Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜 대장균와 콜레라 균

이 절차의 전반적인 목표는 같은 날 빠르고 편리하게 유능한 박테리아를 생성하는 것입니다. 그들은 변화를 위해 필요합니다. 이것은 먼저 LB 한천에 박테리아를 도금하고 4-6시간 동안 배양함으로써 수행됩니다.

다음으로, 박테리아 잔디는 한천의 표면에서 조심스럽게 수확되고 펠릿은 멸균 냉수 또는 완충액에 재현탁됩니다. 그런 다음 박테리아 펠릿을 섭씨 4도에서 3회 세척하고 40마이크로리터에 재현탁시킵니다. 마지막으로, 유능한 세포는 DNA가 있는 상태에서 전기천공됩니다.

궁극적으로, 상당한 장비, 많은 양의 박테리아 배양 및 멸균 완충액이 필요한 기존 방법을 사용하여 얻은 것과 유사한 수준의 박테리아 변형을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 대형 원심분리기, 로터 또는 멸균 완충액 및 배양의 리더 없이 형질전환이 계획된 당일에 모든 실험실 균주에서 신선하고 유능한 박테리아를 가상으로 준비할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 세균학 실험실에서 일반적으로 사용되는 기술의 지름길 변형일 뿐이기 때문에 많은 어려움을 겪지 않을 것입니다. 이 프로토콜의 창시자는 시간이 지남에 따라 수많은 연구원에 의해 사용되고 최적화되었기 때문에 식별할 수 없습니다.

여기에 제시된 방법은 거의 20년 동안 우리 실험실에서 사용되어 왔으며, 이 유용한 프로토콜을 동료들과 공유하는 것이 우리의 목표입니다. 이 방법의 시각적 시연은 한 단계에서 중요합니다. 특히, 오거의 잔디밭에서 박테리아를 수집하는 것은 플레이트의 성장을 평가하기 위해 경험 눈이 필요하기 때문입니다.

그리고 이것은 가장 잘 시각화됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 캐나다 에드먼턴에 있는 앨버타 대학교(University of Alberta)의 테 코스키(Te Koski) 박사 실험실의 연구 조교인 테레사 브룩스(Theresa Brooks)입니다. 늦은 오후에 박테리아 배양 준비를 시작하려면 소량의 대장균 또는 V 코레이를 사용하여 멸균 규산보 유리 시험관에 1-5ml의 오토클레이브 LB 육수를 접종합니다.

접종된 시험관을 롤러 드럼에 넣고 섭씨 37도의 높은 속도로 밤새 배양합니다. 유리가 부드러워질 때까지 분젠 버너의 불꽃에 막대의 중간을 가열하여 유리 막대에서 하키 스틱 모양의 셀 스프레더를 준비합니다. 그런 다음 핀셋이나 펜치를 사용하여 구부리기를 135도 각도로 부드럽게 향하게 합니다.

끝과 첫 번째 굽힘 사이의 중간 지점에서 막대를 한 번 더 가열하고 안쪽으로 45도 각도로 구부립니다. 항생제와 함께 또는 항생제 없이 lb 폭기물을 준비하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음 날 아침.

각 LB 한천 플레이트에 100마이크로리터의 하룻밤 배양을 플레이트합니다. 세포 스프레더를 사용하여 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 또는 박테리아 성장의 얇은 잔디가 보일 때까지 플레이트를 배양합니다. 접종 루프를 사용하여 플레이트에서 약 2mm 직경의 박테리아 덩어리를 수확하고 1ml의 얼음처럼 차갑게 매달아 놓습니다.

2 밀리 몰 염화칼슘. 4 섭씨 온도에 놓인 냉장한 분리기를 사용하여 e coli를 위한 v coray 또는 메마른 두 배 증류수를 사용하는 경우에, 5, 000 Gs.Disdis에 5 분 동안 현탁액을 회전시키고 세척을 2 번 더 반복하십시오. 최종 상등액 소련을 제거한 후 펠릿을 40마이크로리터의 염화칼슘 또는 이중 증류수에 현탁시키고 얼음에 보관합니다.

변형을 수행하려면 40마이크로리터 박테리아 현탁액에 최대 1마이크로그램의 혈장 DNA를 추가하고 혼합물을 사전 냉각된 멸균 0.2cm 간격으로 옮깁니다. Vete, 펄스 제어 모듈의 electroporation 챔버에 vete를 삽입하고 1.8 킬로 볼트와 25 마이크로 phs에서 먹었습니다. 시간 상수는 약 5.0밀리초여야 하며 아크가 발생하지 않아야 합니다.

1ml의 LB 육수에 세포를 빠르게 재현탁시키고 이전의 오토클레이브 브로일 유리 시험관으로 옮깁니다. 항생제 선택 없이 섭씨 37도의 폭기 성장 조건에서 30분 동안 배양하여 세포가 회복되도록 합니다. 박테리아를 LB 에이저 플레이트에 항생제로 플레이트하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 우리는 전기 유능 박테리아의 준비를 위해 doer et al이 원래 설명한 전통적인 방법의 적응과 신속한 방법론의 변환 효율성을 비교하기 위해 대장균 및 V co array를 사용한 일련의 변환을 수행했습니다. 형질전환체 수율은 3개의 DNA 마이크로그램당 7번째 CFU의 6번째 내지 10개의 10 이내였으며, e coli 및 v coray에 대한 실험을 반복하였다. 전기 역량을 위해 전통적인 방법을 사용합니다.

세포 제제, 형질전환체 수율은 신속한 방법을 사용하여 대장균 및 v 코레이에 대한 3번의 복제 실험에서 DNA 마이크로그램당 10배에서 10배, 5번째, 10에서 6번째 CFU로 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, 우리는 형질전환된 CFU를 다른 동일한 수용 세포 배치의 모의 형질전환에서 회수된 CFU의 수로 나누어 형질전환된 박테리아의 비율을 결정했습니다. 변형된 박테리아의 비율은 하나의 로그 이내였습니다.

제제 방법 및 변형 종에 관계없이. 이러한 결과는 신속한 방법의 효율성이 유능한 세포를 준비하는 기존의 더 긴 절차의 효율성과 유사하며, 대표적인 IEO, Coray 및 ESIA coli의 균주가 신속한 절차에 동등하게 순응할 수 있음을 시사합니다. 일단 마스터하면 이 기술은 5-6시간 이내에 완료할 수 있으며 적절하게 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 박테리아의 대수 성장 단계에서 박테리아를 수확하고, 멸균 및 갓 준비된 사전 냉각 완충수 용액으로 세척하고, 전기천공법을 지나 LB에 다시 현탁될 때까지 차갑게 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 첫 잔디밭에서 배양하고 대수 성장 단계에서 수집한 다음 전기천공을 준비하기 위해 차가운 완충액으로 세척하여 실험실에서 전기 유능한 박테리아 균주 특정 세포를 빠르게 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.