간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

이 절차의 전반적인 목적은 나노입자를 이용한 세포 공학 이후, 세포로부터 유리 나노입자를 분리하기 위한 편리하고 효율적이며 고처리량인 미세유체 정제 기술을 시연하는 것입니다. 이 기술의 주요 목적은 세포 작업 절차 후 결합되지 않은 나노입자를 빠르고 효율적으로 제거하는 것입니다. 우리는 모든 분리 과정을 수집합니다. 이 미세유체 세포 정제 기술은 나선형 미세 장치 내에서 세포와 나노입자의 서로 다른 관성 집중 효과를 이용하여 효율적인 크기 기반 분리를 달성합니다.

이 장치는 10 million cells/mL 농도까지 처리할 수 있어 재생 의학뿐만 아니라 대용량 세포 처리에도 매우 유용합니다. 이 기술은 이미징 목적이나 기능 제어를 위해 나노입자를 사용하여 세포를 라벨링하는 세포 공학 분야에서 매우 수요가 높습니다. 실험 절차 시연은 저희 연구실의 연구 보조원인 Hui Min Tay와 Xi 교수님 연구실의 박사후 연구원인 David Yeo 박사가 진행하겠습니다.

나노입자로 세포를 표지하기 전, 6-웰 플레이트에서 중간엽 줄기세포를 80% 이상의 합류도로 배양하십시오. 마찬가지로 THP-1 세포를 ml당 100만 개의 세포 밀도로 배양하십시오. 다음으로, 1mg의 실리카 나노입자를 200µM 칼슘 염료 용액 1ml에 용해하십시오.

그리고 입자들을 하룻밤 동안 교반합니다. 또한, 여기에 표시된 참고 문헌에 설명된 방법에 따라 PLGA calcium AM 나노입자를 제조합니다. PLGA calcium AM 나노입자 1 mg 또는 calcium silica 나노입자 150 µg을 0.1% poly-l-lysine 수용액에 넣고, 피펫팅으로 1분 동안 위아래로 섞어줍니다.

그 후 실온에서 15~20분 동안 배양합니다. 다음으로 나노입자를 원심분리합니다. 과량의 poly-l-lysine 상층액을 제거하고, 라벨링할 세포 유형에 적합한 배양 배지 1 mL에 나노입자를 다시 현탁합니다.

배양 중인 세포 100만 개당 1 mL의 배지에 표지된 나노입자 1 mg을 첨가합니다. 세포, 나노입자 및 배지 혼합물을 1분 동안 충분히 피펫팅합니다. 그 후, 혼합물을 약 24시간 동안 배양합니다.

라벨링이 완료되면 줄기세포를 해리 및 수확하고, 마이크로플루이딕 처리를 위해 1mL당 100,000에서 1,000,000 cells 사이의 농도로 재현탁합니다. 동일한 농도의 라벨링된 THP-1 세포를 사용하십시오. 마이크로플루이딕 나선형 장치를 제작하려면, 먼저 표준 미세 가공 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼 마스터 몰드를 준비합니다.

그 다음, 칭량 보트에서 30 g의 기본 PDMS 프리폴리머와 3 g의 경화제를 충분히 혼합합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 혼합물을 진공 상태에서 60분 동안 탈기합니다. 나선형 채널 디자인이 패턴된 마스터 몰드 위에 PDMS 혼합물을 5~10 mm 높이로 조심스럽게 붓습니다.

그런 다음 혼합물을 60분 동안 탈기하여 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로 웨이퍼를 오븐에 넣으며, 소자 높이를 일정하게 유지하기 위해 경화 과정 동안 웨이퍼가 기울어지지 않도록 합니다.

PDMS를 80°C에서 2시간 동안 경화시킵니다. 냉각 후, 메스로 PDMS 나선형 장치를 잘라내고 마스터 몰드에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어냅니다. 그다음, 메스를 사용하여 장치의 가장자리를 다듬어 본딩을 위한 표면을 매끄럽게 만듭니다.

다음으로, 1.5 millimeter 생검 펀치를 사용하여 유입구용 구멍 두 개와 유출구용 구멍 두 개를 만듭니다. 이소프로판올로 장치를 세척하여 이물질을 제거합니다. 그리고 80 °C 오븐에서 5분 동안 장치를 건조시킵니다.

그다음, 마스킹 테이프를 사용하여 PDMS 장치의 바닥면과 유리 슬라이드의 한쪽 면을 깨끗하게 청소합니다. 깨끗한 표면이 드러나도록 유리 슬라이드와 PDMS 장치를 플라스마 챔버 안에 조심스럽게 넣습니다. 플라스마 전원을 최대로 켜고, 챔버 내부가 분홍색으로 변할 때까지 챔버 압력을 낮춘 후, 구성 요소들을 60초 동안 노출시킵니다.

그런 다음, 챔버에서 슬라이드와 PDMS 장치를 꺼냅니다. 그리고 플라즈마에 노출된 표면을 서로 단단히 눌러 결합합니다. 두 표면 사이에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오.

결합력을 강화하기 위해 본딩된 장치를 80 °C로 설정된 핫플레이트에서 2시간 동안 가열합니다. 입구용으로 15~20 cm 길이의 튜브 두 개를 자르고, 각 튜브의 한쪽 끝에 23 gauge 바늘을 부착합니다. 그런 다음 출구용으로 동일한 튜브를 5~10 cm 길이로 두 개 잘라 장치의 출구 구멍에 부착합니다.

샘플을 가동하기 전, 70% ethanol이 담긴 주사기를 사용하여 배출 튜브에서 액체가 흐를 때까지 장치를 수동으로 프라이밍하십시오. 장치를 멸균하기 위해 ethanol을 장치 내에 최소 30초 동안 유지하십시오. 그런 다음, 1% BSA가 포함된 여과된 PBS 30 milliliters를 60 milliliter 주사기에 넣으십시오.

또한, 라벨이 지정된 세포 3 mL를 3 mL 시린지에 넣고 두 시린지 모두에 기포가 없는지 확인하십시오. 노즐 밖으로 액체를 몇 방울 조심스럽게 배출하여 기포를 제거하십시오. 입구 시린지 팁과 튜브를 시린지에 연결하고 시린지를 시린지 펌프에 고정하십시오.

튜브를 장치의 각각의 입구에 삽입하고, 튜브를 따라 기포가 없는지 확인합니다. 유체 시스템 설정이 완료되면, 세포 분류 과정 중 실시간 이미징을 위해 장치를 도립 위상차 현미경에 장착합니다. 현미경 스테이지 위의 장치 근처에 작은 폐액 비커 하나와 15 milliliter 튜브 두 개를 고정합니다.

장치의 두 배출구에서 나오는 배출 튜브를 폐액 비커에 넣습니다. 이제 샘플 시린지의 유량을 120 µL/min으로, 시스 시린지의 유량을 1,200 µL/min으로 설정하여 샘플 대 시스 완충액의 유량 비율을 1:10으로 맞춥니다. 유량이 안정화될 수 있도록 장치를 1.5분 동안 작동시킵니다.

고속 카메라를 사용하여 명시야 위상차 현미경 하에서 채널 내벽 근처에 관성적으로 집중된 세포의 존재를 확인하십시오. 정상 상태의 흐름이 달성되고 장치가 올바르게 작동하면, 세포 배출구와 폐기물 배출구에서 각각 별도의 용출액을 수집할 수 있도록 배출 튜브를 서로 다른 바이알에 배치하십시오. 이 장치는 표지된 THP-1 단핵구 세포 현탁액을 형광 실리카 나노입자로부터 정확하게 분류할 수 있습니다.

고속 이미징과 유세포 분석 모두를 통해 확인한 결과, 높은 분리 효율을 얻었습니다. 단일 단계 정제 전략을 통해 원심 분리 과정 없이도 신선한 완충액 용액에 현탁된 표지된 부유 세포 및 부착 세포를 지속적으로 회수할 수 있습니다. 이 장치는 실리카 및 PLGA 나노입자 모두에서 고효율 분리가 가능하며, 밀리리터당 최대 1,000만 개의 세포를 동일하게 높은 효율로 분리할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 나노입자를 이용하여 세포를 표지하는 방법과 당사의 특수 미세유체 장치를 사용하여 결합되지 않은 과잉 입자를 제거함으로써 표지된 세포를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.