi 교수님 연구실의 박사후 연구원인 David Yeo 박사가 진행하겠습니다.나노입자로 세포를 표지하기 전, 6-웰 플레이트에서 중간엽 줄기세포를 80% 이상의 합류도로 배양하십시오. 마찬가지로 THP-1 세포를 ml당 100만 개의 세포 밀도로 배양하십시오. 다음으로, 1mg의 실리카 나노입자를 200µM 칼슘 염료 용액 1ml에 용해하십시오.그리고 입자들을 하룻밤 동안 교반합니다. 또한, 여기에 표시된 참고 문헌에 설명된 방법에 따라 PLGA calcium AM 나노입자를 제조합니다. PLGA calcium AM 나노입자 1 mg 또는 calcium silica 나노입자 150 µg을 0.1% poly-l-lysine 수용액에 넣고, 피펫팅으로 1분 동안 위아래로 섞어줍니다.그 후 실온에서 15~20분 동안 배양합니다. 다음으로 나노입자를 원심분리합니다. 과량의 poly-l-lysine 상층액을 제거하고, 라벨링할 세포 유형에 적합한 배양 배지 1 mL에 나노입자를 다시 현탁합니다.배양 중인 세포 100만 개당 1 mL의 배지에 표지된 나노입자 1 mg을 첨가합니다. 세포, 나노입자 및 배지 혼합물을 1분 동안 충분히 피펫팅합니다. 그 후, 혼합물을 약 24시간 동안 배양합니다.라벨링이 완료되면 줄기세포를 해리 및 수확하고, 마이크로플루이딕 처리를 위해 1mL당 100,000에서 1,000,000 cells 사이의 농도로 재현탁합니다. 동일한 농도의 라벨링된 THP-1 세포를 사용하십시오. 마이크로플루이딕 나선형 장치를 제작하려면, 먼저 표준 미세 가공 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼 마스터 몰드를 준비합니다.그 다음, 칭량 보트에서 30 g의 기본 PDMS 프리폴리머와 3 g의 경화제를 충분히 혼합합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 혼합물을 진공 상태에서 60분 동안 탈기합니다. 나선형 채널 디자인이 패턴된 마스터 몰드 위에 PDMS 혼합물을 5~10 mm 높이로 조심스럽게 붓습니다.그런 다음 혼합물을 60분 동안 탈기하여 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로 웨이퍼를 오븐에 넣으며, 소자 높이를 일정하게 유지하기 위해 경화 과정 동안 웨이퍼가 기울어지지 않도록 합니다.PDMS를 80°C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 냉각 후, 메스로 PDMS 나선형 장치를 잘라내고 마스터 몰드에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어냅니다. 그다음, 메스를 사용하여 장치의 가장자리를 다듬어 본딩을 위한 표면을 매끄럽게 만듭니다.다음으로, 1.5 millimeter 생검 펀치를 사용하여 유입구용 구멍 두 개와 유출구용 구멍 두 개를 만듭니다. 이소프로판올로 장치를 세척하여 이물질을 제거합니다. 그리고 80 °C 오븐에서 5분 동안 장치를 건조시킵니다.그다음, 마스킹 테이프를 사용하여 PDMS 장치의 바닥면과 유리 슬라이드의 한쪽 면을 깨끗하게 청소합니다. 깨끗한 표면이 드러나도록 유리 슬라이드와 PDMS 장치를 플라스마 챔버 안에 조심스럽게 넣습니다. 플라스마 전원을 최대로 켜고, 챔버 내부가 분홍색으로 변할 때까지 챔버 압력을 낮춘 후, 구성 요소들을 60초 동안 노출시킵니다.그런 다음, 챔버에서 슬라이드와 PDMS 장치를 꺼냅니다. 그리고 플라즈마에 노출된 표면을 서로 단단히 눌러 결합합니다. 두 표면 사이에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오.결합력을 강화하기 위해 본딩된 장치를 80 °C로 설정된 핫플레이트에서 2시간 동안 가열합니다. 입구용으로 15~20 cm 길이의 튜브 두 개를 자르고, 각 튜브의 한쪽 끝에 23 gauge 바늘을 부착합니다. 그런 다음 출구용으로 동일한 튜브를 5~10 cm 길이로 두 개 잘라 장치의 출구 구멍에 부착합니다.샘플을 가동하기 전, 70% ethanol이 담긴 주사기를 사용하여 배출 튜브에서 액체가 흐를 때까지 장치를 수동으로 프라이밍하십시오. 장치를 멸균하기 위해 ethanol을 장치 내에 최소 30초 동안 유지하십시오. 그런 다음, 1% BSA가 포함된 여과된 PBS 30 milliliters를 60 milliliter 주사기에 넣으십시오.또한, 라벨이 지정된 세포 3 mL를 3 mL 시린지에 넣고 두 시린지 모두에 기포가 없는지 확인하십시오. 노즐 밖으로 액체를 몇 방울 조심스럽게 배출하여 기포를 제거하십시오. 입구 시린지 팁과 튜브를 시린지에 연결하고 시린지를 시린지 펌프에 고정하십시오.튜브를 장치의 각각의 입구에 삽입하고, 튜브를 따라 기포가 없는지 확인합니다. 유체 시스템 설정이 완료되면, 세포 분류 과정 중 실시간 이미징을 위해 장치를 도립 위상차 현미경에 장착합니다. 현미경 스테이지 위의 장치 근처에 작은 폐액 비커 하나와 15 milliliter 튜브 두 개를 고정합니다.장치의 두 배출구에서 나오는 배출 튜브를 폐액 비커에 넣습니다. 이제 샘플 시린지의 유량을 120 µL/min으로, 시스 시린지의 유량을 1,200 µL/min으로 설정하여 샘플 대 시스 완충액의 유량 비율을 1:10으로 맞춥니다. 유량이 안정화될 수 있도록 장치를 1.5분 동안 작동시킵니다.고속 카메라를 사용하여 명시야 위상차 현미경 하에서 채널 내벽 근처에 관성적으로 집중된 세포의 존재를 확인하십시오. 정상 상태의 흐름이 달성되고 장치가 올바르게 작동하면, 세포 배출구와 폐기물 배출구에서 각각 별도의 용출액을 수집할 수 있도록 배출 튜브를 서로 다른 바이알에 배치하십시오. 이 장치는 표지된 THP-1 단핵구 세포 현탁액을 형광 실리카 나노입자로부터 정확하게 분류할 수 있습니다.고속 이미징과 유세포 분석 모두를 통해 확인한 결과, 높은 분리 효율을 얻었습니다. 단일 단계 정제 전략을 통해 원심 분리 과정 없이도 신선한 완충액 용액에 현탁된 표지된 부유 세포 및 부착 세포를 지속적으로 회수할 수 있습니다. 이 장치는 실리카 및 PLGA 나노입자 모두에서 고효율 분리가 가능하며, 밀리리터당 최대 1,000만 개의 세포를 동일하게 높은 효율로 분리할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 나노입자를 이용하여 세포를 표지하는 방법과 당사의 특수 미세유체 장치를 사용하여 결합되지 않은 과잉 입자를 제거함으로써 표지된 세포를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Dielectrophoresis (DEP)는 세포를 조작하는 효과적인 방법입니다. 인쇄 회로 기판 (PCB)은 microfluidic 장치 이내에 연락이없는 세포 조작을위한, 재사용 가능한 저렴하고 효과적인 전극을 제공할 수 있습니다. PCBs에 coverslips와 PDMS 기반 microfluidic 채널을 결합하여, 우리는 다채널 microfluidic 장치 내에서 구슬과 세포 조작과 분리를 보여줍니다.

멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

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