미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

본 절차의 전체적인 목표는 세포 용해물로부터 단백질을 정제하지 않고 단백질-리간드 상호작용의 결합 친화도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 임의의 부착성 세포주에서 표적 단백질이 융합된 GFP 단백질을 발현시킴으로써 달성됩니다. 세포 용해물 및 리간드 희석액을 준비한 후, 세포 용해물-리간드 혼합물을 제조하여 모세관에 로딩합니다.

다음으로, 다양한 리간드 농도에서 GFP 융합 단백질의 열영동(thermo phoresis) 특성을 측정합니다. 마지막 단계는 마이크로척도 열영동(microscale thermophoresis, MST) 측정값의 데이터 분석입니다. 최종적으로, 마이크로척도 열영동을 사용하여 GFP 융합 단백질과 다양한 리간드 간 상호작용의 결합 친화도를 결정합니다.

적정, 열량 측정법 또는 표면 플라즈몬 공명과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단백질 정제 과정을 생략할 수 있어 이진 상호작용의 정량적 특성 분석을 상당히 단순화하고 가속화한다는 점입니다. 이 방법은 막 단백질이나 전사 인자와 같이 발현 및 정제가 어려운 단백질을 다룰 때 큰 이점이 있습니다. 마이크로 스케일 열영동법(microscale thermophoresis)의 가장 큰 장점 중 하나는 다양한 버퍼에서 작동하며, 시스템 내에 계면활성제와 세포가 존재하는 환경에서도 견딜 수 있다는 것입니다. 본 기술의 시연은 저희 연구실의 생물학자인 Karen Stefka가 진행하겠습니다. 우선, T 75 플라스크당 10 mL의 버퍼를 사용하여 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 짧게 세척하십시오.

세포를 얼음 위에 5분 동안 또는 플라스크에서 떨어지기 시작할 때까지 둡니다. 필요한 경우 셀 스크레이퍼(cell scraper)로 세포를 긁어 분리합니다. 세포를 10 mL의 차가운 PBS에 재현탁하여 미리 냉각시킨 14 mL 라운드 바텀 원심분리 튜브로 옮깁니다.

400에서 600 Gs, 4 °C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 200 µL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 펠렛을 재현탁합니다. 세포질 단백질 추출을 위해 현탁액을 미리 냉각시킨 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.

국소적 과열을 최소화하기 위해 세포를 얼음 위에 두고, 30% 진폭으로 10초씩 3회 초음파 처리를 하여 세포를 용해합니다. 2~3mm의 미리 냉각된 팁을 사용하여, 거품 발생을 최소화하도록 팁을 표면 아래에 유지하십시오. 세제 함유 완충액을 사용하는 경우에는 이 단계를 생략하고 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.

대신, 필요한 경우 5 M 염화나트륨 스톡 솔루션을 사용하여 용해물 용액의 생리적 염 농도가 100 mM 염화나트륨이 되도록 교정하십시오. 마지막으로, 약 25,000 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 용해물을 수집하십시오. MST 기기에서 파장이 470 nm인 발광 다이오드 또는 LED 여기원을 선택하십시오.

MST 완충액으로 2배 및 10배 희석한 세포 추출물을 모세관에 로딩하고 MST 기기에 배치합니다. MST 기기의 제어 소프트웨어에서 모세관 찾기(find capillaries) 작업을 수행합니다. 희석된 용해물에서의 최적 형광 범위는 400에서 1500 형광 단위 사이입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 최적의 리간드 농도 범위를 결정합니다. 필요한 수의 0.5 mL low bind 원심분리 튜브가 담긴 튜브 랙을 얼음 위에 둡니다. 각 튜브 바닥에 25 µL의 MST 완충액을 분주하고, 첫 번째 튜브에 25 µL의 리간드 스톡 용액을 넣은 후 나머지 튜브를 사용하여 리간드의 2배 연속 희석을 수행합니다. 리간드 샘플이 담긴 랙을 얼음 위에 유지합니다.

결합 반응에서 형광 표적 단백질의 최적 수준을 얻을 수 있도록 세포 용해물 희석 배수를 계산하십시오. 최종 단백질 농도는 예상 결합 해리 상수와 비슷하거나 그보다 낮아야 하며, 필요한 형광 계数值를 얻을 수 있도록 조정되어야 합니다. 최종 용액에서 MST Buffer를 사용하여 세포 용해물을 희석하십시오.

리간드 연속 희석 샘플이 들어 있는 튜브 맞은편 튜브 랙에 0.5 milliliter low bind 튜브를 배치합니다. 각 튜브 바닥에 세포 용해물 15 microliters를 조심스럽게 첨가합니다. 샘플 손실을 방지하기 위해 튜브 벽에 닿지 않도록 주의하십시오.

가장 농도가 높은 리간드 시료 15 µL를 해당 튜브에 첨가합니다. 세포 용해물(cell lysate)이 들어 있는 1번 튜브입니다. 잘 섞은 후 피펫 팁을 교체하십시오.

마지막 튜브를 제외한 나머지 튜브에 대해 이 단계를 반복하십시오. 마지막 튜브에는 리간드가 포함되어서는 안 됩니다. 마지막 튜브에 15 µL의 MST buffer를 추가하고 혼합하십시오. 첫 번째 모세관의 약 3분의 2를 1번 튜브의 결합 혼합물로 채우십시오.

용액이 중심으로 이동하도록 기울인 후, 모세관을 모세관 트레이의 1번 위치에 놓습니다. 나머지 모세관들에 대해서도 이 단계를 반복합니다. 실험 시간이 긴 경우에는 모세관 끝을 왁스로 막을 수 있습니다.

트레이를 MST 기기 내부에 넣고 기기 문을 닫습니다. 다음으로, 파장이 470 nanometers인 LED 여기원을 선택합니다. MST 기기에서 'find capillaries' 명령을 수행하여 기기가 모세관의 정확한 위치를 찾고 형광 신호 강도에 기반하여 시료의 형광을 측정하도록 합니다.

LED 출력을 400에서 1500 units 범위로 조정하십시오. 시작 버튼을 클릭하여 열 저항(Thermo Resis) 실험을 수행하십시오. 실험을 위해 하나 이상의 적외선 레이저 출력을 선택할 수 있습니다.

해당 시스템에 최적화된 온도 구배를 찾기 위해, 16개의 모세관 한 세트를 실행하는 데 10~12분이 소요됩니다. 측정의 재현성을 보장하기 위해 동일한 모세관 세트에 대해 2~3회 실행하여 데이터를 수집하십시오. 데이터 분석을 시작하려면 분석 소프트웨어를 열고 프로젝트 폴더를 로드하십시오.

나타난 정보 실행 뷰어에서 특정 IR 레이저 출력에서 수집된 열역학 곡선을 선택하십시오. 다양한 조건에서 수집된 모든 열역학 트레이스를 한 번에 열고, 이후 켜고 끄는 방식으로 분석할 곡선을 선택하는 옵션이 있었습니다. 평가 지점 그래프 창에서 T jump 청색 및 적색 선이 표시된 열저항 또는 열영동을 선택하십시오.

소프트웨어가 분석할 실험 곡선의 두 영역을 수동으로 지정하십시오. Thermo Resis의 최대 변화량을 얻을 수 있도록 청색 및 적색 선이 정확하게 위치했는지 확인하십시오. 표준 편차가 포함된 평균값을 구하려면 '평균 사용(use average)'을 선택하거나, 개별 실행 건에 대해 '실행 구분(distinguish runs)'을 선택하십시오.

해리 상수를 피팅하여 그래프를 그리려면, 'use average'를 선택하고 표시된 분자 농도 값을 입력 및 고정한 후 곡선을 피팅하십시오. 결합 해리 상수 또는 KD 값과 표준 편차가 별도의 정보 팝업 창에 표시됩니다. 평균 피팅 데이터를 텍스트 파일로 저장한 후 Excel로 옮기십시오.Heck.

STAT 3G FP를 발현하는 2 9 3 세포를 형광 표지된 STAT 3의 공급원으로 사용하였습니다. A DNA 결합 분석에서, 전하가 높은 올리고뉴클레오타이드의 결합은 온도 구배 내에서 STAT 3의 이동성에 상당한 변화를 일으켰습니다.

열역학적 신호를 올리고뉴클레오타이드 농도의 함수로 도식화하였습니다. 각 데이터 포인트는 3회 측정값의 평균을 나타냅니다. Nano temporal 분석 소프트웨어를 사용하여 곡선을 피팅하고 겉보기 KD 값을 결정하였습니다.

겉보기 해리 상수는 gas 모티프 결합 시 37.9 ± 1.0 µM이었으며, AT 풍부 올리고뉴클레오타이드 s+100 결합 시 23.3 ± 0.6 µM이었습니다. 놀랍게도 s+100 서열은 gas보다 약간 더 강력한 결합력을 보였습니다. 세 차례의 반복 측정 결과, A를 G로 치환한 s+100 돌연변이체 1의 경우 결합 친화도가 급격히 감소하였습니다.

s plus 100 돌연변이 2에서는 결합이 검출되지 않았으며, 이를 통해 STAT three의 s plus 100에 대한 서열 선택적 결합이 확인되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면 적절하게 수행할 경우 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 막 단백질 추출을 위한 최적 조건은 단백질마다 다르며 일반적으로 최적화가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포 용해물(cell lysate)에서 단백질을 정제하지 않고 단백질의 리간드에 대한 결합 친화도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.