미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

이 절차의 전반적인 목표는 세포 용해물에서 단백질을 정제하지 않고 단백질 리간드 상호 작용의 결합 친화도를 결정하는 것입니다. 이것은 첫째로 어떤 부착 세포주든지에 있는 관심사의 GFP 융합한 단백질을 발현시킴으로써 달성됩니다. 세포 용해물 및 리간드 희석을 준비한 후 세포 용해물 리간드 혼합물을 준비하고 모세혈관에 로드합니다.

다음으로, 다양한 리간드 농도의 존재 하에서 GFP 융합 단백질의 온도 저항을 측정합니다. 마지막 단계는 미시적 열페레시스 또는 MST 측정의 데이터 분석입니다. 궁극적으로, microscale thermo resis는 GFP 융합 단백질과 다양한 리간드 사이의 상호 작용의 결합 친화도를 결정하는 데 사용됩니다.

적정, 열량계 또는 표면 플라즈마 모노와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 단백질 정제를 피하고 이진 상호 작용의 정량적 특성화를 크게 단순화하고 가속화한다는 것입니다. 이 방법은 막 단백질 및 전사 인자와 같이 발현 및 정제가 어려운 단백질로 작업할 때 상당한 이점을 제공합니다. microscale thermo pheresis의 가장 큰 장점 중 하나는 다양한 완충액에서 작동하고 계면활성제와 내 세포의 존재를 용인한다는 것입니다 이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 생물학자인 Karen Stefka가 될 것입니다. T 75 플라스크당 10ml의 완충액을 사용하여 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세포를 잠시 세척합니다.

세포를 5분 동안 또는 플라스크에서 분리되기 시작할 때까지 얼음 위에 두십시오. 필요한 경우 셀 스크레이퍼로 셀을 긁어 분리합니다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 세포를 다시 매달고 미리 냉각된 14ml 원형 바닥 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

400-600Gs와 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 200마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액에 재현탁합니다. 세포질 단백질을 추출하기 위해 현탁액을 사전 냉각된 1.5ml einor 튜브로 옮깁니다.

국부 과열을 최소화하기 위해 전지를 얼음 위에 놓고 30 % 진폭에서 3 배 10 초 펄스의 초음파 처리를 실시합니다. 2-3mm 사전 냉각 팁을 사용하여 거품을 최소화하기 위해 팁을 표면 아래에 두십시오. 완충액이 함유된 세제를 사용하는 경우 이 단계를 생략하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.

대신, 필요한 경우 5몰 염화나트륨의 저장 용액에서 100밀리몰 염화나트륨의 생리학적 염 농도를 포함하도록 용해물 용액을 수정하십시오. 마지막으로, 대략 25, 000 Gs 및 10 분 동안 4 섭씨 온도에 분리기분리에 의하여 lysates를 모으십시오. MST 기기에서 파장이 470나노미터인 발광 다이오드 또는 LED 여기 소스를 선택합니다.

MST 버퍼로 2배 및 10배 희석한 세포 추출물이 담긴 모세관을 로드하고 MST 기기에 넣습니다. MST 기기의 제어 소프트웨어에서 모세관 찾기 작업을 수행합니다. 희석된 용해물에서 최적의 형광 범위는 400 - 1500 형광 단위입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 최적의 리간드 농도 범위를 결정하도록 진행합니다. 필요한 수의 0.5 밀리리터 저 결합 원심 분리 튜브를 얼음 피펫에 놓고 25 마이크로 리터의 MST 완충액을 각 튜브의 바닥에 놓고 25 마이크로 리터의 리간드 원심 용액을 첫 번째 튜브에 놓고 나머지 튜브를 사용하여 리간드를 연속적으로 2 배 희석합니다. 리간드가 담긴 랙을 보관하십시오.amp얼음 위에 있습니다.

세포 용해물 희석을 계산하여 결합 반응에서 형광 표적 단백질의 최적 수준을 산출합니다. 최종 단백질 농도는 예상되는 결합 해리 상수에 가깝거나 더 낮아야 하며, 필요한 형광 수를 얻기 위해 조정해야 합니다. 최종 용액에서 세포 용해물을 MST Buffer로 희석합니다.

0.5 millil low bind tube를 ligand serial dilution 샘플이 있는 튜브 맞은편 튜브 랙에 놓습니다. 각 튜브의 바닥에 15마이크로리터의 세포 용해물을 조심스럽게 추가합니다. 샘플 손실을 방지하기 위해 튜브 벽을 만지지 마십시오.

농도가 가장 높은 리간드 샘플 15마이크로리터를 해당 튜브에 추가합니다. 첫 번째는 세포 용해물입니다. 잘 섞고 피펫 팁을 교체하십시오.

리간드가 없어야 하는 마지막 튜브를 제외한 나머지 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다. 마지막 튜브에 15마이크로리터의 MST 버퍼를 추가하고 혼합합니다. 첫 번째 모세관의 약 2/3를 튜브 번호 1의 결합 혼합물로 잘 채웁니다.

용액을 기울여 용액을 중앙으로 이동하고 모세관 트레이의 모세관을 해당 위치에 놓습니다. 첫 번째, 나머지 모세혈관에 대해 이 단계를 반복합니다. 모세관 끝단을 왁스로 막아 더 긴 실험을 할 수 있습니다.

트레이를 MST 기기 내부에 놓고 기기 도어를 닫습니다. 다음으로, 파장이 470나노미터인 LED 여기 소스를 선택합니다. MST 기기에서 find capillaries 명령을 수행하여 기기가 모세관의 정확한 위치를 찾고 형광 신호 강도를 기반으로 샘플의 형광을 측정할 수 있도록 합니다.

LED 전원을 조정하여 400에서 1500 단위 간격으로 가져옵니다. 시작 버튼을 클릭하여 열저항 실험을 수행합니다. 실험을 위해 하나 이상의 적외선 레이저 출력을 선택할 수 있습니다.

특정 시스템에 대한 최적의 온도 구배를 찾기 위해 16개의 모세관으로 구성된 한 세트를 실행하는 데 10-12분이 걸립니다. 측정의 재현성을 보장하기 위해 동일한 모세관 세트에 대해 2-3회 실행으로 데이터를 수집합니다. 데이터 분석을 시작하려면 분석 소프트웨어를 열고 프로젝트 폴더를 로드합니다.

나타난 정보에서 뷰어 실행 특정 IR 레이저 출력에서 수집 열 레틱 곡선을 선택합니다. 다양한 조건에서 수집된 모든 열리석 트레이스를 한 번에 연 다음 스위치를 켜고 꺼서 분석할 곡선을 선택하는 옵션이 있었습니다. 평가 포인트 그래프 창에서 T 점프 파란색 및 빨간색 선이 있는 thermo resis 또는 thermo pheresis를 선택합니다.

소프트웨어에서의 해석을 위해 수동으로 선택된 실험 곡선의 두 영역을 정의합니다. Thermo Resis의 최대 변화를 제공하기 위해 파란색 및 빨간색 선이 올바르게 배치되었는지 확인하십시오. 표준 편차가 있는 평균 점을 구하려면 평균 사용 또는 개별 런에 대한 런 구분을 선택합니다.

해리 상수 피팅을 플롯하려면 평균 사용을 선택하고, 레이블이 지정된 분자 농도 값을 입력 및 고정하고, 곡선을 피팅합니다. 바인딩 해리 상수 또는 표준 편차가 있는 KD 값이 별도의 정보 팝업 창에 나타납니다. 평균 맞춤 데이터를 텍스트 파일에 저장하고 Excel.Heck로 전송합니다.

2, 9, 3, 3개의 STAT, 3G FP를 발현하는 세포를 형광 표지된 stat three의 공급원으로 사용했습니다. 고전하를 띤 올리고뉴클레오티드의 DNA 결합 분석의 경우, STAT 3 이동성에 상당한 변화가 일어났습니다. 온도 구배에서.

열방출 신호는 올리고뉴클레오티드 농도의 함수로 표시됩니다. 각 데이터 포인트는 3회 측정의 평균을 나타냅니다. 나노 시간 분석 소프트웨어를 사용하여 겉보기 KD 값을 맞추고 측정했습니다.

겉보기 해리 상수는 기체 모티프에 결합하기 위해 37.9 플러스 또는 마이너스 1.0 마이크로몰이었고, 풍부한 올리고뉴클레오티드 s에 결합하기 위해 23.3 플러스 또는 마이너스 0.6 마이크로몰이었다. 놀랍게도 s 플러스 100 서열은 가스보다 약간 더 단단한 결합을 보여주었습니다. 세 번의 측정 반복에서 A를 G로 대체하면 s와 100 돌연변이 1의 친화도가 급격히 감소했습니다.

s plus 100 돌연변이 2는 검출 가능한 결합을 보여주지 않았지만, 따라서 STAT 3에서 s plus 100 의 서열 선택적 결합을 확인했습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 막 단백질 추출을 위한 최적 조건은 단백질마다 다르며 일반적으로 최적화가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포에서 단백질을 정제하지 않고 단백질과 우아한 단백질의 결합 친화도를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 용해물.