랜덤 DNA 라이브러리를 사용하여 뇌관 - 무료 Aptamer 선택

이 절차의 전반적인 목표는 무작위 라이브러리에서 abers를 식별하는 것이며, 이 경우 표적 단백질인 S 100 B 단백질에 특이적으로 결합합니다. 이는 먼저 제한 엔도뉴클레아제로 라이브러리를 소화하여 측면의 고정된 프라이머 염기서열로부터 무작위 염기서열을 해방함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 무작위 라이브러리 염기서열을 정제된 S 100 B 단백질에 결합하고 회수하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 혼성화 및 결찰에 의해 결합된 염기서열을 고정된 프라이머 염기서열과 재결합하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 후보 abers의 결합된 풀의 R-T-P-C-R 재증폭을 허용하기 위해 결찰된 산물을 전사한 다음 이 선택 절차의 추가 라운드를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, S 100 B 단백질에 대한 선택된 abers의 특이적 결합을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 여기서, 샌드위치 결합 분석은 마이크로어레이를 사용하여 수행되며, 형광 표지된 2차 에이버 분석은 15나노미터 금 나노입자에 결합된 기능화된 나노와이어 및 2차 에이버를 사용하여 수행됩니다. 오늘 우리는 D 염기서열의 무작위 라이브러리에서 S 백 B 단백질에 결합하는 최적을 선택하는 절차를 보여줄 것입니다. 우리는 암의 조기 발견을 위한 센서 플랫폼 개발을 포함하여 다양한 목적으로 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 앞에서 설명한 대로 primer free 또는 PF DNA 라이브러리를 생성합니다. 이중 가닥 DNA 라이브러리를 절단한 후 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 겔 정제는 30cc에서 5개의 프라임 인산염으로 구성된 32개의 뉴클레오티드 단편과 30에서 5개의 프라임 인산염으로 구성된 30개의 뉴클레오티드 단편을 생성하며, 각각 32 플러스 및 30 플러스 단편으로 지정됩니다.

32 플러스 단편은 30 뉴클레오티드 랜덤 도메인(random domain)을 포함하고 있으며, 30 플러스 단편은 30 뉴클레오티드 랜덤 도메인 서열로만 구성됩니다. aptr 선택을 위해 PF 라이브러리 DNA 단편을 준비하기 위해 resus는 32 플러스 및 30 플러스 단편 각각을 40 마이크로리터의 20 밀리 트리스, HCL pH 7.4에 현탁시킵니다. 그런 다음 배양 후 섭씨 85도에서 3분 동안 샘플을 가열합니다.

식히고 섭씨 37도의 수조 인큐베이터에서 샘플을 3분 동안 내리고 760마이크로리터를 선택하여 섭씨 37도에서 3분 동안 버퍼링하고 배양합니다. 3분 후 샘플을 실온에서 10분 동안 보관합니다. 배양 후, 선택 버퍼로 사전 세척된 니켈 NTA 아그로 비드가 포함된 컬럼을 통해 용액을 통과시킵니다.

비특이적 DNA를 제거하려면 컬럼에 결합하지 않고 나중을 위해 따로 보관하지 않는 PF 라이브러리 DNA 단편을 수집합니다. S 100 B 바운드 비드를 준비하려면 먼저 마이크로 원심분리기에서 400마이크로리터의 니켈 NDA 비드를 3초 동안 회전시키고 상층액을 버립니다. 그런 다음 400마이크로리터의 결합 버퍼로 비드를 부드럽게 5회 피펫팅하여 세척합니다.

그런 다음 구슬을 회전시키고 상층액을 버립니다. 이 작업을 반복합니다. 두 번 씻으십시오.

다음으로 이전에 정제된 가난한 히스티딘 태그가 붙은 단백질이 비드 위에 있습니다. 여기, 인간 S 100 칼슘 결합. 단백질 B를 사용하여 3분마다 5회씩 총 15분 동안 용액을 위아래로 부드럽게 피펫으로 덧냅니다.

15분 후 구슬을 돌리고 상층액을 버립니다. 마지막으로, 비드 바인딩된 S 100 B를 400마이크로리터의 선택 버퍼로 위아래로 세 번 부드럽게 두드려 세척합니다. 다시 구슬을 회전시키고 상층액을 버립니다.

이 단계를 두 번 반복하여 총 세 번의 최종 세척을 수행하여 S 100 B 바운드 에이버를 선택합니다. 이전에 옆에 두었던 32 플러스 및 30 플러스 조각을 검색합니다. 비드 바운드 S 100 B.Then 15분 동안 샘플을 배양합니다.

15분 후 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 3분마다 혼합하고, 비드를 잠시 회전시키고 상층액을 버린 다음 부드럽게 피펫팅하여 S 100 BDNA 복합체를 800마이크로리터의 선택 버퍼로 세척합니다. 그런 다음 비드를 회전시키고 상층액을 버립니다. 이 세탁 단계를 두 번 반복합니다.

S 100을 회수하려면 200 마이크로 리터의 20 밀리 몰 트리스, HCL pH 7.4에서 비드로 선택하십시오. 그런 다음 슬러리를 섭씨 85도에서 3분 동안 가열합니다. 배양 후.

구슬을 1분 동안 소용돌이치고 회전시킵니다. 그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복하고 상층액을 결합합니다.

마지막으로 선택한 DNA 단편을 정제합니다. 동등한 부피의 페닐 클로로포름, 이소프로필 알코올로 PCR 산물을 두 번 추출합니다. 250 밀리 몰의 염화나트륨과 섭씨 영하 70도에서 15 분 동안 100 % 에탄올 부피의 2.5 배로 침전시킵니다.

섭씨 4도에서 21, 000GS에서 15분 동안 스핀다운합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오. 펠릿을 75% 에탄올로 효율적으로 헹굽니다.

섭씨 4도에서 21, 000GS에서 5분 동안 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 10 라운드 선택 후 3 분 동안 속도 진공 상태에서 펠릿을 건조시킵니다. 생성된 PCR 증폭 DNA 단편을 vitrogen core에서 얻은 PCR 2.1 topo 벡터로 클로닝합니다.

그런 다음 M 13 전방 프라이머를 사용하여 선택한 N 30 cc 및 N 30 단편 각각에 대해 40 및 50개의 단일 콜로니를 염기서열분석합니다. infomax vector NTI 소프트웨어를 사용하여 선택한 염기서열을 정렬합니다. 그런 다음 정렬을 기반으로 합의 순서를 결정합니다.

합의 순서가 확인되면 서면 프로토콜에 설명된 대로 합의 절차를 구매합니다. 인쇄 버퍼에서 5 프라임 Amin C 6 부분으로 합성된 첫 번째 압타머를 15 마이크로몰의 최종 농도로 현탁시킵니다. 그런 다음 apogen 발견 마이크로그리드 어레이를 사용하여 코드 링크 활성화 슬라이드에 aptamer 솔루션을 찾습니다.

다음 코드 링크 권장 프로토콜. 각 슬라이드를 12개의 배열로 인쇄합니다. 2x8 형식을 사용합니다.

혼성화를 위한 Microarray 혼성화 카세트. S 100 B 단백질을 70 마이크로리터의 PBS에 적절한 농도로 희석합니다. 그런 다음 용액을 마이크로어레이 카세트의 웰에 적용합니다.

증발을 방지하기 위해 뉴클레아제가 없는 접착 천장 호일을 사용하여 마이크로어레이 카세트를 밀봉합니다. 단백질이 코드 링크에 인쇄된 abers에 결합하도록 합니다. 배양 후 실온에서 1시간 동안 미루십시오.

PBS 5 밀리몰 염화 마그네슘 또는 PBSM으로 카세트의 웰을 세 번 세척합니다. 다음으로, 형광 표지된 두 번째 abers를 70마이크로리터의 PBSM에서 0.125마이크로몰로 희석합니다. 혼합물을 섭씨 85도에서 3분 동안 가열합니다.

그런 다음 라벨이 부착된 ABERS를 얼음 위에서 식힙니다. 3분 동안 aber를 마이크로어레이 카세트의 웰에 적용합니다. 다시 말하지만, 카세트를 접착 호일로 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

다시 말하지만, 개인적으로. 세척 후 PBSM으로 우물을 세 번 세척하십시오. 카세트를 분해하고 슬라이드 전체를 PBSM으로 헹굽니다.

그런 다음 원심 분리로 슬라이드를 완전히 건조시킵니다. 마지막으로, Packard Biosciences 스캔 어레이를 스캔하여 슬라이드를 스캔합니다. 4, 000 XL 결합은 S 100 B 단백질에 대한 감마 P 32 A TP 5 프라임 말단 표지 압타머에 대해 결정되고 KD 측정을 위한 농도에 대해 플롯되었습니다.

약 7 라운드의 선택 후 대표 kds는 일반적으로 10에서 음의 7 어금니 범위에 있습니다. 5 개의 프라임 조준 dert 첫 번째 압타머를 코드 링크 마이크로 어레이에 결합하고, 정제 된 S 100 B 단백질을 제 1 옵티머 및 LOR 5 46 라벨링 된 두 번째 합금에 결합했다. 옵티머는 첫 번째 옵티머 S 100 B 복합체에 결합되었습니다.

형광은 스캔 어레이 스캐너를 사용하여 정량화되었습니다. 중간 줄은 위와 아래 줄의 KD 분석에서 첨가제 결합을 특징으로 하는 샌드위치 결합 위더를 보여줍니다. abers에 대한 샌드위치 결합은 없으며, 5 개의 프라임 티올 유도체화 된 첫 번째 abers를 표준 thile chemistry를 사용하여 금 나노 와이어에 결합했습니다.

두 번째 abers는 동일한 방식으로 50 NMO 또는 금 nps에 결합되었습니다. 정제 된 S 100 B 단백질을 먼저 유도 나노 와이어에 결합하고, 두 번째 aptamer 50 나노 몰 금 mps를 첫 번째 aptamer 나노 와이어 S 100 B 복합체에 이어서 결합했다. 바운드 샌드위치 복합체는 F FE SEM을 사용하여 시각화되었습니다. 여기.

S 100 B 단백질 대신 HTRA one 단백질로 수행된 결합 분석에서 음성 대조군을 확인할 수 있습니다. 자, 이 절차에서 가장 중요한 것 중 하나는 프라이머 프리 접근법을 사용하고 있다는 것인데, 이 경우 염기서열 자체에 따라 거짓 긍정(false positive)과 거짓 부정(false negative)을 유발할 수 있는 고정된 염기서열이 없으며, 염기서열 자체가 무작위 영역을 압도합니다. 이 절차를 수행할 때 각 역전사 반응 전에 DNA 템플릿이 파괴되었는지 확인하고 각 재증폭 후에 특정 R-T-P-C-R 산물을 분리하도록 주의하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.