온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서

이 절차의 전반적인 목표는 로봇 공학과 표준화된 분석을 사용하여 클라미도모나스에서 온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 분리를 간소화하여 이 유기체의 필수 유전자와 경로를 결정하는 것입니다. 우리는 진핵생물의 필수 세포 기능의 보존과 발산에 관심이 있습니다. 그리고 우리가 연구하는 방법은 이러한 과정에서 필수 유전자를 파괴하는 돌연변이를 연구

이것이 잘 작동하려면 정말 포괄적인 돌연변이 컬렉션이 필요하며 여러분이 듣게 될 방법은 이러한 컬렉션을 생성하는 우리의 방법입니다. 우리는 식물계를 대표하는 녹조류 Chlamydomonas reinhardtii에서 일하고 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 온도에 민감한 치명적인 돌연변이가 모든 필수 경로에서 발견될 수 있다는 것입니다.

이 방법은 사전 지식이나 표적 돌연변이 유발이 필요하지 않습니다. 돌연변이된 유전자의 분자 기능은 치사적 표현형에서 즉시 제안되었습니다. 이는 세포주기 조절을 넘어 다양한 시알라 경로를 방해하는 흥미로운 돌연변이를 선택하는 데 도움이 됩니다.

UV 돌연변이 유발 배양 클라미도모나스 세포를 섭씨 25도의 빛 아래에서 100 밀리리터의 트리스-아세테이트-포스페이트 또는 TAP 중 0.2 - 0.5의 OD 750까지 수행하기 위해 100 RPM으로 흔들립니다. UV 돌연변이 유발은 텍스트 프로토콜에 따라 두 가지 유전적 배경에서 독립적으로 수행됩니다. 현미경으로 각 배양물의 샘플을 검사하여 세포가 생존 가능하고 오염이 없는지 확인합니다.

다음으로, 배양물을 0.003의 OD 750으로 희석한 다음 알루미늄 호일로 병을 감싸 균질한 밀도를 보장하는데, 이는 변형률이 모달이고 빛에 반응하여 방향으로 헤엄치기 때문입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 서스펜션의 밀도를 조정한 후 액체 디스펜서에 맞는 작은 튜브 카세트를 부착하고 제조업체의 지침에 따라 멸균을 위해 일련의 세척을 수행하여 오염을 방지합니다. 8개의 주사기 액체 디스펜서 카세트를 사용하여 각각 2마이크로리터의 배양 4 x 96방울을 건조한 직사각형 플레이트에 분주합니다.

접시 가장자리를 부드럽게 두드려 모든 방울이 얇은 액체 시트에 합쳐지도록 하고 즉시 접시를 덮어 빛에 노출되지 않도록 합니다. 건조되면 생존자들 사이에서 ts 돌연변이의 최적 수율을 제공하기 위해 경험적으로 결정된 기간 동안 살균 UV 램프 아래에 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 8-24시간 동안 어두운 곳으로 옮깁니다.

그런 다음 조명이 있는 섭씨 21도의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 약 10일 후에 콜로니가 성장했지만 병합되지 않은 경우, 로봇 콜로니 피킹을 위한 소스로 해당 스택에 플레이트를 로드합니다. 그런 다음 직사각형 플레이트에 384개의 어레이를 위한 콜로니를 선택하고 약 1주일 동안 조명과 함께 섭씨 21도에서 성장시킵니다.

복제 도금 로봇을 사용하여 384 어레이를 1536 어레이로 압축하고 플레이트가 섭씨 21도의 인큐베이터에서 약 3일 동안 성장하도록 합니다. 1536 어레이를 각각 두 개의 플레이트에 복제하고 하나는 섭씨 21도 인큐베이터에, 다른 하나는 섭씨 33도 인큐베이터에 놓습니다. 섭씨 33도에서 24시간 후, 섭씨 33도 인큐베이터의 플레이트를 미리 예열된 새 플레이트 세트로 복제하고 섭씨 33도 인큐베이터에 넣습니다.

섭씨 33도에서 3일 동안 성장하고 섭씨 21도에서 5일 동안 성장한 후 디지털 카메라를 사용하여 9개의 정렬 표시기가 표시된 그리드 플레이트를 촬영합니다. 그런 다음 정확한 방향을 유지하기 위해 모든 판이 고정된 프레임에 배치된 해당 섭씨 33도 판과 함께 섭씨 21도의 판을 번갈아 가며 판의 사진을 찍습니다. 맞춤형 무광택 랩 이미지 분석 소프트웨어로 쌍을 이루는 21, 33개의 플레이트 이미지를 처리하여 배경을 제거하고 이미지를 1536 어레이로 분할합니다.

이 프로그램은 감지된 바이오 매스를 각 위치에서 총 픽셀 강도로 결정합니다. 소프트웨어에서 생성된 선택된 콜로니 목록을 단일 콜로니 피킹 로봇을 위한 명령 파일로 로드합니다. 그런 다음 로봇 공학 지침에 따라 소스 및 타겟 플레이트를 준비하고 로봇이 선택한 콜로니를 어레이로 선택하도록 합니다.

대상 플레이트를 섭씨 21도의 인큐베이터에 약 5일 동안 넣어 스톡 플레이트를 성장시킵니다. 두 번째 바이오 매스 축적 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 100 블록 플레이트를 복제한 후 100 블록 플레이트의 새 사본을 3 사본으로 복제합니다. 로봇에서 세 번째 플레이트를 설정하고 군체를 발견한 후, 스크리닝 플레이트의 각 지점 영역을 0으로 촬영하고 플레이트를 섭씨 33도에 배치하여 배양합니다.

섭씨 33도의 인큐베이터에서 스크리닝 플레이트를 제거한 후 다양한 시점에서 신속하게 현미경 사진을 촬영하여 플레이트 홀더와 스테이지 컨트롤러가 모든 시점에서 동일한 세포의 이미지를 얻을 수 있도록 정확하게 보정되었는지 확인합니다. 현미경 이미지를 분석하고 원하는 기준에 따라 돌연변이를 선택합니다. 96개의 배열된 한천 플레이트에서 최종적으로 선택된 세트를 찾아 각 플레이트에 동일한 짝짓기 유형 및 약물 내성의 돌연변이가 포함되어 있는지 확인합니다.

배열된 콜로니의 많은 양을 96웰 마이크로플레이트의 질소가 없는 배우자 유도 배지로 전달합니다. 배우자 형성이 가능하도록 약 5시간 동안 빛 아래에서 플레이트를 배양합니다. 배우자 형성을 위한 질소가 없는 배우자 유도 배지가 있는 튜브에 대체 저항 카세트를 품고 있는 반대 짝짓기 유형에 대한 쿼리를 중단합니다.

타겟 플레이트의 샘플을 20마이크로리터의 결합 혼합물 부피로 혼합합니다. 조명 아래에서 약 10분 후 각 우물에서 5마이크로리터를 두 번 찾습니다. 한 번은 연계 테스트를 위해 TAP 플레이트에, 한 번은 보완 테스트를 위해 TAP에 5마이크로몰 파로와 9마이크로몰 하이그로를 사용합니다.

보체 테스트 플레이트를 배양한 후, ts 표현형 식별을 위해 플레이트를 두 개의 사본으로 복제합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 ts 표현형에 대한 콜로니를 테스트합니다. 클라미도모나스의 단세포를 방사선 조사한 후, 세포는 허용 온도에서 10일 동안 성장한 다음 여기에서 볼 수 있듯이 배열 형식으로 선택됩니다.

384 형식의 결과 플레이트는 1536 배열로 병합됩니다. Chlamydomonas ts 돌연변이를 생성하기 위해 3 번의 UV 노출 시간을 테스트했습니다. 경험적으로 1.5분의 노출 시간이 가장 많은 ts 돌연변이를 산출했습니다.

그러나 지금까지 1분의 노출 시간으로 대부분의 세포주기 후보를 산출했습니다. 이 실험에서는 두 개의 순차적 ts 표현형 분석을 수행하고 약 3000 ts 돌연변이를 분리하고 시간 경과 현미경으로 표현형을 특성화했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 다운스트림된 파이프라인에서 고도로 재발하는 유전자를 제거하기 위해, 2개 이상의 대립유전자를 가진 이미 특성화된 유전자에 대한 보완 및 연결 테스트를 새로 수집된 후보 물질에 대해 수행했습니다.

이러한 콜로니는 쿼리와의 보완을 보여주지 않으므로 쿼리된 유전자에 대한 새로운 ts 대립유전자입니다. 이들은 일반적으로 추가 특성화에서 제외됩니다. 이 기술을 마스터하면 높은 처리량으로 수행할 수 있습니다.

수천 개의 ts 돌연변이체는 단 2회 또는 3회의 돌연변이 유발 라운드로 분리할 수 있습니다. ts 돌연변이를 분리한 후 중요한 단계는 추가 연구를 위한 하위 집합을 선택하는 것이며 치명적인 표현형의 범위를 보는 것은 매우 흥미 롭습니다. 표현형은 분자 기능에 대한 힌트를 제공하고 추가 연구를 위해 돌연변이의 우선 순위를 정하는 데 도움이 됩니다.

돌연변이의 게놈에는 수백 또는 수천 개의 돌연변이가 있을 수 있다는 점을 명심하자. 일반적으로 하나만 원인이지만 때로는 ts 표현형에 대해 두 개의 돌연변이가 필요하며 이는 테트라 분석에 의해 결정될 수 있습니다. 이 절차에 따라, 확인된 유전자는 때때로 기능을 암시하는 돌연변이를 갖거나 새롭고 알려지지 않은 염기서열일 수 있으며, 이는 흥미롭고 흥미로운 풀링의 차세대 염기서열분석을 통해 식별될 수 있습니다.

클라미도모나스(Chlamydomonas)는 식물계의 세포 생물학을 연구하기 위한 훌륭한 모델 시스템이었습니다. 당신이 들었던 절차는 상대적으로 검토되지 않은 필수 과정에 대한 이 유기체에 대한 연구를 열어줄 것이며, 우리는 그 결과가 더 넓은 식물계에도 관련이 있기를 바랍니다.