랜덤 DNA 라이브러리를 사용하여 뇌관 - 무료 Aptamer 선택

이 절차의 전반적인 목표는 무작위 라이브러리로부터 이번 사례의 표적 단백질인 S 100 B 단백질에 특이적으로 결합하는 abers를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 제한 효소로 라이브러리를 소화시켜 측면의 고정 프라이머 서열로부터 무작위 서열을 분리함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 무작위 라이브러리 서열을 정제된 S 100 B 단백질에 결합시킨 후 이를 회수하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 하이브리드화 및 라이게이션을 통해 결합된 서열을 고정된 프라이머 서열과 다시 결합시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 라이게이션된 생성물을 전사하여 결합된 후보 aber 풀의 R-T-P-C-R 재증폭이 가능하게 하는 것이며, 이후 이 선택 절차를 추가로 반복합니다. 최종적으로, 선택된 aber가 S 100 B 단백질에 특이적으로 결합함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 여기서는 마이크로어레이를 사용하여 샌드위치 결합 분석을 수행하며, 기능화된 나노와이어와 15 nanometer 금 나노입자에 결합된 2차 항체를 사용하여 형광 표지 2차 항체 분석 또한 수행합니다. 오늘은 D 서열의 랜덤 라이브러리에서 S hundred B 단백질에 결합하는 최적의 서열을 선택하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 암의 조기 진단을 위한 센서 플랫폼 개발을 포함한 다양한 목적으로 이 절차를 사용하고 있습니다.

이제 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 이전에 설명한 대로 프라이머가 없는 PF DNA 라이브러리를 생성하십시오. 이중 가닥 DNA 라이브러리를 절단한 후 10% 변성 폴리아크릴아마이드 겔로 겔 정제를 수행하면, 5' 말단에 인산기가 있는 32 뉴클레오타이드 단편과 5' 말단에 인산기가 있는 30 뉴클레오타이드 단편이 생성되며, 이를 각각 32+ 및 30+ 단편으로 지정합니다.

32 plus 단편은 3' 말단에 CC 최소 플랭킹 서열(minimal flanking sequence)이 포함된 30 뉴클레오타이드 무작위 도메인을 포함하는 반면, 30 plus 단편은 30 뉴클레오타이드 무작위 도메인 서열로만 구성됩니다. aptamer 선택을 위한 PF 라이브러리 DNA 단편을 준비하려면, 32 plus 및 30 plus 단편 각각을 40 µL의 20 mM tris, HCl pH 7.4에 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 85 °C에서 3분 동안 가열한 후 배양합니다.

샘플을 37 °C 항온수조 인큐베이터에서 3분 동안 냉각합니다. 다음으로 760 µL의 선택 버퍼를 넣고 37 °C에서 3분 동안 인큐베이션합니다. 3분 후, 샘플을 실온에서 10분 동안 유지합니다. 인큐베이션 후, 용액을 선택 버퍼로 미리 세척한 니켈 NTA 아가로즈 비즈가 충전된 컬럼에 통과시킵니다.

비특이적 DNA를 제거하려면, 컬럼에 결합하지 않은 PF 라이브러리 DNA 단편을 수집하여 나중에 사용하기 위해 따로 보관하십시오. S 100 B 결합 비드를 준비하려면, 먼저 니켈 NDA 비드 400 µL를 마이크로 원심분리기로 3초 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하십시오. 그다음, 결합 버퍼 400 µL를 사용하여 비드를 5회 조심스럽게 파이펫팅하여 세척하십시오.

그 다음 비드를 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 이 과정을 반복하여 총 2회 세척합니다.

다음으로, 이전에 정제한 histidine 태그 단백질을 비드 위로 통과시킵니다. 여기서는 human S 100 calcium binding protein B가 사용되었습니다. 3분마다 5회씩, 총 15분 동안 용액을 조심스럽게 피펫팅하여 섞어줍니다.

15분 후, 비드를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 마지막으로, 파이펫팅을 통해 세 차례 부드럽게 섞어주어 비드에 결합된 S 100 B를 400 µL의 선택 버퍼로 세척합니다. 다시 비드를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.

S 100 B에 결합된 abers를 선별하기 위해 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번의 최종 세척을 수행합니다. 이전에 따로 보관해 두었던 32 plus 및 30 plus 단편들을 회수합니다. 이 단편들을 비드에 결합된 S 100 B에 추가합니다. 그 후 샘플을 15분 동안 배양합니다.

15분 동안 3분마다 부드럽게 파이펫팅하여 혼합한 후, 비드를 짧게 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그다음 selection buffer 800 µL로 S 100 BDNA 복합체를 부드럽게 파이펫팅하여 세척합니다. 다시 비드를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.

S 100을 회수하려면, 20 mM tris, HCL pH 7.4 용액 200 µL를 비드에 첨가합니다. 그런 다음 슬러리를 85 °C에서 3분 동안 가열합니다. 배양 후,

비드를 1분 동안 볼텍싱한 후 원심분리하여 가라앉힙니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 더 반복하고 상층액을 합칩니다.

마지막으로, 선택된 DNA 단편들을 정제합니다. PCR 생성물을 동일한 부피의 페닐 클로로폼과 이소프로필 알코올로 두 번 추출합니다. 250 millimolar 염화나트륨과 2.5배 부피의 100% Ethanol을 넣고 -70 °C에서 15분 동안 침전시킵니다.

4°C에서 21,000 GS로 15분간 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 제거합니다. 펠릿을 75% ethanol로 충분히 세척합니다.

4 °C에서 21,000 g로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 10회의 선택 과정을 거친 후, 펠릿을 스피드 진공 농축기로 3분 동안 건조합니다. 이렇게 얻은 PCR 증폭 DNA 단편을 Vitrogen Core에서 제공하는 PCR 2.1 topo vector에 클로닝합니다.

그런 다음, 선택된 N 30 cc 및 N 30 단편 각각에 대해 M 13 forward 프라이머를 사용하여 40~50개의 단일 콜로니를 시퀀싱합니다. infomax vector NTI 소프트웨어를 사용하여 선택한 서열들을 정렬합니다. 이후 정렬 결과를 바탕으로 컨센서스 서열을 결정합니다.

합의 서열이 확인되면, 서면 프로토콜에 설명된 대로 합의 아버(abers)를 구매하십시오. 5' 말단에 Amin C6 작용기가 포함되어 합성된 첫 번째 압타머를 프린팅 버퍼에 현탁하여 최종 농도가 15 micromolar가 되도록 합니다. 그런 다음, Apogen Discoveries 마이크로그리드 어레이를 사용하여 압타머 용액을 코드링크(code link) 활성 슬라이드 위에 스폿팅하십시오.

다음의 코드 링크에 권장 프로토콜이 안내되어 있습니다. 슬라이드당 12개의 어레이가 포함되도록 출력하십시오. 2x8 형식을 사용하십시오.

하이브리다이제이션을 위한 마이크로어레이 하이브리다이제이션 카세트입니다. S 100 B 단백질을 70 µL의 PBS에 희석하여 적절한 농도로 만듭니다. 그런 다음 이 용액을 마이크로어레이 카세트의 웰에 도포합니다.

증발을 방지하기 위해 뉴클레아제 제거 접착 실링 호일(nuclease free adhesive ceiling foil)을 사용하여 마이크로어레이 카세트를 밀봉하십시오. 단백질이 코드 링크에 프린팅된 abers에 결합하도록 하십시오. 각각 인큐베이션한 후 실온에서 1시간 동안 슬라이드하십시오.

카세트의 웰을 5 mM 염화마그네슘이 포함된 PBS 또는 PBSM으로 3회 세척합니다. 다음으로, 형광 표지된 2차 항체를 PBSM 70 µL에 희석하여 0.125 µM 농도로 만듭니다. 혼합물을 85 °C에서 3분 동안 가열합니다.

그다음 표지된 ABERS를 얼음 위에서 냉각시킵니다. 3분 동안 microarray 카세트의 웰에 abers를 도포합니다. 다시 접착 포일로 카세트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

다시 각각 개별적으로 수행합니다. 세척 후, PBSM으로 웰을 3회 세척하십시오. 카세트를 분리하고 슬라이드 전체를 PBSM으로 헹굽니다.

그런 다음 원심분리를 통해 슬라이드를 완전히 건조시킵니다. 마지막으로 Packard Biosciences 스캔 어레이를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다. gamma P 32 A TP 5' 말단 표지 aptamer와 S 100 B 단백질 간의 4, 000 XL 결합을 측정하고, KD 결정을 위해 이를 농도에 따라 도식화하였습니다.

약 7라운드의 선택 과정 후 대표적인 Kd 값은 일반적으로 10⁻⁷ M 범위에 해당합니다. 5' 말단에 biotin이 결합된 첫 번째 aptamer를 code-link microarray에 결합시켰습니다. 정제된 S100B 단백질을 첫 번째 aptamer에 결합시킨 후, IRDye 800CW로 표지된 두 번째 aptamer를 S100B-첫 번째 aptamer 복합체에 결합시켰습니다.

형광은 스캔 어레이 스캐너를 사용하여 정량화하였습니다. 중간 행은 위아래 행의 KD 분석에서 가산적 결합으로 특징지어지는 샌드위치 결합을 보여줍니다. 5' 말단 티올 유도체화된 첫 번째 항체에 대해서는 샌드위치 결합이 나타나지 않았으며, 표준 티올 화학법을 사용하여 금 나노와이어에 결합시켰습니다.

두 번째 항체를 동일한 방식으로 50 nM의 NMO 또는 금 나노입자(gold nps)에 결합시켰습니다. 정제된 S 100 B 단백질을 먼저 유도체화된 나노와이어의 첫 번째 앱타머에 결합시킨 후, 50 nM의 금 나노입자가 결합된 두 번째 앱타머를 첫 번째 앱타머 나노와이어 S 100 B 복합체에 차례로 결합시켰습니다. 결합된 샌드위치 복합체는 FE-SEM을 사용하여 시각화하였습니다.

S 100 B 단백질 대신 HTRA one 단백질을 사용하여 수행한 결합 분석의 음성 대조군을 확인할 수 있습니다. 이 절차에서 가장 중요한 점 중 하나는 프라이머 프리(primer-free) 방식을 사용한다는 것입니다. 이 방식은 고정된 서열이 없으므로, 서열 자체가 무작위 영역을 압도하여 위양성이나 위음성이 발생하는 문제를 방지할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 각 역전사 반응 전에 DNA 템플릿이 반드시 제거되었는지 확인하고, 각 재증폭 후 특정 RT-PCR 산물을 주의 깊게 분리하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.