March 21st, 2018
생체 외에서 선택 및 그룹 관련 phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA aptamers의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 전기 aptasensor에서 선택 된 aptamer의 응용 프로그램이 포함 되어 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 소수성이 높은 소분자에 대한 그룹별 DNA 압타머를 선택하고 선택한 압타머를 사용하여 민감한 전기화학적 바이오센서를 개발하는 것입니다. 이 방법은 표적이 소수성이 높은 분자일 때 그룹 특이적 압타머를 선택하고 특성화하는 방법에 대한 압타머 선택 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 유용한 부분은 제목 감지를 위한 전기화학적 바이오센서의 개발입니다.
이러한 바이오센서는 당사의 압타머 친화도 측정에도 작동해야 합니다. 반응을 시작하려면 정제된 압타머 PCR 산물에 100마이크로리터의 RNase-Free 물을 첨가합니다. 침전물이 용해될 때까지 혼합물을 소용돌이
치십시오.람다 엑소뉴클레아제 반응은 염 농도에 민감하며 에탄올 침전이지만 다른 이소프로판올에 의해 증식해야 하는 생성물입니다. 5개의 마이크로 원심분리기 튜브, 5마이크로리터의 압타머 용액, 11마이크로리터의 Rnase 자유수 및 2마이크로리터의 10x 반응 완충액 각각에 넣습니다. 2마이크로리터의 Rnase 자유수와 Rnase 자유수에 2, 5, 8, 10단위의 람다 엑소뉴클레아제 용액을 각각 하나의 튜브에 추가합니다.
부드러운 피펫팅으로 잘 섞습니다. 튜브를 섭씨 37도에서 35분 동안, 섭씨 80도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 잡고 12%의 기본 페이지 젤을 준비합니다.
각 튜브에 1마이크로리터의 로딩 염료와 4마이크로리터의 Rnase 자유수를 추가합니다. 기본 페이지 젤의 혼합물을 150볼트에서 45분 동안 실행합니다. 단일 가닥 DNA를 완전히 생성하는 데 필요한 최소 양의 람다 엑소뉴클레아제를 식별합니다.
단일 가닥 DNA를 생성하기 위해 대규모 반응을 수행합니다. 테스트할 각 결합 대상에 대해 10마이크로리터의 평균 기능화된 DBP 코딩 마그네틱 비드를 500마이크로리터의 DBP-1 마이크로몰 용액 1개와 함께 회전하는 동안 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오.
PAE 결합 완충액 200마이크로리터 부분으로 비드를 4회 세척하고 10마이크로리터의 PAE 결합 완충액에 비드를 재현탁합니다. PAE 결합 완충액에서 10마이크로몰 결합 표적 테스트 분산액을 얻습니다. PAE 결합 완충액에서 소수성 표적을 분산시키는 데 적합합니다.
이를 보장하기 위해, 라이브러리의 보강이 있으며, 친화도 테스트에서 선택되었습니다. 10마이크로리터의 DBP-1 코드 비드를 각 타겟 테스트 솔루션 110마이크로리터에 추가합니다. 혼합물을 1시간 동안 배양하고 자기 분리를 통해 상층액을 수집합니다.
상등액을 100배 희석하고 각 정량 PCR에 대해 3마이크로리터를 사용합니다. 테스트 샘플이 있을 때 방출된 DBP-1의 수를 PAE 바인딩 버퍼에서만 방출된 DBP-1의 수로 나누어 상대적 친화도를 계산합니다. 측정을 수행하기 전에 DBP-1 기반 티올 코어 시퀀스 프로브와 신호 프로브를 합성 및 정제합니다.
티올 화 프로브와 신호 프로브를 재구성하고 뉴클레아제가 없는 물에서 100 마이크로몰 용액으로 재구성합니다. 그런 다음 직경 2mm의 금 전극을 1, 0.3 및 0.5 미크론 알루미나 분말과 극세사 천으로 각각 5분 동안 거울과 같은 표면에 연마합니다. 각 연마 후 5분 동안 초순수에서 전극을 초음파 처리합니다.
연마된 전극을 황산의 0.5몰 용액에 담그십시오. 초당 100밀리볼트의 수은 칼로멜에 비해 영하 0.4볼트에서 양의 1.2볼트까지 35회 연속 순환 전압전류법 스캔으로 전극을 청소합니다. 다음으로, 얇은 벽의 원심분리기 튜브에서 0.5 마이크로몰 티올 프로브 DBP-1의 혼합물을 준비합니다.
그리고 0.5 마이크로 몰 FC는 PBS의 100 마이크로 리터에서 DBP-1을 변경했습니다. 섭씨 95도로 설정된 수조에서 혼합물을 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 혼합물을 수조에서 실온으로 식히십시오.
냉각된 혼합물에 10밀리몰 TCEP 스톡 용액 1마이크로리터를 추가하고 실온에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 깨끗한 금 전극을 실온에서 12시간 동안 혼합물에 담그십시오. 전극을 PBS로 헹군 다음 PBS의 티올 화 PEG 1밀리몰 용액에 전극을 1시간 동안 담그십시오.
표적이 없는 PAE 결합 완충액으로 전극을 철저히 헹구고 전극을 완충액에 담그십시오. 다음으로 백금 상대 전극과 포화 칼로멜 기준 전극의 전해 전지를 초순수와 PAE 결합 완충액에서 각각 2분 동안 순서대로 초음파 처리합니다. 전압주사법 기기 소프트웨어의 구형파를 열고 실험 매개변수를 입력합니다.
깨끗한 전해 전지를 표적이 없는 PAE 결합 완충액으로 채웁니다. 3개의 깨끗한 전극을 전위차에 연결하고 전극을 완충액에 담그십시오. 백그라운드 SWV 스캔을 획득합니다.
그런 다음 금 작업 전극을 PAE 결합 완충액의 10 피카몰라 DEHP 용액에 실온에서 30분 동안 담그십시오. PAE 결합 완충액으로 전극을 철저히 헹굽니다. 세 전극을 모두 새로운 PAE 결합 완충액에 담그고 이전과 동일한 매개변수를 사용하여 다른 SWV 곡선을 수집합니다.
적정 곡선을 얻기 위해 DEHP 농도를 증가시키면서 이 과정을 반복합니다. 단일 가닥 DNA만을 얻기 위해 필요한 람다 엑소뉴클레아제의 최소량은 소규모 반응을 기반으로 2단위인 것으로 밝혀졌습니다. 압타머 후보 DBP-1은 SELX에 의해 식별된 후 고처리량 염기서열분석이 수행되었습니다.
DBP-1은 PAE 동족체에 대해 우수한 그룹 특이성을 보였다. DBP-1을 이용한 전기화학적 앱타센서는 다른 일반적인 환경오염물질에 비해 DEHP에 선택적으로 반응했다. 앱타센서는 10피카몰라의 낮은 농도에서 반응으로 DEHP에 매우 민감했습니다.
레이저 입자 : 위험 소수성 소분자에 대한 압타머의 선택 및 특성화. PAE와 같은 소수성 소분자의 압타머의 특성화 및 휘발은 일반적으로 매우 까다로운데, 이는 극히 제한된 수용성과 PAE의 낮은 분자량으로 인해 발생합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전기화학적 압타센서를 만드는 방법과 이를 사용하여 제목을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 소수성 작은 분자에 결합하는 그룹 특이적 DNA 압태머의 체외 선택 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 또한 이 선택된 압태머의 전기화학 바이오센서 개발에서의 응용을 논의합니다.
Discovery-stage detection of hydrophobic small molecules like phthalic acid esters (PAEs) is limited by the lack of robust, group-specific recognition elements. This protocol enables the selection and quantitative characterization of DNA aptamers for highly hydrophobic targets, supporting the development of ultrasensitive electrochemical biosensors. The approach advances predictive confidence and portfolio triage for environmental and safety-relevant analytes in biopharma R&D.
This method integrates from early aptamer discovery through biosensor assay development, enabling a continuum from target validation to preclinical biosensor readiness.