온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에

이 절차의 전반적인 목표는 로보틱스와 표준화된 분석법을 사용하여 Chlamydomonas의 온도 민감성 치사 돌연변이 분리를 효율화함으로써, 이 생물체의 필수 유전자와 경로를 결정하는 것입니다. 우리는 진핵생물에서 필수적인 세포 기능의 보존과 분화 모두에 관심을 가지고 있습니다. 그리고 이를 연구하기 위해 이러한 과정에서 필수 유전자를 파괴하는 돌연변이를 이용하고자 합니다.

이 방법이 효과적으로 작동하려면 매우 포괄적인 돌연변이체 컬렉션이 필요하며, 이제 설명해 드릴 방법들이 바로 그러한 컬렉션을 구축하는 저희만의 방식입니다. 저희는 식물계를 대표하는 모델 생물인 녹조류 Chlamydomonas reinhardtii를 사용하여 연구를 진행하고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 필수 경로에서 온도 민감성 치사 돌연변이를 발견할 가능성이 높다는 점입니다.

이 방법은 사전 지식이나 표적 돌연변이 유발이 필요하지 않습니다. 치사 표현형으로부터 돌연변이 유전자의 분자적 기능을 즉각적으로 추론할 수 있습니다. 이를 통해 세포 주기 조절 외에도 다양한 siala 경로를 방해하는 흥미로운 돌연변이를 선택하는 데 도움이 됩니다.

UV 돌연변이 유발을 수행하려면, 25°C의 광조건 및 100 RPM의 진탕 조건에서 100 mL의 Tris-Acetate-Phosphate(TAP) 배지를 사용하여 Chlamydomonas 세포를 OD 750 기준 0.2에서 0.5까지 배양합니다. UV 돌연변이 유발은 텍스트 프로토콜에 따라 두 가지 유전적 배경에서 독립적으로 수행합니다. 각 배양액의 샘플을 현미경으로 관찰하여 세포의 생존 여부와 오염 여부를 확인합니다.

다음으로 배양액을 OD 750 기준 0.003으로 희석한 후, 해당 균주가 가동성(modal)을 가지며 빛에 반응하여 방향성으로 헤엄치므로 균질한 밀도를 유지하기 위해 병을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 텍스트 프로토콜에 따라 현탁액의 밀도를 조정한 후, 액체 분주기에 맞는 소형 튜브 카세트를 장착하고 오염을 방지하기 위해 제조사의 지침에 따라 멸균을 위한 일련의 세척 과정을 수행합니다. 8구 시린지 액체 분주기 카세트를 사용하여, 건조한 직사각형 플레이트 위에 배양액 2 µL씩 96방울을 4회 분주합니다.

플레이트 가장자리를 가볍게 두드려 모든 방울이 얇은 액체 층으로 합쳐지게 한 후, 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 즉시 플레이트를 덮습니다. 건조되면, 생존 개체 중 ts 돌연변이체의 수율이 최적화되도록 경험적으로 결정된 시간 동안 플레이트를 살균 UV 램프 아래에 둡니다. 그 다음, 플레이트를 실온의 어두운 곳으로 옮겨 8~24시간 동안 보관합니다.

그 후 플레이트를 조명이 있는 21 °C 배양기에 넣습니다. 약 10일 후 콜로니가 성장했지만 서로 융합되지 않았을 때, 로봇 콜로니 피킹의 소스로 사용하기 위해 플레이트를 해당 스택에 적재합니다. 그런 다음 직사각형 플레이트에 384 어레이로 콜로니를 피킹하고, 조명이 있는 21 °C에서 약 일주일 동안 배양합니다.

복제 도말 로봇을 사용하여 384 어레이를 1536 어레이로 응축하고, 플레이트를 21 °C 인큐베이터에서 약 3일 동안 배양합니다. 1536 어레이를 각각 두 개의 플레이트로 복제하여 하나는 21 °C 인큐베이터에, 다른 하나는 33 °C 인큐베이터에 넣습니다. 33 °C에서 24시간이 지난 후, 33 °C 인큐베이터의 플레이트를 미리 가온된 새로운 플레이트 세트로 복제하여 33 °C 인큐베이터에 넣습니다.

33°C에서 3일간, 그리고 21°C에서 5일간 배양한 후, 9개의 정렬 표시가 된 그리드 플레이트를 디지털 카메라로 촬영합니다. 그다음, 모든 플레이트를 고정 프레임에 배치하여 정확한 방향을 유지한 상태에서 21°C 플레이트와 그에 대응하는 33°C 플레이트를 번갈아 가며 촬영합니다. 쌍을 이룬 21°C 및 33°C 플레이트 이미지를 맞춤형 Matte Lab 이미지 분석 소프트웨어로 처리하여 배경을 제거하고 이미지를 1536 어레이로 분할합니다.

프로그램은 검출된 바이오매스를 각 위치의 총 픽셀 강도로 결정합니다. 소프트웨어에서 생성된 선택된 콜로니 목록을 단일 콜로니 피킹 로봇의 지침 파일로 로드하십시오. 그런 다음 로봇 지침에 따라 소스 플레이트와 타겟 플레이트를 준비하고, 로봇이 선택된 콜로니를 어레이로 피킹하도록 하십시오.

스톡 플레이트를 배양하기 위해 타겟 플레이트를 21 °C 인큐베이터에 약 5일 동안 둡니다. 두 번째 바이오매스 축적 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 100 블록 플레이트를 복제한 후, 신선하게 복제된 100 블록 플레이트를 3개의 복사본으로 다시 복제합니다. 로봇에 세 번째 플레이트를 설정하고 콜로니를 스포팅한 후, 0 시점에 스크리닝 플레이트의 각 스폿 영역을 광학 현미경으로 촬영하고 플레이트를 33 °C에서 배양합니다.

33 °C 배양기에서 스크리닝 플레이트를 꺼낸 후 다양한 시점에서 신속하게 사진 마이크로그래프를 촬영하며, 매 시점마다 동일한 세포의 이미지를 얻을 수 있도록 플레이트 홀더와 스테이지 컨트롤러가 정밀하게 보정되었는지 확인하십시오. 현미경 이미지를 분석하고 원하는 기준에 따라 돌연변이체를 선택하십시오. 최종 선택된 세트를 96 웰 어레이 한천 플레이트에 스팟하며, 각 플레이트에 동일한 교배형 및 약물 내성을 가진 돌연변이체가 포함되도록 하십시오.

배열된 콜로니의 상당량을 96-웰 마이크로플레이트에 담긴 질소 결핍 배우자 유도 배지로 옮깁니다. 배우자 생성이 일어날 수 있도록 플레이트를 빛 조건에서 약 5시간 동안 배양합니다. 다른 저항성 카세트를 보유하며 교배형이 반대인 쿼리 균주들을 질소 결핍 배우자 유도 배지가 담긴 튜브에 현탁하여 배우자 생성을 유도합니다.

타겟 플레이트의 샘플들을 20 µL의 교배 혼합액 부피로 혼합합니다. 빛 아래에서 약 10분간 둔 후, 각 웰에서 5 µL씩 두 번 스팟팅합니다. 한 번은 연쇄 분석을 위해 TAP 플레이트에, 다른 한 번은 상보성 테스트를 위해 5 µM paro와 9 µM hygro가 첨가된 TAP 플레이트에 스팟팅합니다.

상보성 테스트 플레이트를 배양한 후, ts 표현형 식별을 위해 플레이트를 두 개의 복사본으로 복제합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 콜로니의 ts 표현형을 테스트합니다. Chlamydomonas의 단일 세포를 조사한 후, 허용 온도에서 10일 동안 세포를 성장시킨 다음, 여기에 표시된 것과 같이 어레이 형식으로 픽킹합니다.

결과로 얻은 384 포맷의 플레이트들을 1536 어레이로 병합합니다. Chlamydomonas ts 돌연변이체를 생성하기 위해 세 가지 UV 노출 시간을 테스트하였습니다. 경험적으로 1.5분 노출 시간에서 가장 많은 ts 돌연변이체가 생성되었습니다.

하지만, 단연코 1분 노출 시간에서 대부분의 세포 주기 후보군이 도출되었습니다. 본 실험에서는 두 번의 연속적인 ts 표현형 분석이 수행되었으며, 약 3000개의 ts 돌연변이체가 분리되어 타임랩스 현미경 관찰을 통해 표현형 특성이 분석되었습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 후속 파이프라인에서 빈번하게 나타나는 유전자를 제거하기 위해, 2개 이상의 대립유전자가 이미 특성 분석된 유전자들을 대상으로 새롭게 수집된 후보군에 대한 상보성 및 연관성 테스트를 수행하였습니다.

이 콜로니들은 쿼리와 상보성을 보이지 않으므로, 해당 유전자의 새로운 ts 대립유전자입니다. 이러한 콜로니들은 일반적으로 추가 특성 분석 대상에서 제외됩니다. 이 기술을 숙달하면 고처리량으로 수행할 수 있습니다.

단 두세 번의 돌연변이 유발 단계만으로 수천 개의 온도시스템(ts) 돌연변이체를 분리할 수 있습니다. ts 돌연변이체 분리 후의 핵심 단계는 추가 연구를 위한 일부 하위 집단을 선택하는 것이며, 치사 표현형의 범위를 확인하는 것은 매우 흥미로운 과정입니다. 표현형 분석은 분자적 기능에 대한 힌트를 제공하며, 추가 연구를 위해 돌연변이체의 우선순위를 정하는 데 도움이 됩니다.

돌연변이체의 게놈에는 수백 또는 수천 개의 돌연변이가 있을 수 있다는 점을 유의하십시오. 일반적으로는 단 하나만이 원인이 되지만, 때로는 온도 민감성(ts) 표현형을 위해 두 개의 돌연변이가 필요할 때가 있으며 이는 테트라 분석(tetra analysis)을 통해 결정할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 풀링된 샘플의 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing analysis)을 통해 원인 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 식별된 유전자는 때때로 기능을 암시하는 돌연변이를 가지고 있거나, 완전히 새롭고 알려지지 않은 서열일 수 있으며 이는 매우 흥미롭고 고무적인 결과입니다.

Chlamydomonas는 식물계의 세포 생물학을 연구하는 데 있어 매우 훌륭한 모델 시스템이 되어 왔습니다. 앞서 설명해 드린 절차들은 상대적으로 연구가 미진했던 이 생명체의 필수적인 과정들에 대한 연구의 길을 열어줄 것이며, 그 결과가 더 넓은 범위의 식물계에도 유의미하게 적용되기를 기대합니다.