마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

이 실험의 전반적인 목표는 마이크로 스케일 열영동을 사용하여 결합 부위 매핑을 포함한 DNA 압타머 소분자 상호 작용을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 분자 상호 작용의 기본 결합 매개변수에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상호 작용 파트너 크기와 무관하여 압타머와 소분자 간의 까다로운 상호 작용에 대한 품질 관리 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다.

이 방법은 압타머 소분자 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약물 표적 또는 항원/항체 상호 작용과 같은 다른 분자 상호 작용에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 증류수에 Cy5 표지 DNA DH25.42 압타머의 100마이크로몰 스톡 용액을 준비합니다. 그런 다음 결합 완충액을 사용하여 압타머 원액을 200나노몰로 희석합니다.

압타머 작업 용액을 섭씨 90도에서 2분 동안 배양합니다. 용액을 얼음 위에서 실온으로 식히십시오. 다음으로, 테스트할 리간드의 16단계 연속 희석을 위해 낮은 결합 200마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 설정합니다.

20 마이크로 리터의 10 밀리 몰 리간드 스톡 용액과 결합 완충액을 튜브 1에 피펫팅합니다. 10 마이크로 리터의 결합 완충액을 튜브 2에서 16까지 피펫으로 만듭니다. 그런 다음 10마이크로리터의 리간드 스톡을 튜브 1에서 튜브 2로 옮기고 피펫과 잘 섞습니다.

희석된 혼합물 10마이크로리터를 튜브 3에 옮기고 잘 섞습니다. 이러한 방식으로 연속 희석을 계속하여 필요한 경우 완충액 희석 효과를 보정하고 완료되면 튜브 16에서 초과 10마이크로리터를 폐기합니다. 각 희석액에 10마이크로리터의 압타머 작업 용액을 넣고 피펫과 잘 섞습니다.

실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 각 혼합물을 깨끗한 표준 모세관으로 끌어당기고 끝의 모세관에만 닿도록 합니다. 모세혈관을 트레이 홀더에 농도의 내림차순으로 놓습니다.

MST 장치를 시작하고 기기 제어 소프트웨어를 엽니다. 수동 온도 제어를 활성화하고 기기 온도를 섭씨 25도로 설정합니다. 기기가 올바른 온도에 도달하면 모세관 트레이를 삽입합니다.

Cy5 레이블이 지정된 aptamer에 대해 LED 채널을 빨간색으로 설정합니다. 500단위의 형광 신호를 얻도록 LED 전원을 설정합니다. 그런 다음 모세관 스캔을 수행하여 모세관 위치를 얻고 샘플 품질을 확인합니다.

결과 피크가 U자형이거나 평평한 경우 고착 효과를 최소화하기 위해 코딩된 모세관에서 새 샘플을 준비합니다. MST 기기 소프트웨어에서 첫 번째 모세관에 대한 리간드 농도 및 희석 유형을 입력합니다. 클릭하고 드래그하여 나머지 모세혈관에 대한 농도와 희석액을 채웁니다.

최종 믹스에 압타머의 농도를 입력합니다. 실험 방법이 5초 동안 형광을 검출하고 30초 동안 MST를 기록한 다음 레이저를 끈 후 5초 동안 형광을 기록하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 레이저 출력을 20%로 설정하고 파일 경로를 설정하고 실험 파일을 저장합니다.

그런 다음 MST 측정을 시작합니다. 이러한 방식으로 최소 3개의 측정값을 얻습니다. 데이터 분석을 시작하려면 MST 분석 소프트웨어를 열고 실험 파일을 로드합니다.

분석 유형으로 MST를 선택합니다. 분석 소프트웨어를 사용하면 모든 측정이 동일한 모세관 세트에서 수행된 기술 반복을 비교할 수 있습니다. 다른 모세관 세트의 생물학적 반복도 분석에 추가할 수 있습니다.

첫 번째 측정 아래에 있는 정보 버튼을 클릭합니다. MST 추적에서 집계 또는 강수 효과를 나타내는 범프 또는 스파이크를 검사합니다. 그런 다음 모세관 스캔과 모세관 모양 오버레이를 검사하여 고착 또는 흡수 효과를 나타내는 평평하거나 U자형 피크가 있는지 확인합니다.

MST에서 응집체 및 흡수 효과를 빠르게 감지할 수 있기 때문에 이 방법을 사용하면 기술 설정을 빠르고 빠르게 최적화하여 최적의 데이터 품질을 보장할 수 있습니다. 모세관 스캔 및 초기 형광에서 리간드 의존성 형광 소멸 또는 향상 효과를 확인합니다. 시간 경과에 따른 형광 변화를 검사하여 사진 표백 또는 사진 향상의 징후가 있는지 확인합니다.

데이터 품질이 확인되면 용량 반응 모드로 전환합니다. T Jump MST 평가 전략에서 상세 분석 설정을 선택합니다. 그런 다음 곡선 피팅에 대한 언덕 모델을 선택하여 바인딩 매개변수를 자동으로 계산합니다.

비교 결과 메뉴에서 정규화 유형을 선택합니다. 정규화된 데이터를 스프레드시트 또는 PDF 파일로 내보냅니다. 이 절차에서 MST는 단일 가닥 DNA 압타머와 선별된 소분자 리간드의 결합 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다.

MST 곡선은 언덕 방정식에 적합하고 절반 최대 유효 농도 값을 결정했습니다. ATP와 압타머의 5가지 독립적인 생물학적 반복 측정에서, ATP 압타머 상호작용은 6 내지 13 단위의 음의 결합 진폭과 약 52.3 마이크로몰의 평균 EC50 값을 보여주었다. 각 리간드에 대한 데이터는 결합된 분자의 분율로 정규화한 다음 비교했습니다.

ATP와 비교한 ADP, AMP 및 SAM의 EC50 값은 인산기의 수가 압타머 결합 거동에 기껏해야 미미한 영향을 미친다는 것을 시사합니다. robo C2 수산화기의 제거는 또한 압타머 결합 친화력에 대한 미미한 효과만을 보여주었다. 압타머는 쌍 그룹이 없거나 쌍 그룹이 구아닌으로 변경된 경우 결합하지 않았습니다.

압타머는 단독으로 아데닌에 결합했는데, 이는 아데닌 그룹이 압타머의 주요 결합 부위임을 나타냅니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 몇 분에서 몇 시간 내에 기본 결합 매개변수에 대한 필수 정보를 제공할 수 있습니다.