Name: 멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 학습하세요 다이전기영동(DEP)과 층류를 이용하여 마이크로유체 장치에서 세포와 비즈를 분리하는 방법을 PCB 전극을 활용한 비접촉식 조작 기술로 연구자들이 효율적인 입자 분리를 수행할 수 있습니다.

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우리는 장비 설치에있는 그의 도움을 DEP 작동과 미첼 콜렌스에 trifurcating 채널을 제공하는 우 진 장에게 감사의 말씀을드립니다. 작품은 그랜트 우아즈 - 0951647 통해 부여 99-2911-1-002-007 통해 대만 NSC에 의해 미국 NSF에 의해 지원되었습니다.

장비 설정의 일반적인 다이어그램은 그림 1A에 표시됩니다. PCB - 샘플 어셈블리는 더욱 그림 1B에 횡단면 설계도에 상세한입니다. 1. PCB의 전극을 준비 : <ol><li> 원하는 형상으로 디자인 PCB는 전극이 아닌 균일한 전기장을 생성합니다. 사용자 정의 PCB 전극 칩은 상업 제조 시설 (그림 1C)를 통해 주문할 수 있습니다. </li><li> 각 인쇄 금속 전극 (그림 1D)의 끝 부분에 납땜 16 게이지 와이어에서 미리 조립 PCB의 전극을 준비합니다. <ol><li> 전극의 끝 부분에 철사를 놓습니다. 전선을 열 수있는 뜨거운 납땜 인두와 PCB의 금속 부분에 위치에 와이어를 잡아. </li><li> 납땜으로 전선을 채울 수있는 가열 전선에 납땜의 작은 금액을 피드. </li><li> 철사를 납땜으로 가득 후, 땜납이 냉각하는 동안 자리에 와이어를 잡고, 납땜 인두를 제거합니다. </li></ol></li><li> PCB (그림 1D) 각 전기 연결을위한 납땜 과정을 반복합니다. </li></ol> 2. Microfluidic 채널 준비 : <ol><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) 기반 microfluidic 채널은 PDMS의 탄성, 다우 코닝에서 Sylgard 184을 사용하여 준비가되어 있습니다. 채널을 정의하는 마스터 금형은 일반적으로 실리콘 웨이퍼와 SU - 8 포토 레지스트를 사용하여 표준 microfabrication 프로세스를 통해 만들어집니다. </li><li> 5 분 10시 1분 비율 경화 에이전트 기반의 화합물을 섞는다. </li><li> 조립식 SU - 8 마스터 금형에 액체 PDMS를 붓고하고 몇 분 동안 진공에 액체 PDMS를 노출하여 기포를 제거합니다. 완전히 모든 거품을 제거하기 위해 필요하면 진공 프로세스를 반복합니다. </li><li> 70 PDMS ° 2 시간 C 치료. </li><li> 웨이퍼 휴식하지 않도록주의 면도날로 웨이퍼에서 microfluidic 채널과 PDMS의 슬래브를 제거합니다. </li><li> microfluidic 장치에 유체 및 세포를 소개하는 펀치 구멍. (참고 : 주사기 펌프, 중력이나 표면 장력 기반 흐름은 모든 DEP와 함께 사용할 수 있습니다.) </li><li> 그것이 먼지와 파편의 무료 보장하기 위해 microfluidic 장치를 검사합니다. PDMS를 청소하는 것은 쉽게 3M 스카치 매직 테이프를 사용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 no.0 두께 (80-130 μm의) coverslip에 플라즈마 결합은 PDMS microfluidic 채널. 15 분 최소 100 ° C에서 coverslip - microfluidic 어셈블리를 열. </li></ol> 3. 낮은 전도성 미디어 준비 : <ol><li> 낮은 전도율 미디어는 8.5 %의 자당을 혼합하여 준비 deionized (DI) 물속에서 + 0.3 % 포도당 (W / V) 1. 참고 :. 우리는 이전에 짧은 기간 (약 30 분)에 대한 낮은 전도성에 노출된 후 세포가 기존 세포 배양 매체 일간 교양 수 보여준 11 </li></ol> 4. PCB 전극 넘습니다 Microfluidic 채널 조립 : <ol><li> PCB와 coverslip 사이의 긴밀한 접촉을 보장하기 위해 PCB에 미네랄 오일을 소량 (약 10 μL) 장소. 참고 : 전극 시각화를 감소를위한 선택적 단계는 검은 영구 마커 또는 페인트의 매우 얇은 레이어와 코트 PCB 표면을하는 것입니다. </li><li> 오일 (coverslip 아래)로 coverslip 성형 접촉 기름칠 PCB에 coverslip - microfluidic 채널 조립을 놓으십시오. 부드럽게 좋은 접촉을 위해 coverslip - microfluidic 조립을 눌러 셀 및 구슬 시각화에서 떨어지다 수있는 공기 방울을 최소화합니다. 완성된 장치의 예제는 그림 1D에 표시됩니다. </li></ol> 5. 정렬 및 DEP를 사용하는 비즈와 세포를 컨센트레이트 : <ol><li> DI 워터 또는 낮은 전도성 매체와 microfluidic 채널을 기입하고, 플라즈마 결합 과정은 일시적으로 일반적으로 소수성 PDMS의 표면이 친수성하여 microfluidic 채널로 수성 솔루션의 쉬운 로딩을 용이하게합니다. </li><li> 채널 저수지 (그림 1C)로 세포 및 / 또는 폴리스티렌 구슬을 소개합니다. 여기 우리는 인간의 결장 선암 (HT - 29) 세포를 사용합니다. </li><li> AC 전원 증폭기의 입력에 대한 함수 발생기의 출력을 연결 후, 전극 와이어로 앰프의 출력을 연결합니다. 충격 가능성 노출로부터 사용자를 보호하기 위해 전기 테이프로 설치의 모든 전기 배선과 표면을 다룹니다. 장비 설정의 구조 다이어그램은 그림 1A에 표시됩니다. </li><li> 1.0-1.5 MHz의의 사인 파의 출력을 생성하는 함수 발생기를 설정합니다. 출력의 진폭은 PCB 80 - 100V의 출력을 생성하는 RF 전력 증폭기에 대한 조정해야합니다. 이 작품의 RF 전력 증폭기는 220-330 MV 주위에 입력 전압이 필요합니다. 별도의 셀 및 구슬하려면, 층류 흐름 비율은 대상 채널 (폭 w = 100 μm의에 주요 채널 (폭 w = 100 μm의 높이 H는 = 27 μm의) 내에서 세포와 구슬을 이동하는 DEP 힘을을 준수해야합니다 높이 H는 = 27 μm의). 주의 : m을 결정하는 PCB 제조 업체에 문의하십시오aximum 운영 전압은 PCB의 과열 또는 용융과 같은 문제를 방지합니다. 안전 운영 설정을 확인하려면 함수 발생기와 전력 증폭기 제조 업체에 대한 장비 제조 업체의 사양을 확인하십시오. </li><li> 정렬 세포와 구슬로 DEP를 시작합니다. 폴리스티렌 비즈가 지정된 주파수 내에서 비​​ 균일 전기장에 부정적 - DEP 경험을 반면 세포는 긍정적인 - DEP 경험을 할 수 있습니다. 이 DEP - 강제 활성 bioactuation 및 세포 및 전극으로 저렴하고 재사용 PCBs를 사용하여 microfluidic 장치 내의 다른 입자의 분리 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : DEP는 작동 세포 또는 입자에 효과적인 경우가 아닌 균일한 전기 분야 내에서 강력한 배열은 정적 욕조 또는 느린 유체 판매율에 대한 관찰이다. 높은 유체 판매율의 조건에서, 셀 또는 입자 문제는 전기장과 유속에 대한 축방향 흐름의 상대적 방향에 따라 달라집니다. 또한, 세포 및 입자 행동도 전기장 강도와 전기 분야 내에서 비​​ 균일의 정도에 의존하고 있습니다. 세포 또는 입자의 전형적인 행동은 '진주 체인'사이클링, 끄는, 또는 회전을 포함합니다. 손상 또는 폐지 DEP가 유체, 약한 전기장 강도, 과도한 흐름 판매율도 두께 coverslips 또는 coverslip 및 PCB의 전극 사이의 전도성 솔루션에 염분이나 다른 이온 분자의 존재를 포함 조건 (예 : 금이 coverslip가 일으킬 수 ) 물, 미네랄 오일의 혼합. 여기, no.0 두께 coverslips (80-130 μm의)과 전극 간격 (231 μm의)를 사용할 때, 전기장 강도의 제곱의 그라데이션이 HT - 29 세포와 구슬에 적용되는 2 사이 될것으로 예상되는 -8 ~ 6 -8 V 2 / μm의 3 1. DEP 력은 정적 유체 (그림 2A - B)에서 DEP에 의해 조작 입자의 속도를 측정하여 예상하실 수 있습니다. microfluidic 채널의 입자와 높은 점성 환경의 작은 관성으로 인해, 유체 드래그 인력은 동일하지만, DEP 인력과 반대 방향으로. 것입니다 낮은 전도성 매체의 평균 구슬 속도는 DEP의 93 VPP의 전압 및 1.5 MHz의와 34.5 μm의 / S입니다. 유체 드래그 강제는 다음과 같은 방정식과 함께 계산하실 수 있습니다. 1 F 드래그 = 6πηRv 20 낮은 전도성 매체의 평균 점도 η ° C는 1.27 MPA • S이며 비드 반경 R은 7.5 μm의 수 있습니다. 폴리스티렌 microbead에 대한 유체 드래그 힘이 6.19 PN 것으로 추정된다. (그림 2C - F) microfluidic 채널에서 구슬을 행동시키다 수있는 능력을 입증하기 위해, 우리는 표면 장력의 중재 흐름을 채용하여 낮은 전도성 미디어의 흐름을 시작하였습니다. 각 채널 내의 평균 속도가 565 μm의 / 초 (그림 2C)로 감소했다 반면 단일 입력 채널의 평균 구슬 속도는 1540 μm의 / 초되었다. DEP를 시작으로, 구슬은 오히려 측면 채널로 출시되는 것보다 중앙 채널 내에서 유지했다. 따라서 이러한 조건에서 DEP의 세력은 두 측면 채널로 유체의 드래그 력을 극복하기에 충분했다. 동일한 원리는 간단 DEP 전극 (그림 2E - F)의로 채널과 비드 흐름의 방향을 변경하여 중앙 캐널에서 단일 사이드 채널에 비즈를 전환하는 데 사용되었다. 구슬이 trifurcation 지점을 접근으로 DEP가 시작되었다 단일 유입 채널의 측면에있는 금속 전극 앵글링으로 구슬이 채널의 측면으로 안내했다. 저기, DEP의 세력은 층류는 채널 (그림 2 층)을 그들을 추진하기 위해 지속적인 측면 채널 중 하나에 비즈를 당길 충분한했다. 셀 및 폴리스티렌 비즈가 아닌 균일한 전기 분야에서 양극과 actuated 수있는 능력에서 뚜렷한 차이를 가지고 있기 때문에, 우리는 동시에 세포와 구슬의 온 - 칩 분리를 수행할 수있는 능력을 입증하는 DEP를 사용합니다. 우리는 그림 2E - F에 구성된 동일한 microfluidic 채널 구조와 PCB의 전극을 사용하지만, 단일 입구 채널 (그림 3)에 낮은 전도성 매체 HT - 29 세포와 구슬의 중지를 발표했다. DEP가 도입되고 구슬이 오른쪽에있는 각각의 출력 채널에 보관되었다 반면에 이러한 조건 하에서, HT - 29 세포는 두 왼쪽 출력 채널에서 유지되었을 때. 그들은 왼쪽 출력 채널에 수집된 있으므로 여기 전지 특성 '진주 체인'동작을 보여줍니다. 간혹 구슬과 세포들은 세포 출력 채널에 자주 함께 수집하는 함께 첨부된다. 본 실험에서알 데이터, 우리는 713분 당 입자 (전지 및 구슬), 또는 20 분 14,260 전지 및 구슬에 해당하는 정렬 속도를 결정합니다. 세포와 구슬의 수를 검색은 분자 생물학, 이미징, 생화학 및 실험실 - 온 - 어 - 칩 응용 프로그램에 적합하고 유용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. microfluidic 채널 세포 및 입자.의 PCB 기반 DEP는 (A) DEP 기반 작용을위한 장비 설치가 전기 신호의 주파수와 진폭을 정의하는 함수 발생기로 시작, 다음 전력 증폭기가의 신호 강도를 높일 수 PCB에서 생성된 전기 분야. (B) 샘플 작용을위한 microfluidic 장치 어셈블리 irreversibly 아니요 바운드 PDMS microfluidic 채널로 구성되어 있습니다. 0 두께 coverslip (80-130 μm의) 산소 플라즈마를 통해 비 전도성 매체 세포 및 / 또는 구슬을 목욕을합니다. (C) PCB의 전극은 전극이 강한 비 균일한 전기장을 생성하는 interdigitated 두 지역으로 이루어져 여기에 사용됩니다. (D) 완료 장치 : 단일 coverslip에 trifurcated microfluidic 장치와 PCB가 삽입된 페이지는 전극 와이어로 전체 장치를 보여줍니다. (CD) 규모, PCB 측정 8.4 cm (L), 2.1 cm (W)는 5mm 단위 전극과 함께하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 전과 DEP 작동하는 동안 채널 세포와 구슬의 대표적인 이미지. 층류없이 PDMS microfluidic 채널 (시간은 1.23 초 타락한) 내에서 낮은 전도도 미디어 솔루션 (A) 15 μm의 형광 폴리스티렌 비즈. (B) DEP 개시되면, 구슬은 PCB의 전극 패턴 (블랙 스트 라이프) 방면보다는 전극 (시간은 8.18 초 타락한) 사이에 마이 그 레이션. (C) 층류에서 동일한 채널 비즈는 세 개의 별도 채널 (시간이 5.3 초 타락한) 사이에 나누어집니다; DEP가 시작되면 (D), 비즈는 (시간이 타락한, 4.3 중앙 채널에서만 흐름 actuated 아르 초). (E) PCB의 전극에 채널의 방향을 변경하면 구슬이 differentially (D)와 같이 DEP보다는 중앙 채널을 사용하여 사이드 채널 (F)로 이동하실 수 있습니다. (EF) 타락한 시간은 각각 8.23​​ 초 및 5.16 초입니다. 모든 스케일 바 = 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 이전 DEP, 인간의 결장 선암의 혼합 용액 (HT - 29) 3 별도의 출력 채널을 하나의 채널에서 세포 및 비즈 흐름을 시작하기 전에 DEP 작동하는 동안. 채널 (AB)의 세포와 구슬 대표 이미지. 오픈 화살표는 층류 및 채널의 방향은 오리 엔테이션과 자세한 내용을 점선 라인 설명되어 있습니다 식별합니다. 식별로 (CD) 유도 DEP함으로써, 구슬과 세포가 선택적으로 별도의 채널로 actuated 있습니다. 구슬은 오른쪽 채널을 종료 반면 HT - 29 세포는 중앙과 왼쪽 채널을 종료합니다. 구슬과 세포의 특성 진주 체인이 DEP 작동하는 동안 관찰됩니다. microchannels의 세포와 구슬 (A, C) 차동 간섭 대비 이미징은 비즈 쉽게 볼 수 렌더링. 같은 DIC 이미지 (A, C)의 글로우 규모 강도 이미지 (B, D)은 채널 세포의 시각화를 향상시킬 수 있습니다. 반사 금속 전극 ((A, C) 밝은 줄무늬와 (B, D) 노란색과 녹색) 효과 DEP 기반 작용을위한 전극에 microchannels를 정렬을위한 유명 랜드마크를 제공합니다. 스케일 바 = 100 μm의.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

microfluidic 장치의 세포 조작은 분류 단일 세포의 선택적 배치 또는 인구 연구 바람직합니다. 2 층류가 microfluidic 장치 내에서 세포를 조작하는 밸브 및 펌프와 함께 사용됩니다. 그러나, 혼자이 방법은 도전하고 자세한 제조 공정과 기술을 필요로 3 원심 분리는 세포 배치하지만, 동시에 이미지가 도전에 대한 요구 사항을 단순화 수 있습니다. 원하는 조작을 설계하고 효과를 고려할 때 또한, 원심 분리를위한 채널 아키텍처는 신중하게 생각해야합니다 구심 세력의. 4 레이저 핀셋이 셀 배치에 사용하지만 방법은 비용과 높은 처리량 세포 분류를위한 의무가 없습니다. 그러나 5 수, DEP는 효과적인 셀 배치, 특성화에 대해 "전기 핀셋"의 효율적인 시스템으로 입증되었습니다 및 조작. 6,7 특히, DEP는 선택 생활과 죽은 세포의 온 - 칩 처리, 7-10 및 세포 질량의 측정에 대한 공진 센서에서 수집 세포에 대한 세포를 캡처하고 정렬하는 데 사용되었습니다. 11 우리는 이전에 DEP를 증가하여 그 입증 박테리아 또는 유체 드래그 인력 위의 구슬에 힘을는 온 - 칩 농도와 폴리스티렌 구슬과 리스테리아 monocytogenes V7의 트래핑을 수행할 수 있습니다. E. 12 혼합 인구 대장균 및 L. monocytogenes 박테리아도 감독과 DEP 펄스를 통해 공개 수 있습니다. 또한, 큰 입자는 differentially 캡처와 큰 입자의 크기에 따라 전극에 집중, 작은 입자 반면 캡처 아니라 유체 흐름과 함께 제거됩니다 수 있습니다. 13 DEP의 세력이 입자의 유체 드래그 세력의를 극복하지 않으면 구슬이나 세포를 캡처, 오히려 유체 흐름 내에 이동되지 않습니다. 그림 2C와 같이, 구슬은 중앙 채널에 비즈를 유지하기 위해 충분한 유체 흐름의 중심 지역에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 전기장 내에서 입자 대 입자 영향의 결합 효과에 의한 수, DEP 드래그 세력이의 조합, 또는 다른 정의 효과보다 큰 유체 판매율. 비접촉식 DEP의 최근 진보 따라서 DEP 조작 중에 가장 큰 범위 내에서, 세포 유형을 보호, 최소 필수 항목과 세포 캡처 및 조작을 최대화하기위한 수 있습니다. 정렬, 수집하고 세포를 위치를위한 microfluidics 커뮤니티에 1,9 비접촉식 DEP 제공 약속 microfluidic 장치 이내. 우리는 microfluidic 장치, 추가로 발견과 혁신 내에서 조작을위한 증가 수요와 DEP의 구현 DEP의 세력의 이해와 영향력을 확대할 것으로 예상. PCBs 그들 상용화에 좋은 플랫폼을 만들어, 빠른 제조 처리 시간과 저렴한 가격에 대량 생산 프로세스를 통해하실 수 있습니다. 또한, PCBs는 사용하기 쉽고 온 칩 세포 조작 및 정렬을 위해 학문의 범위에서 과학자에 대해 액세스할 수 있습니다. PCB의 전극의 레이아웃을 디자인할 때, 고려는 원하는 입자 / 세포 궤도 부여해야합니다. 고려에 대한 핵심 요소는 입자의 크기와 타입 (비드 및 / 또는 셀), 세포 유형, microchannel 크기, 유속, 전극 간격 (전기장 강도를 결정하는), coverslip 두께 및 유체 전도율을 포함합니다. 이러한 요소는 입자 또는 셀, 그리고 궁극적으로 분리 효율을 조작하는 힘이 필요하고 가능한 영향을줍니다. 여기에 소개 우리 프로토콜 microsphere와 세포 분리에 대한 DEP를 시작을위한 효과적인 설정을 보여줍니다. 잠재적인 애플 리케이션의 경우, 사용자는 각 응용 프로그램의 효율성을 최적화하기 위해 세포와 구슬에 원하는 흐름 경로뿐만 아니라 전극 패턴과 microfluidic 채널 디자인의 아키텍처와 일치해야합니다. 전극 간격 및 coverslip 두께는 microfluidic 채널 레이아웃을 설계 이전에 보고된 지침에 따라 사용할 수 있습니다 1. 세포를 손상없이 유지하면서 세포 / 입자와 주변 매체의 전도율과 유전율은 긍정적이거나 부정적인 DEP를 용이하게 구별할 수있을만큼이어야합니다. 구형 입자에 대한 DEP의 극성은 DEP 전압의 주파수 ω에 다음 Clausius - Mosotti 요소의 복잡한 가치의 실제 부분에서 확인할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"> 방정식 1 이 방정식의 ε에 유전율이며, σ는 전도율이고, ε은 * 복잡한 유전율이다. subscripts P 앤드 M각각의 입자와 미디어 나타냅니다. 세포는 미디어보다 높은 유전율을 가지고, 또는 Clausius - Mosotti 요소의 실제 부분은 긍정되는 경우, 입자는 주위의 미디어보다 더 편광됩니다. 비 균일한 전기장으로 인해, 입자의 분극이 아닌 균일한되고 이것은 높은 전기장 강도와 지역 방향으로 셀을 그리는 긍정 DEP (+ DEP) 강제를 만듭니다. 세포는 주변 매체보다 낮은 유전율, 또는 Clausius - Mosotti 계수 부정되고의 실제 부분이있다면, 그것은 부정적인 DEP를 (- DEP) 받게되며, 세포는 최소한의 필드 지역에 대한 강제입니다. 세포와 미디어는 약 같은 복잡한 유전율이있다면, 포스는 세포를 조작하기 위해 생성된 수 없습니다. 이러한 이유로, 순수한 물이 DEP 입자 조작에 대한 선호하는 미디어입니다. 그러나, 순수한 물의 세포에 삼투 스트레스를 피하기 위해, 낮은 전도성 미디어는 전도율이 변경되지 않은 유지 공식화되었지만, 세포 삼투 스트레스를 감소하기 위해 osmolarity 증가합니다. 기존의 세포 배양 매체 또는 DMEM 또는 PBS와 같은 생리 버퍼는, DEP 조작에 적합하지 않습니다 높은 전도성을 보유하고 있습니다. 우리는 또한 이전에 세포가 낮은 전도성 매체를 사용하여 DEP와 센서에서 촬영한 수 증명하고있다. 세포 부착에 대한 짧은 기간 후 낮은 전도성 미디어는 일 동안 세포의 성장을 지원하기 위해 필요한 세포 배양 미디어 교체할 수 있습니다. 11 우리의 경험에서 형광 구슬 따라서 그것이 삶과 fluorescing 세포의 강도에 비드 강도를 일치하도록 도전 수있는, 살아있는 세포 형광과 관련하여 매우 밝은 있습니다. 세포와 구슬 모두의 시각화를 개선하기 위해, 우리는 이미지 모두에 대해 수직 현미경에 DIC 현미경을 사용. 세포와 구슬을 표시하기 위해, 우리는 쉽게 볼 수있는 넓은 색상 스펙트럼의 데이터를 유지 강도 글로 스케일 이미지에서 데이터를 제시했습니다. 따라서 관심의 연구를 디자인할 때, 이미지 매개 변수와 리소스를 고려해야합니다. 요약, 우리는 선택 DEP를 사용하는 별도의 채널로 구슬과 세포를 행동시키다 수있는 능력을 보여줍니다. 세포 생물학, 생화학 및 생체 공학 애플 리케이션을위한 microfluidic 채널의 증가 유틸리티, DEP는 세포 수집, 배치 및 정렬에 대한 바람직한 옵션입니다. PCB의 전극 제조가 저렴하며 편리, 전극은 사용하기 쉽고, 그리고 빠른 제조 시간은 DEP의 구현에 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 키트 (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>16 awg 훅업 와이어</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>Gold seal 커버 글라스</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>No. 0 두께, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Miltex 생검 펀치</td><td>VWR international</td><td>95039-104</td><td>Miltex, 다양한 크기</td></tr><tr><td>주문 제작 PCB 전극</td><td>Bay Area Circuits</td><td>주문 제작 부품</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>교내 DI 워터 공급 장치</td><td>없음</td><td>여과된 DI 워터 사용</td></tr><tr><td>D-Glucose 무수 과립 AR</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>자당, 결정형</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>형광 폴리머 미세구</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>15&amp;#x03BC;m Dragon green 미세구</td></tr><tr><td>HT-29 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-38D</td><td>인간 결장 선암</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600FN 정립 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Phantom V310 고속 촬영 카메라</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>BX51 정립 연구 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>SpotFlex 고해상도 컬러 카메라</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td>Agilent Technologies</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>RF 전력 증폭기</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티 채널 microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 dielectrophoresis와 층류를 사용하여

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic 장치는 세포를 분류하고 집계, 조작, 공부에 대한 세포의 규모에 역동적인 유체 환경을 제공하여 세포 연구를 고급 있습니다. 그러나, 유체 도메인 내의 세포를 조작하는 것은 도전 남아 성형 밸브 및 전극에 대한 복잡한 제조 프로토콜을 필요로하거나, 광학 핀셋과 같은 전문 장비를 요구하고 있습니다. 여기서 우리는 기존의 인쇄 회로 기판 (PCB)이 bioactuation에 대한 층류 입력란에 구슬과 세포 조작을위한 dielectrophoresis (DEP)를 채용하여 세포의 비 접촉 조작에 사용될 수있는 입증하고, 다채널 microfluidic에서 셀을 클릭하고 구슬 분리 장치. 첫째, 우리는 DEP 전극과 microfluidic 장치를 조립하고, DEP에 대한 세포를 준비 프로토콜을 제시한다. 그렇다면, 우리는 폴리스티렌 구슬로 DEP 작업을 특징. 마지막으로, 우리는 다채널 microfluidic 장치에서 구슬과 세포 분리의 대표적인 결과를 보여줍니다. 요약, DEP는 microfluidic 장치 내에서 입자 (구슬이나 세포를) 조작을위한 효과적인 방법입니다.

Dielectrophoresis (DEP)는 세포를 조작하는 효과적인 방법입니다. 인쇄 회로 기판 (PCB)은 microfluidic 장치 이내에 연락이없는 세포 조작을위한, 재사용 가능한 저렴하고 효과적인 전극을 제공할 수 있습니다. PCBs에 coverslips와 PDMS 기반 microfluidic 채널을 결합하여, 우리는 다채널 microfluidic 장치 내에서 구슬과 세포 조작과 분리를 보여줍니다.

멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

미세유체 소자는 세포 규모의 동적인 유체 환경을 제공함으로써 세포 연구, 조작, 분류 등의 세포 연구를 발전시켜 왔습니다.

이 절차의 전체적인 목표는 인쇄 회로 기판(PCB)을 이용한 유전영동(DEP)을 통해 미세유체 장치 내의 세포와 비드를 조작하는 것입니다. 이는 먼저 PCB 전극과 미세유체 채널을 설계하고 제작함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 PCB 미세유체 어셈블리와 비드 및 세포 용액을 준비하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 채널을 낮은 전도성 배지로 채운 다음, 비즈와 세포를 로딩하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 PCB 어셈블리를 전력 증폭기 및 함수 발생기에 연결한 후 DEP를 시작하는 것입니다. 최종적으로, DEP를 사용하여 미세유체 장치 내에서 세포와 비즈를 분리하고 조작하는 결과를 얻을 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 원하는 세포나 비드의 조작을 위한 미세유체 장치용 전극을 효과적으로 개발하기 위해서 사용자가 DEP의 원리를 반드시 이해해야 하기 때문입니다. 반면, PCB를 전극으로 사용하면 다양한 과학 분야에서 미세유체 장치 내의 세포 및 비드 구동을 보다 쉽게 접근할 수 있게 됩니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 불균일 전기장을 생성하기 위해 원하는 기하학적 구조를 갖도록 인쇄 회로 기판, 즉 PCB 전극을 설계하는 것입니다.설계가 완료되면 상용 제작 시설을 통해 맞춤형 PCB 전극 칩을 주문하십시오. 맞춤 제작된 PCB가 도착하면, 본 시연을 위해 제품을 개봉하여 검수합니다. PCB의 크기는 길이 8.4 centimeters, 너비 2.1 centimeters입니다.금속 전극의 너비는 5 mm입니다. 본 예시에서 전극은 두 개의 긴 금속 스트립과 전극이 인터디지테이티드(interdigitated) 형태로 배치된 두 개의 4.5 mm 길이 교차 영역으로 구성됩니다. 이러한 인터디지테이티드 영역은 강한 불균일 전기장을 생성하여 자극기와 PCB 전극 사이의 연결을 형성합니다.16 gauge 와이어를 전극 끝에 배치합니다. 가열된 인두기를 사용하여 PCB의 금속 영역에 와이어를 고정합니다. 이를 통해 와이어가 가열됩니다.납을 가열된 와이어에 대고 소량의 납이 와이어 속으로 흘러 들어가게 합니다. 와이어에 납이 채워지면, 납이 식는 동안 와이어를 고정한 상태에서 인두기를 제거합니다. PCB의 다른 전기 연결 부위에 대해서도 동일한 납땜 과정을 반복합니다.다음 단계는 원하는 분지 패턴을 가진 미세 유체 채널을 준비하는 것입니다. 표준 미세 가공 기술을 사용하여 실리콘 웨이퍼와 SU-8 포토레지스트로 채널을 정의하는 마스터 몰드를 제작하십시오. 이 마스터 몰드는 하나의 입력 채널과 세 개의 타겟 채널로 구성됩니다.채널의 너비는 100 micrometers이며, 채널의 높이는 27 micrometers입니다. 마스터 몰드가 제작되면, polymethyl LAANE 또는 PDMS 엘라스토머를 경화제와 10:1의 중량비로 혼합하여 5분 동안 기다립니다. 액상 PDMS를 미리 제작된 SU eight 마스터 몰드 위에 붓고, 액상 PDMS를 진공 상태에 3분 동안 노출시켜 기포를 제거합니다.필요한 경우 모든 기포를 완전히 제거하기 위해 진공 과정을 반복하십시오. 필요에 따라 질소 가스 흐름을 사용하여 잔류 기포를 제거할 수 있습니다. PDMS를 70 °C 오븐에서 2시간 동안 경화시키십시오.면도날을 사용하여 미세유체 채널이 형성된 P-D-M-S-S 랩을 웨이퍼에서 제거합니다. 이때 채널 공간이 위를 향하도록 하여 웨이퍼가 깨지지 않도록 주의하십시오. 생검 펀치를 사용하여 미세유체 장치 내부로 유체와 세포를 주입하기 위한 구멍을 뚫습니다. 가장자리를 다듬습니다.남은 PDMS를 제거합니다. 미세유체 장치에 먼지나 이물질이 없는지 확인하십시오. 3M Scotch Magic 테이프를 사용하여 PDMS를 세척합니다.PDMS 채널과 80~130 µm 두께의 깨끗한 0번 커버슬립을 플라즈마 가스에 1.5분 동안 노출시킵니다. 플라즈마 세척기에서 PDMS 칩과 커버슬립을 꺼내 페트리 접시에 옮긴 후, PDMS 미세유체 채널이 커버슬립 위에 놓이도록 플라즈마 본딩을 수행합니다. 커버슬립-미세유체 조립체를 100 °C로 설정된 핫플레이트 위에서 최소 15분 동안 가열합니다. 미세유체 장치 준비의 마지막 단계는 PDMS 채널과 커버슬립을 PCB의 전극 위에 배치하는 것입니다.먼저 PCB 위에 미네랄 오일 약 10 µL를 도포합니다. PCB와 커버슬립 사이의 밀착을 위해, 커버슬립이 부착된 커버슬립 미세유체 채널 어셈블리를 오일이 도포된 PCB 위에 올립니다. 오일과 접촉한 상태에서 커버슬립 미세유체 어셈블리를 부드럽게 눌러 잘 밀착시키고, 세포 및 비드 시각화를 방해할 수 있는 기포를 최소화합니다.또 다른 중요한 단계는 저전도성 배지 혼합물(탈이온수에 sucrose 8.5%(w/v) 및 glucose 0.3%(w/v))을 준비하는 것입니다. 이제 미세유체 장치를 사용할 준비가 되었습니다. 피펫을 사용하여 각 미세유체 채널에 저전도성 배지를 15~20 µL씩 채웁니다. 진공 흡입을 사용하여 채널 내의 기포를 제거하십시오.다음 단계는 테스트 입자를 미세유체 장치에 주입하는 것입니다. 본 시연에서는 마이크로리터당 550개의 폴리스티렌 비드가 포함된 저전도성 배지 현탁액을 사용합니다. 비드는 시간이 지남에 따라 침전될 수 있으므로, 교반하여 비드를 재현탁시키십시오. 그다음 피펫을 사용하여 폴리스티렌 비드 현탁액 200 µL를 채널에 주입합니다.다음 단계는 전극을 준비하고, 함수 발생기의 출력을 AC 전력 증폭기의 입력에 연결하는 것입니다. 그 다음 증폭기의 출력을 전극 와이어에 연결하십시오. 사용자가 잠재적인 전기 충격에 노출되는 것을 방지하기 위해 모든 전기 와이어와 장치 표면을 전기 테이프로 덮으십시오.함수 발생기를 1~1.5 megahertz의 사인파 출력을 생성하도록 설정하십시오. 이 설정에서 세포와 비드를 분리하기 위해 DEP를 시작하십시오. 입구 채널은 오른쪽에 있으며, 세 개의 타겟 채널은 삼분 분기점에서 갈라집니다.PCB 전극은 층류와 DEP가 모두 없는 상태의 검은색 줄무늬에 해당합니다. DEP가 시작되면 비즈는 유동이 없는 상태에서 기본적으로 정지해 있습니다. 층류가 흐를 때 비즈는 PCB 전극 쪽으로 이동하며 전극 사이의 공간에서 멀어집니다.하지만 DEP가 꺼져 있을 때 유입 채널을 통해 흐르는 비드들은 세 개의 타겟 채널로 나뉘어 흐릅니다. DEP가 시작되고 층류가 형성되면, 비드들은 중앙 채널로만 흐르도록 작동됩니다. 다음 영상들에서는 미세유체 장치를 PCB 전극 위에서 회전시켜 채널의 방향을 변경하였습니다.PCB 전극을 기준으로 설명하겠습니다. 이전에는 PCB 전극과 수직이었던 유입 채널이 이제는 층류(laminar flow)가 흐르는 상태에서 전극과 거의 평행한 상태가 되었습니다. 하지만 DEP가 꺼진 상태에서는 비드들이 세 개의 타겟 채널 모두에 균일하게 진입합니다.DEP가 시작되면, 비즈가 삼분점(trifurcation point)에 도달하며 DEP 힘에 의해 전극 위쪽의 측면 채널로 끌려 들어갑니다. 비디오의 다음 그림들은 미세유체 소자 내의 인간 결장 선암 또는 HT 29 세포와 형광 비즈의 혼합물을 보여줍니다. 이 DIC 이미지에서 빈 화살표는 층류의 방향을 나타내며, 채널은 점선으로 표시되어 있습니다.반사성 금속 전극은 밝은 배경의 스트라이프로 나타납니다. 비드 이미징에는 DIC 현미경이 사용되었습니다. 글로우(glow)의 스케일 강도 이미지는 세포를 더 잘 보이게 하기 위해 사용되었습니다.이 그림은 다른 그림과 동일한 이미지이지만 글로우 스케일(glow scale) 강도 이미지로 표시되어 세포와 비드를 모두 시각화한 것입니다. 이 그림에서 반사성 금속 전극은 노란색과 녹색 줄무늬로 나타납니다. DEP를 적용하면 비드는 DIC 이미지에서 보는 바와 같이 오른쪽 채널로 배출되는 반면, HT 29 세포는 DEP 시작 전의 글로우 스케일 이미지에서 보이는 것처럼 중앙 및 왼쪽 채널로 배출됩니다. 세포와 비드의 혼합 용액이 하나의 유입 채널에서 세 개의 서로 다른 목표 채널로 흐릅니다.DEP를 유도한 후, 비드와 세포는 각각 별도의 채널로 선택적으로 구동됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세유체 소자 내에서 세포와 비드를 조작하기 위한 다이얼 전기영동을 어떻게 구현하기 시작해야 하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

separating-beads-cells-multi-channel-microfluidic-devices-using

Research

연구

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