간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

이 절차의 전반적인 목표는 나노 입자를 사용한 세포 엔지니어링에 따라 세포에서 유리 나노 입자를 분리하기 위해 편리하고 효율적이며 처리량이 많은 미세 유체 정제 기술을 입증하는 것입니다. 이 기술의 주요 원하는것은 결합되지 않은 나노 입자를 빠르고 효율적으로 제거 할 수 있도록하는 것입니다 세포 노동 절차 후, 우리는 모든 ses-fa-tion을 수집합니다. 이 미세유체 세포 정제 기술은 나선형 마이크로 장치에서 세포와 나노 입자의 차등 관성 초점 효과로 인해 효율적인 크기 기반 분리를 달성합니다.

mil 농도당 최대 1,000만 개의 세포를 처리할 수 있어 재생 의학 및 래치 부피 세포 처리에 매우 유용합니다. 이 기술은 이미징 목적 또는 기능 제어를 위해 나노 입자를 사용하여 세포를 노동하는 세포 공학 분야에서 높은 선호도를 가지고 있습니다. 제 연구실의 연구 조교인 후이 민 테이(Hui Min Tay)와 시진핑 교수 연구실의 박사후 연구원인 데이비드 여(David Yeo) 박사가 시연을 할 예정입니다.

중간엽 줄기세포를 6웰 플레이트에서 80% 이상의 포화도로 배양한 후 세포를 나노 입자로 라벨링합니다. 마찬가지로 THP-1 세포를 밀리리터당 100만 개의 세포 밀도로 배양합니다. 다음으로, 1 밀리그램의 실리카 나노 입자를 1 밀리리터의 200 마이크로 몰 칼슘 염료 용액에 용해시킵니다.

그리고 입자를 밤새 저어줍니다. 또한 여기에 표시된 참고 문헌에 설명된 방법을 사용하여 PLGA 칼슘 AM 나노 입자를 제조합니다. PLGA 칼슘 AM 나노 입자 1 밀리그램 또는 칼슘 실리카 나노 입자 150 마이크로 그램을 01 % 폴리 -l- 라이신 용액에 1 분 동안 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

그런 다음 실온에서 15-20분 동안 배양합니다. 다음으로 나노 입자를 원심 분리합니다. 과량의 폴리-l-라이신 상층액을 제거하고 라벨링할 세포 유형에 적합한 배양 배지 1ml에 나노 입자를 다시 현탁시킵니다.

배양 중인 세포 100만 개당 1밀리리터의 배지에 라벨이 부착된 나노 입자 1mg을 첨가합니다. 세포, 나노 입자 및 배지의 혼합물을 1분 동안 철저히 피펫팅합니다. 그런 다음 혼합물을 약 24 시간 동안 배양합니다.

한 번 레테르를 붙이고, 줄기 세포를 해리하고 가을걷고, microfluidic 가공을 위한 100, 000 및 1, 000의 밀리리터 당 000의 세포 사이 농도에 그(것)들을 다시 현탁시키십시오. 동일한 농도로 표지된 THP-1 세포를 사용하십시오. 미세유체 나선형 장치를 제작하려면 먼저 표준 미세 가공 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼 마스터 몰드를 준비합니다.

그런 다음 계량 보트에서 기본 PDMS 프리폴리머 30g과 경화제 3g을 철저히 혼합합니다. 기포를 제거하기 위해 진공 상태에서 60분 동안 혼합물의 가스를 제거합니다. PDMS 혼합물을 나선형 채널 디자인으로 패턴화된 마스터 몰드에 5-10mm 높이로 조심스럽게 붓습니다.

그런 다음 혼합물을 60분 동안 가스를 제거하여 기포를 제거합니다. 모든 거품이 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 웨이퍼를 오븐에 넣고 경화 중에 웨이퍼가 기울어지지 않도록 하여 일정한 장치 높이를 보장합니다.

PDMS를 섭씨 80도에서 2시간 동안 경화시킵니다. 식으면 메스를 사용하여 PDMS 나선형 장치를 잘라내고 마스터 몰드에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 메스를 사용하여 장치의 가장자리를 다듬어 접착을 위한 매끄러운 표면을 확보합니다.

그런 다음 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 입구에 두 개의 구멍을 만들고 배출구에 두 개의 구멍을 만듭니다. 이소프로판올로 장치를 세척하여 이물질을 제거하십시오. 그리고 섭씨 80도의 오븐에서 5분 동안 장치를 건조시킵니다.

그런 다음 마스킹 테이프를 사용하여 PDMS 장치의 바닥 표면과 유리 슬라이드의 한쪽 면을 청소합니다. 유리 슬라이드와 PDMS 장치를 깨끗한 표면이 노출된 플라즈마 챔버에 조심스럽게 놓습니다. 플라즈마 전력을 최대로 켜고 챔버가 분홍색으로 변할 때까지 챔버 압력을 낮추고 구성 요소를 60초 동안 노출시킵니다.

그런 다음 챔버에서 슬라이드와 PDMS 장치를 제거합니다. 그리고 플라즈마에 노출된 표면을 단단히 눌러 함께 접착합니다. 두 표면 사이에 기포가 끼지 않는지 확인합니다.

접착 장치를 섭씨 80도로 설정된 핫 플레이트에서 2시간 동안 가열하여 접착을 강화합니다. 입구를 위해 15-20cm 길이의 튜브 두 개를 자르고 각 튜브의 한쪽 끝에 23 게이지 바늘을 부착합니다. 그런 다음 배출구에 대해 길이가 5-10cm인 동일한 튜브 두 개를 자르고 장치의 배출구 구멍에 부착합니다.

샘플을 실행하기 전에 배출 튜브에서 흘러나올 때까지 70% 에탄올이 함유된 주사기로 장치를 수동으로 프라이밍합니다. 에탄올을 장치에 최소 30초 동안 방치하여 살균합니다. 그런 다음 1% BSA가 포함된 여과된 PBS 30ml를 60ml 주사기에 로드합니다.

또한 3밀리리터의 라벨링된 세포를 3밀리리터 주사기에 넣고 두 주사기에 기포가 갇히지 않았는지 확인합니다. 노즐에서 액체 몇 방울을 부드럽게 배출하여 기포를 제거합니다. 주입구 주사기 팁과 튜브를 주사기에 연결하고 주사기를 실린지 펌프에 고정합니다.

튜브를 장치의 해당 입구에 삽입하고 튜브를 따라 기포가 없는지 확인합니다. 이제 유체 공학이 설정되면 세포 분류 과정에서 실시간 이미징을 위해 장치를 반전 위상차 현미경에 장착합니다. 작은 폐기물 비커와 2개의 15밀리리터 튜브를 현미경 스테이지의 장치 가까이에 고정합니다.

장치의 두 배출구에 있는 배출 튜브를 폐기물 비커에 넣습니다. 이제 샘플 주사기의 유속을 분당 120마이크로리터로, 외피 주사기를 분당 1, 200마이크로리터로 설정하여 샘플과 피복 버퍼의 유속을 1에서 10으로 설정합니다. 1분 30초 동안 장치를 실행하여 유속이 안정화될 수 있도록 합니다.

고속 카메라를 사용하여 위상차가 있는 명시야 아래 채널 내벽 근처에 관성 초점이 맞춰진 세포의 존재를 확인합니다. 정상 상태 흐름이 달성되고 장치가 올바르게 작동하면 배출 튜브를 다른 바이알에 배치하여 셀 배출구와 폐기물 배출구에서 별도의 용리액을 수집합니다. 이 장치는 형광 실리카 나노 입자에서 THP-1 단핵 세포의 표지된 현탁액을 올바르게 분류할 수 있습니다.

고속 이미징과 유세포 분석 모두에서 확인된 바와 같이 높은 분리 효율을 얻었습니다. 단일 단계 정제 전략은 원심분리가 필요 없이 새로운 완충 용액에 부유되어 있는 표지된 현탁액 및 부착 세포의 지속적인 회수를 가능하게 합니다. 이 장치는 실리카와 PLGA 나노 입자 모두로 고효율 분리가 가능하며 동일한 고효율로 밀리리터당 최대 1,000만 개의 세포를 분리할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 나노 입자로 세포를 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그리고 우리의 전문화된 microfluidic 장치를 사용하여 과잉 unbound 입자를 제거해서 표지된 세포를 순화하는 방법.