Name: Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜 대장균와 콜레라 균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 대장균과 콜레라균의 전기능세포를 신속하게 준비하는 방법을. 4-6시간 배양 후 냉각 버퍼로 세척하여 당일 완료되는 이 기술은 전통적 방법과 유사한 전환 효율을 제공합니다.

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저자는 자신의 동료들과이 기술의 개발을 지원 한 현재와 과거 연구소의 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. SP의 실험실을위한 캐나다 연구소에 의해 지원되는 건강 연구 운영 그랜트 MOP-84473 및 (의학 연구 기금 기금 앨버타 헤리티지 재단 후원) 앨버타 Innovates가 건강 솔루션을 제공합니다. DP의는 MD001091-01 GM068855-02을 부여는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 세균성 문화, 도구, 시약의 제조 (1 일, 오후) <ol><li> 늦은 오후, 1 ~ 5 ㎖의 멸균에서 멸균 LB의 국물 박테리아 (대장균 또는 V. 콜레라)의 작은 나누어지는와 (예를 들어, 100 × 13mm) 붕규산 유리 시험관에 접종. </li><li> , 37 ° C 온도 (따뜻한 방이나 인큐베이터)에서 지내게 롤러 드럼에 접종 테스트 튜브를 설정 고속 롤러 드럼을 켜고 O / N을 품어 </li><li> 유리가 부드럽게 될 때까지 분젠 버너의 불꽃 막대의 중간을 가열하여 유리 막대에서 &quot;하키 스틱&quot;의 형태로 세포 스프레더를 준비하고 135 ° 각도로 핀셋이나 집게 부드럽게 굴곡을 직접 . 한번 더 단부 및 제 구부 사이 중간 지점에서로드를 가열하고 (제 벤드의 반대 방향) 안쪽으로 45 ° 각도로 구부리. </li><li> 항생제없이 LB 한천을 준비하고 준비에 페트리 접시에 부어4 ° C에서 적절한 (일렉트로 할 벡터의 저항 마커에 따라) 항생제 및 저장을 포함 electrocompetence 프로토콜 및 LB 한천 플레이트 </li><li> 2 mM의 염화칼슘 V. 2 솔루션 살균 필터를 준비 E. 용 콜레라, 또는 오토 클레이브 DDH 2 O 4 ℃에서 대장균 및 저장 </li></ol> 2. Electrocompetent 박테리아의 성장 (제 2 일 아침) <ol><li> 각 LB 한천 플레이트 상에 O / N 균 배양 100 μl를 제공, 냉동 글리세롤 주식도 활용하고 직접 접시에 전달 될 수있다. </li><li> 100 %의 EtOH에서 하키 스틱 모양의 세포 스프레더를 찍어 간단히 배수 및 사용하기 전에 확산 소독하는 나머지의 EtOH를 구울 수 있습니다. 멸균 유리 셀 스프레더 (휴식) 한천 표면을 방해하는 확실하지 않은 결정으로 균등하게 100 μL의 O / N 박테리아 문화를 확산. </li><li> 박테리아 성장의 얇은 잔디가 될 ​​때까지 4 ~ 6 시​​간 동안 37 ° C에서 접시를 품어, 또는구별된다. 적극적으로 성장하면 세포는 대부분의 관할이다. </li></ol> 3. Electrocompetent 세균 세포의 준비 (제 2 일, 오후) <ol><li> 한천의 표면을 관통하거나 휴식 확실하지하고 멸균 접종 루프 박테리아를 수확. 하나 2mm 직경 박테리아 질량은 단일 변환 충분하다. 일반적으로이 접종 루프 두세 회 경상 잔디 표면을 긁는 요구한다. (일반적으로 4 ~ 6 사이에) 몇 가지 샘플은 같은 플레이트에서 수집 할 수있다. </li><li> 1 ML 얼음처럼 차가운 2 ㎜ 염화칼슘 (V. cholerae의 경우) 또는 멸균 DDH 2 O (대장균)에있는 박테리아 질량을 재현 탁 더 덩어리가 보이지 않을 때까지 잘 섞어 얼음 계속. </li><li> 원심 분리기 4 ° C 또는 11 ° C로 설정 냉장실에 저장되어있는 마이크로 원심의 설정 냉장 마이크로 원심 5,000 XG에서 5 분 각 세균 현탁액 </li><li> 상층 액, resusp 폐기빙냉 2 ㎜ 염화칼슘 또는 멸균 DDH 2 O의 동일 부피 세균 펠렛을 종료, 총 3 회 세척 한 번 더 해본 같이 원심 분리 단계를 반복한다. </li><li> 상층 액에 resuspend를 제거하고 40 ㎕의 얼음 추위에 철저하게 2 ㎜ 염화칼슘 또는 멸균 DDH 2 O를 박테리아 펠렛을 풀고 얼음 계속. </li></ol> 4. Electrocompetent 박테리아의 변환 (DAY 2 일 오후) <ol><li> 40 ㎕의 세균 현탁액에 플라스미드 DNA (최대 1 μL 물 또는 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼)의 1 μg을 추가하고 미리 냉장, 무균 0.2 cm 간격 베트로이 혼합물을 전송합니다. DNA 샘플에서 염 농도는 다음 단계에서 펄스의 아킹을 올릴 수있는 바와 같이, 로우이어야한다. </li><li> 펄스 제어 모듈의 일렉트로 챔버에 큐벳을 삽입하고, 1.8 kV의 25 μF에서 electroporate. 시간 상수는 ~ 5.0 밀리 초이어야하고, 아킹은 발생하지 않습니다. </li><li> 빨리 1 ㎖ LB 브로스에 재현 탁하여 세포 현탁액을 회수하고 멸균 이전 붕규산 유리 시험관에 옮긴다. </li><li> 세포가 항생제 선택하지 않고 30 분 동안 37 ° C에서 (롤러 드럼) 폭기 성장 조건에서 배양하여 복구 할 수 있습니다. </li><li> 적합한 선택제 (항생제)의 존재 하에서 미리 제조 LB 아가 플레이트 상에 박테리아 플레이트, 및 37 ° CO / N. 부화 박테리아는 정제 벡터 (0.1-1 μg 수퍼 코일 플라스미드)의 높은 농도로 변환하는 경우, LB 한천 플레이트의 가장자리에와 상한 행진 방법을 사용하여 격리 된 식민지에 대한 멸균 접종 루프 행진 세균 배양의 10 μl를 제공합니다. 결찰 혼합물 변형 된 경우, 각 한천 플레이트에 균 배양 100 μl를 제공하고 균등하게 멸균 유리 셀 스프레더로 확산. </li></ol> 시간 상수 (BE 짧으면낮은 3.5 밀리 초), 또는 펄스는, DNA 샘플을 다시 침전 건조하기 전에 염을 제거하기 위해 두 번 70 % EtOH로 세척하고 TE 버퍼에 재현 탁, 아크 발생합니다.

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</ol>

어떤 공개는 적용되지 않습니다.

변환 효율에 관계없이 유능한 세포를 준비하기 위해 사용되는 방법의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 유사 변수는이 방법에 적용, 큰주의가되어야한다는 세포들이 일정한 저온 (더 높은 ° 4 이상 C)로 유지되도록 한천 플레이트에서 수확 한 번. 세균 잔디 적극적으로 수집시 성장해야하며 세포 성장의 중간 로그 상에 있어야합니다. DNA (염 즉, 오염)의 품질은 변환 효율에 영향을 미친다. 이 방법을 사용하는 경우 특히, 한천 큐벳에있는 한천 조각이 펄스의 아크가 발생합니다 깨진 수 없습니다. 이 기술로 발생하는 대부분의 문제는 두 가지 문제와 관련된 그들은 적극적으로 성장하는 경우 한천 플레이트에서 시간의 적절한 창 동안 박테리아를 수집. 너무 빨리를 수집하는 것은 불충분 한 세포 수를 산출하고 렌더링그들이 형성하는 &quot;pellicule&quot;는 판의 표면을 떠 어렵 기 때문에 실망 LB 한천 플레이트를 긁어. 수집 박테리아는 너무 늦게 극적으로 자신의 능력을 감소합니다. 시간 창은 자연스럽게 LB 아가 플레이트 상에 플레이 팅 종균의 밀도에 의존 될 것이다. 두 번째 중요한 단계는이 변환 다음 LB 한천에 도금 될 때까지 그들은 한천 플레이트를 들어 올려 염화칼슘 또는 DDH 2 O에 재현 탁하는 순간부터 (4 ° C) 차가운 박테리아를 유지하는 것입니다. 박테리아, 큐벳과 버퍼를 포함하는의 미세 튜브는 미리 냉각하고 박테리아가 도금 될 때까지 항상 얼음에 보관해야합니다. 멸균 DDH 2 O 또는 염화칼슘이 침전물을 포함하거나 오염되는 경우에는 추가 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는이 시약 신선한 준비하는 것이 좋습니다. 문제 해결의 변환은 학사 학위를 변환 할 때 컨트롤을 포함하여 용이cteria는 어떤 방법으로 능력을 렌더링합니다. 선택적 마커를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이 팅 비 형질 전환 박테리아의 능력 배치 이루어진 대조군 급속 플레이트에 항생제가 효과적인지 여부를 결정하는 것을 도울 것이다. 실험 샘플과 같은 선택적 마커를 숨겨 좋은 품질과 수량의 알려진 플라스미드 준비와 양성 대조군 변환은 박테리아가 능력이 아니라 변형 실험 DNA가 양 또는 질에 충분한인지 여부를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 장점은 여러이며 방법은 변환이 계획되어 당일 내에서 수행 될 수있다. 우리는 (야간 문화를보기 전에 하루를 시작 잊고 후) &quot;긴급&quot;상황에서이 작업을 수행 한, 우리는 얼어 붙은 세균의 글리세롤 주식 electrocompetence 손실없이 LB 한천에 직접 도금 될 수 있다는 것을 발견했다. 우리는 전자를 테스트 할 수 있지만매우 긴장 어떤 E.에게 알려진 대장균 또는 V. 전기 충격에 의해 변형 될 수있다 콜레라 긴장은 우리의 손에이 의정서의 의무가있다. 이 기술은, 빠른 효과, 전통적인 방법을 사용 electrocompetent 박테리아를 준비에서 얻은 수익률은 변환 효율 비교. 이 방법은 고속 원심 분리기와 관련 로터, 궤도 보육 흔드는 멸균 원심 분리기 버킷 (컨테이너), 및 멸균 버퍼의 큰 볼륨에 대한 요구 사항을 제거 할 수 있습니다. 특정 시약 및 장비의 표는 매우 포괄적이지만, 일렉트로을 수행하는 대부분의 실험실은 이미 이러한 자료의 대부분이 아니더라도 모든 것입니다. 아마도 가장 중요한 기술은 용이하게 빠르게 돌연변이 배경을 electrocompetent 실험실 특정 균주를 생성하기 위해 적용될 수있다. 이 ELEC의 준비의 전통적인 방법을 대체했다로 우리는이 기술의 한계를 자각하는우리의 실험실에서 박테리아를 trocompetent. 여기에 표시된 실험의 결과를 1 주일 이상 더 이상을 위해 -80 ° C에 저장했던 전통적인 방법으로 생산 된 신선한 electrocompetent 세포를 실시했다. 그러나, 냉동 electrocompetent 세포 주식은 장기간 보관을 통해 능력과 또는 생존 능력을 잃게됩니다. 우리의 요약 된 프로토콜은 같은 날 변환이 감소 형질 전환 수율이 발생할 수 있습니다 주식의 나이에 대한 우려없이 계획되어 신선한 electrocompetent 세포의 제조를 허용한다. 우리는이 필요한되지 않았기 때문에 다른 날에 사용하기 위해 빠른 방법을 사용하여 생산 electrocompetent 세포를 저장하는 시도하지 않았습니다. 여기에 도시되지는 않았지만, electrocompetent 셀의 효율은 우리의 신속한 방법 결찰 혼합물 충분하여 제조. 비-O1 V.에 대해보고 된 변환 Unterweger 등의 최근 기사에서 콜레라.(17) (접합에 의해 수행 제외한) 여기서 설명한 방법으로 제조 electrocompetent 박테리아를 사용하여 수행 하였다. 이 기술은 세포의 큰 배치를 준비 할 필요없이 신속하고 효과적으로 돌연변이 배경을 가진 균주를 변환하는 연구자를 제공한다. electrocompetent 박테리아 방법이 빠른 준비는 준비의 원칙으로 일렉트로 의무 것으로 표시되었습니다 및 일렉트로 설정이 기존의 프로토콜과 동일 할 예정 다른 원핵 생물에 적용 할 수 있습니다.

1980 년대 초 1에서의 &#39;처음부터, 일렉트로는 중요한 분자 생물학 기술, 원형 또는 선형 핵산과 / 형질 살아있는 세포를 변환하기 위해 사용 가능성이 하나의 가장 일반적인 방법이되었다. 원래 진핵 세포 1의 형질 개발, 일렉트로은 이후 E.의 변화에 적응했다 콜라이 (2, 3). 세균학에서, 일렉트로 실험실 표준이되었습니다 및 그람 음성 슈도모나스 4, 살모넬라 5, Vibrios 6 Serratiae 및 Shigellae 7을 포함하여 박테리아의 넓은 범위를 변환하도록 수정되었습니다; 그람 양성 클로스 트리 디아 8, 바실러스 9, 유산균 10 및 장구균 11. 심지어 일부 고세균은 Methanococci 포함, 일렉트로으로 변환 의무 입증 </EM&gt; 12 Sulfolobus의 종 13. 종합적인 검토를 위해 오운과 Aachmann 14을 참조하십시오. 일렉트로 변환 효율은 화학 능력 또는 열 쇼크 2보다 소문에 의하면 10 ~ 20 배 높다. 그러나, 많은 1980 년대 15 더글라스 하나 한 최적화로 화학 능력에 박테리아를 준비 같은 세포는 또한 electrocompetent 할 준비를해야합니다. 전기 천공은 electrocompetent 박테리아, 정제 된 DNA, 전기 임펄스를 전달 펄스 제어 모듈 및 전극으로서 기능 작은 일회용 큐벳을 수용 챔버를 필요로하는, 세균성 변환의 신속하고 효과적인 방법이다. 간단히, 감기, 유능한 박테리아 30-45 분 동안 30-37 ℃에서 배양 성장 배지에 재현 탁 큐벳에 고전압 펄스 실시 플라스미드 DNA, 함께 혼합 한 후 반고체 배지 (영양 한천에 도금 아르 하거든 Appr와 함께 접시)선택적 항생제를 opriate. 펄싱 단계 electrocompetent E.의 제조 대조적 대장균은 전통적으로 대량으로 수행되는 다중 절차 남아있다. 간단히, 박테리아의 하룻밤 문화는 성장의 중반 로그 단계 (&lt;1.0의 OD 600)로 성장하고, 멸균 비 직렬 세척을 실시 1 L 루리아 국물 (LB) 100 ㎖,와 삼각 플라스크에 접종 이온 4 ℃에서 볼륨을 감소 버퍼 ​​또는 이중 증류수 (DDH 2 O) 큰 관심은 전체 절차를 통해 차가운​​ 세포를 유지하고 오염을 방지하기 위해주의해야합니다. 이 멸균 원심 분리 버킷 및 비 이온 버퍼 또는 DDH 2 O의 사용, 진탕 배양기, 대용량 고속 냉장 원심 분리기 회 전자의 집합이 필요합니다. 세균은 결국 10 % 글리세롤이 보충 된 버퍼의 작은 부피에 재현 탁하고 ~ 40 μL 부피, WH로 분주된다무형 문화 유산은 사용할 때까지 -80 ° C에 저장됩니다. 저온 저장은 종종 인해 시간이 지남에 따라 생존의 손실을 감소 변환 효율성을 초래한다. Electrocompetent 박테리아 세포는 상업 다양한 소스로부터 만 (자주 재조합 결핍) E.의 제한된 수도 있습니다 호스트가 플라스미드의 광범위한 전파로 대장균 균주는 일반적으로 채택했다. 그 결과 연구팀은 변환에 대한 자신의 변종 / 돌연변이를 준비하기 위해 사내 방법에 의존하고 있습니다. electrocompetent E.의 제조를위한 대안, 신속하고 효율적인 프로토콜 대장균은 지금 시간이 몇 분자 세균학 실험실에서 사용되었으며, 우리의 경우 V.에 추가 그람 음성 세균으로 확장되었습니다 콜레라. 이 시간이 지남에 따라 다른 연구자에 의해 최적화 된 바와 같이 프로토콜의 송신자는 식별 될 수 없다. 여기에 제시된 방법은 우리의 실험 실용에 사용 된거의 두 수십 년 동안 이거, 그것은 우리의 동료와 함께이 유용한 프로토콜을 공유하는 것이 저희의 목표입니다.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Module</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Pyrex 무테 배양 튜브 </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td></tr><tr><td>13 mm 배양 튜브 클로저 </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x 250mm 유리 막대</td><td>실험실 소스</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>롤러 드럼 모터 어셈블리</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100mm 배양 튜브용 롤러 드럼</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 화학 물질</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 무수/변성</td><td>시그마 화학 물질</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar</td><td>Fisher 과학</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

전기 천공은 신속하고 효율적으로 셀의 넓은 범위로 외래 DNA를 도입하는 방법에 널리 이용되고있다. Electrotransformation 자연스럽게 능력이없는 원핵 세포에 DNA를 도입하는 선택의 방법이되고있다. 전기 천공은 정제 DNA 유능한 박테리아 외에도, 시판되는 유전자 펄스 제어부와 큐벳 필요 신속하고 효율적이며 능률적 변환 방법이다. 펄싱 단계 달리 electrocompetent 세포의 제조 미드 로그 상으로 성장 반복 멸균 냉수의 양을 감소 시키는데 원심 분리 및 세척의 라운드 또는 배양 대용량의 비 - 이온 성 버퍼를 포함하는 집중 시간 소모적이고 노동이며 성장. 시간과 노력은 상업적 출처 electrocompetent 세포를 구매하여 저장 될 수 있지만, 선택은 일반적 E. 고용에 한정 대장균 실험 균주. 우리는 이에 신속하게 보급되고electrocompetent E.을 준비하기위한 효율적인 방법 몇 시간 동안 세균학 실험실에서 사용, V.에 적용 할 수있다 대장균, 콜레라와 다른 원핵 생물. 우리가 독자적인 기술 개발을위한 신용에 누구를 확인할 수는 없지만, 우리는 이에 과학계가 사용할하고 있습니다.

우리는 E.로 변환 세트를 실시 대장균 및 V. 콜레라는 원래 electrocompetent 박테리아의 준비를 위해 결혼 지참금 등. 2에 의해 기술 (전통적인) 방법의 적응과 우리의 빠른 방법의 변환 효율을 비교합니다. 적격 세포의 전통적인 제조를 수행하기 위해, 2-L 삼각 플라스크에 500 ㎖의 LB는 E. 500 μL 하룻밤 배양 접종했다 대장균 DH5α 또는 V. 진탕 기 (37 ° C에서 215 RPM)에서 배양하고 0.5 ~ 1.0 사이의 OD 600에서 수확의 cholerae O395. 플라스크를 얼음 냉각시키고, 문화를 4 ℃에서 10 분 동안 4,000 XG에서 미리 냉장 회에서 원심 분리 세포 펠렛을 철저히 V. 500 ML 얼음처럼 차가운 2 ㎜ 염화칼슘에 재현 탁 E. 용 콜레라와 DDH 2 O 콜라이, 다시 원심 분리하여 동일 조건 하에서. 재 부유의 후속 라운드D 원심 분리는 반드시 문화가 4 ℃에서 냉장 유지하고 200의 볼륨과 100 ㎖의 볼륨을 감소 실시 하였다 마지막으로, 10 ml의 부피에서 재 부유하고 원심 분리를 10 % 글리세롤로 행했다. 최종 펠렛은 2 ㎖의 10 % 글리세롤에 재현 탁하고, 40 ㎕의 분취 액은 -80 ° C에서 냉동하지 전에 일렉트로 1 주일보다 더 이상 저장되었습니다. 펄스 설정과 베트의 크기를 포함 일렉트로 조건에 관계없이 유능한 세포의 준비 방법의 모든 electroporations 두 종의 박테리아에 대한 동일했다. 유일한 차이는 우리가 감기 DDH에서 E. 2 O를 세척을 실시이었다 대장균 및 V. 감기 2 ㎜ 염화칼슘 콜레라. 표 1과 동일하지만, 빠른 프로토콜을 사용하거나 전통적인 방법 중 하나를 관할 렌더링 일렉트로에 의해 변형 박테리아의 결과. 우리는 일반적으로 변형 O395과 DH5α를 사용V.의 LY 사용, 대표 변종 콜레라와 E. 각각 대장균, 유사한 결과 (매일 변형이 테스트되었습니다되지이기는하지만) 같은 종의 다른 변종을 얻을 가능성이 아마 넘어 다른 그람 음성 세균에 적용 할 수 있습니다. 동일한 세포 수는 펄스 각각의 배치에 존재 것을 확실히하기 위해, 빠른 방법을 이용하여 생성 electrocompetent 박테리아, 수집에 풀링 혼합, 균일하게 정지 보관하고, 곧 이전의 일렉트로 40 μL 볼륨에 분주했다. 전통적인 방법을 이용하여 생성 Electrocompetent 박테리아는 유사 이전의 40 μL 씩 분주 동결로 처리 하였다. 펄스가 송달 된 후, 40 ㎕의 electroporation하여 박테리아의 각 배치는 400 ㎕의 LB에 중단 및 직렬 1시 10분 희석시켰다. 각 희석 백 마이크로 리터는 100 ㎍ / ㎖의 암피실린의 존재에 LB 한천에 도금 및 멸균 유리 셀 스프레더를 사용하여 확산되었다밤새 37 ° C에서 배양 하였다. 각각의 형질 전환에 사용 박테리아의 총 수를 정량화하기 위해, 각각 준비 배치 electrocompetent 박테리아의 40 μL 볼륨은 순차적 희석하고, 동일하게 평행 항생제없이 LB 한천 배지에 플레이 팅 하였다. 각 배치에서 동등하게 취급 박테리아 중 하나 분취 DNA가없는 1 ㎕의 트리스-EDTA (TE) 버퍼 만 (모의 변환), 직렬로의 배송을 잃은 세포의 수를 추정하기 위해 항생제없이 희석 LB 한천에 도금 일렉트로했다 전기 펄스. 마지막으로, 실험에 하나의 추가 변화는 일렉트로하지만 LB 한천에 도금하기 전에이 형질 전환 된 세포의 회복에 영향을 미칠 후 1 ㎖의 LB에 37 ° C에서 30 분 배양 여부를 결정하기 위해 실시 하였다. 콜로니 형성 단위 (CFUs)는 다음 날에 열거 하였다. 이 실험을 위해 우리는 한 pUC18, 일반적인 실험실 플라스미드를 고용하고 유능한 박테리아의 일괄 처리로 구성된pproximately 세포에 대한 10 8 CFUs는 기존의 방법과 빠른 프로토콜을 이용하여 제조 된 세포에 대한 10 7 CFUs을 이용하여 제조. (DNA)없이 단독으로 일렉트로 무관 electrocompetent 세포를 제조하는데 사용되는 방법의 접어 10-100에 의해 실행 가능한 CFUs을 감소시켰다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 형질 전환 수율은 E. 세 복제 실험 (괄호 안은 표준 편차)의 DNA 범위의 10 6 -10 7 CFUs / μg 이내였다 대장균 (DH5α) 및 V. 콜레라 (O395)는 각각 electrocompetent 전지 제조를위한 전통, 더 긴 방법을 사용하여. 형질 전환 수율은 E. 세 복제 실험 (괄호 안은 표준 편차)에있는 DNA의 10 5 -10 6 CFUs / μg 감소 10 배 등장 대장균 및 V. 신속한 방법을 이용하여 각각의 cholerae. 따라서 우리는 변형 CFUs 나누어 변형 박테리아의 비율을 결정CFUs의 수는 유능한 세포의, 그렇지 않으면 동일한 일괄 처리에서 (플라스미드없이) &quot;모의 변환&quot;에서 회복하여. 형질 전환 된 박테리아의 비율에 관계없이 준비하고 (표 1 괄호 숫자) 변환 종의 방법의 하나의 로그 (2.5-9.4 %) 이내였다. 이러한 결과는 빠른 방법의 효율성 유능한 세포를 준비하고 콜레라 균과 대장균의 대표 균주가 빠른 절차에 동등하게 의무가 있는지의 전통적인 더 긴 절차의 비교입니다 것이 좋습니다. 우리는 β-락타 마제 카세트를 숨겨을 pUC18 같은 플라스미드를 들어, LB의 국물에 30 분 복구 시간에 영향을받지 않습니다, 그 변환 효율을 발견했다. 형질 전환 체의 동일 개수가 직접, 전기 천공 후에, 또는 그들이 30-45 분 복구 시간을 허용되었는지 세포 앰피 실린의 존재하에 LB 한천 배지에 도말 여부를 회수했다이전 도금 37 ° C에서 LB의 국물에. 암피실린 저항은 비 선택적 조건 하에서 부산물을 필요로하지 않는다는 것을 우리의 연구 결과는 β-락타 마제 발현이 변형에 충분히 빠르게 발생하는 것을 제안합니다. 그러나, 우리는 감전으로부터 회복에 기여하고 유전자 발현을 시작할 수도 LB 액체 배지에서 펄스 ​​박테리아의 희석으로 이루어진 것을 주목해야한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> 그림 1. electrocompetent 균의 신속한 제조를위한 방법론의 그래픽 묘사. 4-6 시간 후 (접종원의 밀도에 따라) 박테리아의 충분한 숫자는 단일 LB 한천 플레이트에서 4-6 변환을 수행하기 위해 수집 될 수있다. 일렉트로 될 각 최종 부피에 대한 적격 세포의 동일한 수를 확보하기 위해, LB 아가 플레이트로부터 수집 된 박테리아는 초기 앨라배마 후에 함께 모으고 세정펠렛의 크기에 따라 40 μL 볼륨에 iquoted (큰 펠릿은 40 μL로 나누어 큰 볼륨에 희석). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> 암피실린 내성 형질 전환 / μg의 DNA 수 (암피실린 내성 형질 전환 회복 [%]) </td></tr><tr><td> 변형 </td><td> 전통적인 방법 </td><td> 빠른 방법 </td></tr><tr><td> 대장균 (DH5α) </td><td> 2.3 × 10 6 (5 10 × 7.3 ±) [9.4 %] </td><td> 3 × 10 6 (5 10 × 7.1 ±) [2.5 %] </td></tr><tr><td> V. cholerae의 (O395) </td><td> 4 × 10 7 (7 ~ 10 X 1.7 ±) 5 %] </td><td> 6.7 × 10 5 (5 10 × 2.1 ±) [3.3 %] </td></tr></tbody></table> 표 1. electrocompetent B의 DNA (을 pUC18)의 마이크로 그램 당 변환 효율acteria 신속한 방법에 비해 전통적인 방법으로 제조. 모든 변형은 (1 % 아가로 오스 겔 전기 영동으로 가시화로 ~ 80 % 수퍼 코일 DNA) 500 ng를 한 pUC18 DNA로 수행하고, 일렉트로 셀 직렬 항생제 LB 한천에 CFU를 위해 도금 이전에 LB 액체 배지에서 10 배 희석 하였다. 비 일렉트로 박테리아 플라스미드없이 electroporation하여 박테리아의 컨트롤이 직렬 항생제없이 희석하고, LB 한천에 도금 전에 깜박임 후의 생균의 총 수를 결정하기 위해 변환의 각 세트에 대해 수행 하였다. 일렉트로 컨트롤 성공적 형질 생균의 퍼센트에 대한 기준선을 나타낸다.

일렉트로 변형으로 알려진 공정에서 박테리아로 DNA를 도입하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. electrocompetent 세포의 제조를위한 기존의 프로토콜은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 문서는 다른, 빠른, 그리고 현재 일부 실험실에서 사용 electrocompetent 세포의 준비를위한 효율적인 방법을 설명합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 형질전환에 필요한 컴피턴트 박테리아(competent bacteria)를 당일에 빠르고 편리하게 제조하는 것입니다. 이를 위해 먼저 박테리아를 LB agar 배지에 도말하고 4~6시간 동안 배양합니다.다음으로, 한천 표면에서 세균 층을 조심스럽게 수확하고, 펠렛을 멸균된 냉수 또는 완충액에 재현탁합니다. 그 후 세균 펠렛을 4 °C에서 3회 세척하고 40 µL로 재현탁합니다. 마지막으로, DNA가 존재하는 상태에서 수용성 세포를 전기 천공합니다.최종적으로, 상당한 장비와 다량의 박테리아 배양액 및 멸균 완충액이 필요한 기존 방법을 사용하여 얻은 결과와 유사한 수준의 박테리아 형질전환 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 대형 원심분리기, 로터 또는 다량의 멸균 완충액과 배양액 없이도, 형질전환 계획 당일에 사실상 모든 실험실 균주로부터 신선한 컴피턴트 셀(competent bacteria)을 준비할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람이라도 세균학 실험실에서 흔히 사용되는 기술의 간소화된 변형 버전이므로 큰 어려움 없이 수행할 수 있을 것입니다. 이 프로토콜은 오랜 시간 동안 수많은 연구자에 의해 사용되고 최적화되었으므로 최초 고안자를 특정할 수 없습니다.여기에 제시된 방법은 저희 연구실에서 거의 20년 동안 사용되어 왔으며, 이 유용한 프로토콜을 동료 연구자들과 공유하는 것이 저희의 목표입니다. 이 방법 중 한 단계에서는 시각적인 시연이 중요합니다. 특히, 플레이트 위의 생장 상태를 평가하는 데는 숙련된 안목이 필요하기 때문에, 오거(auger)를 사용하여 론(lawn)에서 박테리아를 수집하는 과정이 이에 해당합니다.이 과정은 시각적으로 확인하는 것이 가장 좋습니다. 시연은 캐나다 에드먼턴 소재 앨버타 대학의 Te Koski 박사 연구실 연구 보조원인 Theresa Brooks 씨가 진행합니다. 늦은 오후에 박테리아 배양 준비를 시작하려면, 멸균된 붕규산 유리 시험관에 담긴 1~5 mL의 오토클레이브 처리된 LB broth에 소량의 E. coli 또는 V. cholerae를 접종하십시오.접종된 시험관을 롤러 드럼에 넣고 37 °C의 고속 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 유리 막대의 중간 부분을 분젠 버너 불꽃으로 가열하여 유리가 부드러워질 때까지 가열함으로써 하키 스틱 모양의 세포 도말기를 제작합니다. 그런 다음 핀셋이나 플라이어를 사용하여 구부러진 부분을 조심스럽게 135도 각도로 맞춥니다.끝단과 첫 번째 굴곡 사이의 중간 지점을 다시 가열하고 45도 각도로 안쪽으로 구부립니다. 항생제가 포함된 것과 포함되지 않은 LB 배지를 준비하여 4°C에서 보관합니다. 다음 날 아침.각 LB agar 플레이트에 하룻밤 배양한 배양액 100 µL를 도말합니다. 셀 스프레더를 사용하여 37 °C에서 4~6시간 동안 또는 박테리아가 얇은 층으로 자란 것이 보일 때까지 플레이트를 배양합니다. 백금이를 사용하여 플레이트에서 직경 약 2 mm의 박테리아 덩어리를 채취한 후, 1 mL의 ice cold 용액에 재현탁합니다.2 mM 염화 칼슘. v coray 또는 E. coli용 멸균 2중 증류수를 사용하는 경우, 4 °C로 설정된 냉장 원심분리기를 사용하여 현탁액을 5,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 마지막 상층액을 제거한 후, 펠릿을 40 µL의 염화 칼슘 또는 2중 증류수에 재현탁하여 얼음 위에 보관합니다.형질전환을 수행하려면, 40 µL의 박테리아 현탁액에 최대 1 µg의 플라스미드 DNA를 첨가하고, 혼합물을 미리 냉각시킨 멸균된 0.2 cm 갭 큐벳에 옮깁니다. 큐벳을 펄스 제어 모듈의 전기천공 챔버에 삽입하고 1.8 kV 및 25 µF에서 전기 충격을 줍니다. 시정수는 약 5.0 ms여야 하며, 아킹(arcing) 현상이 발생하지 않아야 합니다.세포를 1 mL의 LB 배지에 빠르게 재현탁하여 이전에 오토클레이브 멸균한 유리 시험관으로 옮깁니다. 항생제 선택 없이 37 °C의 통기 성장 조건에서 30분 동안 배양하여 세포를 회복시킵니다. 박테리아를 항생제가 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.여기에 나타낸 바와 같이, 저희는 e coli 및 V co array를 사용하여 일련의 형질전환을 수행함으로써, 저희의 신속한 방법론과 doer 등이 전기 천천히 유능 세포(electro competent bacteria) 제조를 위해 처음으로 설명한 전통적 방법의 변형법 간의 형질전환 효율을 비교하였습니다. 전기 천천히 유능화를 위한 전통적 방법을 사용한 e coli 및 v coray의 3회 반복 실험 결과, 형질전환체 수율은 DNA µg당 10⁶에서 10⁷ CFU 범위 내에 있었습니다.세포 준비 단계에서, 급속법을 사용하여 e coli와 v coray에 대해 세 번의 반복 실험을 수행한 결과, 형질전환체 수율이 DNA µg당 10⁵에서 10⁶ CFU로 10배 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 우리는 형질전환된 CFU를 동일한 조건의 컴피턴트 세포 배치에서 얻은 모의 형질전환(mock transformation) 회수 CFU 수로 나누어 형질전환된 박테리아의 백분율을 결정하였습니다. 형질전환된 박테리아의 백분율은 1 log 이내였습니다.준비 방법과 형질전환된 종에 관계없이, 이러한 결과는 신속법의 효율성이 역능 세포(competent cells)를 준비하는 기존의 더 긴 절차와 대등하며, ieo, coray 및 esia coli의 대표 균주들이 신속법에 동일하게 적합함을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 5~6시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 박테리아를 대수 성장기(logarithmic phase)에 수확하고, 멸균되어 새로 준비된 냉장 완충수 용액으로 세척하며, 전기천공법(electroporation) 이후 LB 배지에 재현탁할 때까지 저온 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 초기 도말 평판(inaugural lawn)에서 배양하고 대수 성장기에 수확한 후, 전기천공법 준비를 위해 냉장 완충액으로 세척함으로써 실험실에서 전기 천공 가능(electro competent) 박테리아 균주 특이적 세포를 신속하게 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

근원: Heering, J., 외., 세포 분화 유도 및 Vibrio parahaemolyticus 수영 및 떼 세포의 단일 세포 이미징. J. Vis. 경험. (2017).이 비디오는 형광 이미징을 위해 Vibrio parahaemolyticus 콜로니에서 군집 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 박테리아는 수영 세포에서는 단극성으로, 길쭉한 군집 세포에서는 양극성으로 국한되는 형광단 태그 단백질을 발현하도록 유전자 조작되어 시각적 분화를 가능하게 합니다. 현미경 슬라이드 위에 아가로스 패드를 준비하고, 그 위에 콜로니 섹션을 배치하고 제거하여 부착 세포를 남긴 다음 이미징을 위해 커버슬립으로 덮습니다.

이미징을 위한 Vibrio parahaemolyticus Swarmer 세포의 준비

출처: Kuo, C., et al. 비침습적 생체 내 생물발광 시스템에 의한 쥐 숙주에서 장출혈성 대장균 집락화 검출. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 동물 모델에서 경구 접종물로 사용하기 위해 냉동 재고에서 루시페라아제 발현 장출혈성 대장균 현탁액을 제조하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 생체 내 감염 연구 중 장 집락화에 대한 실시간 생물 발광 추적이 가능합니다.

생물발광 장출혈성 대장균 접종물의 제조

출처: Figueroa, DM, et.al. 항균 펩타이드 국소화를 특성화하기 위한 박테리아 스페로플라스트 및 프로토플라스트의 생산 및 시각화. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 먼저 세포 분열을 억제하여 필라멘트화를 유도한 다음 세포벽의 효소 소화를 통해 대 장균 스페로플라스트를 생산하는 방법을 보여줍니다. 이 공정에는 현미경 관찰을 위한 적절한 구형 형성 및 안정성을 보장하기 위해 킬레이트제, DNase 및 삼투압 안정제의 제어된 첨가가 포함됩니다.

대장균 스페로플라스의 준비

출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

고전압 전기천공법을 이용한 박테리아의 제조 및 형질전환

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

임상적으로 관련된 Vibrio 종의 검출 및 분리에는 선택적이고 차등적인 배양 배지가 필요합니다. 이 연구는 V. parahaemolyticus 및 기타 관련 종을 감지하고 식별하는 새로운 발색 매체의 능력을 평가했습니다. 새로운 배지는 기존 배지보다 더 나은 민감도와 특이도를 갖는 것으로 밝혀졌습니다.

의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발<em&gt; 장염 비브리오 균</em&gt; 및 기타<em&gt; 비브리오</em&gt; 종

이 원고는 일련의 생화학 분석법 외에도 적절한 Vibrio cholerae 유지 기술을 설명하며, 임상 적 및 환경 적 V 사이의 신속하고 안정적인 차별화를 위해 집합 적으로 활용됩니다. 실험실 환경에서 cholerae biotypes.

생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em&gt; 콜레라 비브리오</em&gt; 임상 적 및 환경 적 분리 물

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em&gt; 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em&gt; Swimmer and Swarmer Cells

여기에서는 리 모실락토바실러스 루테리 DSM20016 작업을 위한 프로토콜, 성장, 플라스미드 형질전환, 콜로니 PCR, 형광 리포터 단백질 측정, 제한된 플라스미드 미니 프렙, 일반적인 문제 및 문제 해결을 자세히 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 DSM20016에서 리포터 단백질을 측정하거나 리포터가 관여하지 않는 경우 콜로니 PCR을 통해 확인할 수 있습니다.

Limosilactobacillus reuteri DSM20016의 전기천공 및 변형 확인 방법

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

학습하세요 대장균과 콜레라균의 전기능세포를 신속하게 준비하는 방법을. 4-6시간 배양 후 냉각 버퍼로 세척하여 당일 완료되는 이 기술은 전통적 방법과 유사한 전환 효율을 제공합니다.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜

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