Name: 혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 사용하여 PEGDA 하이드로겔 내 혈관 유래 생체 모방 미세 유체 네트워크를 제조하는 방법을 익히세요. 이 기술은 조직 공학 및 질병 모델링 연구에 활용됩니다.

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저자는 컨포칼 현미경 검사에 대한 지원에 대해 델라웨어 생명공학 연구소 바이오 이미징 센터의 Jeff Caplan 박사와 Michael Moore 박사에게 감사를 표합니다. 현미경 장비에 대한 접근은 NIH(National Institutes of Health) 공유 기기 보조금(S10 RR0272773 및 S10 OD016361) 및 델라웨어 주 연방 연구 개발 보조금 프로그램(16A00471)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 NIH National Institute of General Medical Sciences(P20GM103446), American Cancer Society(14-251-07-IRG), University of Delaware Research Foundation(14A00778), Cancer Prevention and Research Institute of Texas(CPRIT)(RR140013) 및 NIH National Library of Medicine(4 R00 LM011390-02)의 Institutional Development Award(IDeA) 보조금으로 지원되었습니다.

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영상 유도 레이저 기반 분해 가상 마스크를 사용할 수 있도록 현미경 소프트웨어의 표준 기능을 무시 긴급 현미경 매크로 설정 조심스럽게 조작한다. 방법 현미경 매크로 현미경 소프트웨어 인터페이스는 종종 직관에 반하는 일 수 있고, 많은 노력이 방법을 개발하기 위해 두 프로그램의 최적 설정을 결정하는데 투자했다. 기본 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 사용에 대한 일반적인 이해를 특히 &quot;단계&quot;를 찾아 정확하게 레이저 기반 분해 전에, x, y 및 z 차원 히드로 겔을 위치시키는 &quot;포커스&quot;윈도우에 추천된다. 또한, 입구 채널의 제조 프로토콜에 중요하다; 현탁 형광 종 성공적인 촬상 네트워크 특성화 미세 유체 시스템을 입력 할 수 있어야한다. 이 프로토콜은 특정 적용된다는 점에 유의해야합니다 레이저 가공스캐닝 공 초점 현미경은 특정 현미경 소프트웨어의 버전 및 현미경 매크로 (특정 자재 / 장비의 목록 정보를 참조)를 실행, 특정 펨토초 펄스 레이저로 구성. 우리는 현미경 매크로의 최신 버전은 영상 유도 레이저 제어에 필요한 필요한 제어 기능이없는 것을 발견했다. 다른 현미경 플랫폼 및 펄스 레이저 소스를 사용할 수 있지만,이 프로토콜이 시스템에 특별히 적용 및 구현 플랫폼, 레이저 소스 및 소프트웨어에 따라 수정이 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 기본 원칙은 여전히 ​​있지만, 적용됩니다. 이 프로토콜에 대한 잠재적 인 수정은 하이드로 겔 조성물을 변경하는 것을 포함한다. PEG 화 피브린 포함한 합성 및 천연 하이드로 겔 모두 저하 구현되었습니다 여기서는 5 중량 %, 3.4 kDa의 PEGDA 하이드로 겔을 이용하지만, (미세 유체 네트워크 생성 제외 상업적) 레이저 기반 저하21,22 ogen 실크 단백질은 23 하이드로 겔, 콜라겐 24. 레이저 파워, 주사 속도, Z-조각 사이의 간격 및 반복 횟수를 조절 다른 하이드로 겔 제형의 미세 유체 네트워크를 제조하는 최적의 파라미터를 결정하는 데 도움된다. 기술 중 하나는 전류 제한 시간의 가능한 양으로 분해 될 수있는 하이드로 겔의 전체 부피이다. 열린 공극 또는 하이드로 겔 내에서 미세 유체 기능을 만들려면 레이저는 37.7 뉴저지 / μm의 2의 레이저 플루 언스를 사용하는 경우 시간 (/ μs의 또는 0.021 ㎛의 레이저 스캔 속도) 또는 8.96 μS / 픽셀 이상이어야 거. (그림 1) 이러한 설정으로, 그것은 0.014 mm 3 볼륨 내에서 혈관을 저하 1.4 시간이 걸립니다. 아래 4.48 μS / 또는 픽셀의 레이저 체류 시간을 이용하여 전달 된 에너지는 여기에서 사용 된 하이드로 겔 제형의 완전 분해 충분하지 않다. 다른 하이드로 겔 구현조성물은 이러한 한계를 극복 할 수있다. 감광 요소 또는 34-36 큰 광자 단면 21-24을 포함 광 불안정성 히드로 겔의 사용은 더 적은 에너지의 사용을 가능하게 할 빠르게 저하 될 것이 좋은 선택이다. 치수의 제한과 관련하여, 특징은 하이드로 겔 (7)의 깊이는 1.5 mm까지 제조되어왔다. 깊이 달성 대물의 작동 거리의 함수이고, 생체 내 영상에 최적화 울트라 긴 작동 거리를 사용하여 목표를 증가시킬 수있다. 최소 측정 된 채널 7은 20 배 (NA1.0) 침수 목적은 그림 1에서 생성 된 작은 채널의 크기와 파에 8.9 ㎛의 3.3 μm의 폭과 깊이를 가지고 사용하여 만들었습니다. 다른 실험실 낮은 NA 목표 21,23,24를 사용하고 있지만, 우리는 작은 기능과 미세 유체 네트워크는 높은 사용하여 생성 될 수 있다는 것을 예상감소 된 작동 거리를 희생 ER NA 목적. 궁극적으로, 그러나, 기술의 해상도가 집중된 레이저 빔의 점 확산 함수의 함수이고, 상기 스캔 특성, 레이저에 의해 전달되는 에너지의 양, 그리고 재료의 레이저 흡수 특성이 저하된다. 합성 대 단백질 계 : 또한, 레이저 특성 (속도, 플루 언스는 가상 마스크 및 반복 횟수 사이의 간격) (가교 밀도 로머 / 단량체 분자량 중량 %, 및 하이드로 겔의 형태 겔 특성에 기초하여 최적화되어야 )이 본질적 레이저 따라서 공정의 궁극적 인 분해능과의 상호 작용을 변경하는 바와 같이. 전달 된 에너지는 또한 사용 목적에 의해 좌우되기 때문에 목표를 전환 할 때, 추가의 최적화가 필요하다. 관련된 비용과 관련하여, 펄스 레이저 현미경에 대한 액세스가 필요하고, 많은 다른 objec 반면tives 높은 NA와 (생체 내 이미징) 긴 작동 거리들은 고가 일 수 사용될 수있다. 상기 및 여기 설명 된 프로토콜을 넘어,이 기술을 사용하여 생성 된 미세 유체 네트워크는 또한 내피 세포 부착 및 루멘 형성 (7)을 유도하는 세포 접착 성 펩티드 후 채널을 제조하여 관능 화 될 수있다. 또한, 저하를 채널로 대량 재료 (9) 이전에 세포 분해 펩타이드 서열의 혼입에와 하이드로 겔을 통해 세포 이동의 연구를 위해 허용 할 수 있습니다. 도 2 및도 3 내지 7에서 설명한 바와 같이, 하이드로 겔 내의 미세 망의 연속 유동 들어, 하이드로 겔이 큰 유체 장치 또는 하우징에 광중합 할 수있다. 혈관 신생 또는 혈관 신생 조립식 8-12 통한 혈관 네트워크의 VA 생성을 유도하는 간단한 방법을 제공한다상대적으로 큰 겔 부피에 걸쳐 scularization. 이 방법은 관류 유체 네트워크에서 발생하지만, 직접 크기, 비틀림, 밀도, 및 전반적인 네트워크 아키텍처를 제어하는 ​​것은 곤란하다. 이러한 제한으로 인해 혈관의 흐름 프로필 및 전단 속도는 실험 사이에 다를 수 있습니다. 또한, 미세 기술 13-16 네트워크 아키텍처를 직접 제어를 허용하지만 종종 작은 모세관 크기의 채널 또는 생체 내 혈관 구조에 모방 조밀 한 네트워크의 제조를 생성하기 위해 자신의 무능력에 의해 제한됩니다. 여기에 설명 된 레이저 기반 겔 분해 기술이 새롭게 미세 세대 용도 변경되었지만, 동시에 구조적 제어 밀도 비틀림 요점을 되풀이 3D 생체 모방 미세 유체 네트워크의 생성을 가능하게함으로써, 기존 미세 가공 방법의 크기 기반 제한을 모두 극복 크기 범위 및 전반적인 건축 설계생체 내 혈관의 전자. 또한, 다중 유체 네트워크 간 네트워크 전송 (7)의 조사를 허용 한 겔에서 생성 될 수있다. 더 밀접하게 체외에서 생체 내 운송 과정에서 복제하기 위해 노력하고 조직 공학 응용 프로그램의 경우, 여기에 설명 된 고도의 해결 하이드로 겔 포함 된 미세 유체 네트워크는 적합하다. 우리는이 프로토콜은 조직 구조를 개발에 도움이 될 것으로 예상하는 약물 검사 장치와 같은 체외 질병 모델에서 사용하기에 더 정확하게 모방 생체 내 전송.

림프 및 cardiovasculature 모두 구성된 혈관 시스템, 형태 영양분과 산소의 수송과 대사 폐기물의 제거에 필수적인 고밀도 네트워크를. 따라서, 혈관 조직에 존재하는 세포보다 50 ~ 100 μm의 거리에 용기 (1)에서 결코 없습니다. 시험관 내에서 생체 내 혈관 구조를 재생하는 기능을 정확하게 설계 구조를 사용하여 생체 내에서 전송 프로세스를 모델링하는 것이 중요하다. 3,4 질병 모델링 5,6 선별 높은 처리량 약물 기관 - 온 - 어 - 칩 장치 (2)를 개발하기 위해 최근 드라이브, 방법이 그리는 합성 또는 천연 하이드로 겔의 생체 -like 전송을 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 만들 수 있습니다 상당한 관심. 이들 장치에 사용 microtissues의 생체 모방을 강화하기 위해 세 dimensiona를 이용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 방법을 개발템플릿으로 기본 혈관의 리터 (3D) 이미지 스택은 7 하이드로 겔 PEGDA에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크를 생성합니다. 이 프로토콜은 이미지 유도 레이저 기반 열화 통해 PEGDA 하이드로 겔 혈관 유래, 생체 모방 미세 유체 네트워크를 제작 펨토초 펄스 레이저를 구비 한 시판되는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 사용을 설명합니다. 하이드로 겔을 유동화하는 현재의 접근 방식에 내피 13-16를 위해 미리 정의 된 채널을 생성하는 혈관 신생 8-10 또는 혈관 신생 10-12 내피 세포의 자기 조립과 미세 기술의 유도를 포함한다. 자기 조립 네트워크가 밀도와 미세 혈관의 복잡한 구조를 요점을 되풀이하는 동안, 그들은 종종 약물 검사 애플리케이션을위한 모델링 전송에 문제가 될 수있다 생체 네트워크 11,17,18,보다 더 투과성이다. 자기 조립 네트워크는 physiolog 구성ically 관련, 모세관 크기의 용기,하지만 인해 큰 세동맥 크기의 혈관 생성의 제한 대량 유체 흐름과 통합하기가 어려울 수 있습니다. 이러한 네트워크의 조립을 통해 직접 제어가 없으므로, 최종 구조는 반복해서 같은 유체 유동 및 전송 특성을 갖는 네트워크를 생성하는 것이 곤란하게 샘플들에서 변할 수있다. 3D, 반복 구조 및 잘 정의 된 구조를 가진 하이드로 겔 포함 미세 유체 네트워크를 생성하기 위하여, 마이크로 제조 기술의 개수는 모듈 어셈블리 (13), 희생 물질 (16), 직접 기록 조립체 (14) 및 전 방향성 인쇄 (15)의 3D 인쇄를 포함하여 개발되었다. 이들 방법, 미세 구조, 따라서 유체 유동 및 전송 특성을 적용하여 반복하여 다수의 구조물에 걸쳐 제조 될 수있다. 이러한 방식의 가장 큰 한계는 있지만, 초 미세 합성 섬유를 만들 수 없다는 것이다모세관 크기의 기능을 luidic 네트워크, 4 ~ 10 μm의 19. 대부분의 미세 가공 기술은 종종 직경 13, 16에서 150에서 650 μm의에 이르기까지 다양한 기능으로 제한됩니다. 일부 기존의 기술은 직접 기록 조립체 (14)에 대해 10 내지 300 ㎛, 다양한 직경의 범위에 걸쳐 채널 계층 네트워크를 생성 할 수 있으며, 전 방향성 인쇄 15 18-600 μm의,하지만 이들은 밀집 네트워크 또는 생성 할 수있는 능력에 제한이 단일 구조 (7) 내에서 가까운 거리에 여러 개의 미세 유체 네트워크를 생성한다. 이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해, 우리는 생체 모방의 반복 가공, 생체 내 미세 혈관의 구조를 계층 적 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 허용하는 영상 유도 레이저 기반 겔 분해 기술을 개발 하였다. , 그래서 790 nm의, 140 펨토초 (FS) 80 MHz에서 동작하는 펄스 레이저를 수행하려면 래스터 스캔 전입니다생체 맥관계의 이미지에 의해 정의 된 N, 하이드로 겔 내에서 3 차원 위치를 원하는. 우리는 물 (20)을 팽창과 같이 분해 처리 물의 레이저 광 유도 분해, 생성 된 플라즈마의 형성 물 후속 급속 열 탄성 팽창 및 하이드로 겔의 지방 분해를 통해 동작하는 것을 추측. 이 메커니즘은 단백질 기반의 하이드로 겔 21-24의 레이저 기반 저하와 약간 다릅니다. 낮은 다 광자 단면을 갖는 PEGDA 달리, 단백질은 종종 많은 광자 단면을 가지며, 따라서 광자 흡수 유도 화학 파손 (23)를 통해 저하한다. 영상 유도 미세 유체 네트워크를 생성하기 위해, 레이저 셔터는 미세 구조를 정의하는 관심 영역 (9)의 모자이크 이미지로 구성 유래 가상 마스크에 의해 제어된다. 이 방법을 사용하여, 3 차원 혈관 유래 생체 모방 미세 유체를 제조 할 수있는 능력을 입증하기 위해, 생체 내 혈관의 밀도 및 아키텍처 비틀린 요점을 되풀이 IC 네트워크는 로컬 분해시 발생하는 에너지의 양을 변경하여 하이드로 겔의 다공성을 제어한다. 우리는 또한 가까운 거리 (15 μm의)에 얽혀 있지만 직접 칠을 연결하지 마십시오 두 개의 독립적 인 미세 유체 네트워크를 생성 할 수 있었다. 우리는 또한 아르기닌 - 글리신 - 아스파르트 산 - 세린 (RGDS가), 내피 세포 부착 및 루멘 형성 7을 홍보하기 위해 인테그린 결찰 펩타이드 서열과 포스트 분해 작용을 통해 레이저 성능이 저하 된 마이크로 채널을 endothelialize 할 수있는 능력을 증명하고있다. 이 프로토콜로, PEGDA 하이드로 겔 복잡한 미세 유체 네트워크의 생성은 많은 대학 캠퍼스에 액세스 할 수있는 상업적으로 이용 가능한 현미경을 사용하여 영상 유도, 레이저 기반 분해를 통해 가능합니다. 분해 공정은 디지털 가상 마스크에 의해 안내되고,이 FABRICA기 기술은 다양한 애플리케이션에서의 사용을 허용하는, 미세 유체 네트워크 소재 디자인 의무이다. 우리는 여기에 기재된 방법은 모델링 약물 수송이 중요한 생물학적 전송 프로세스를 복제 할 수있는 생체 모방 organ- 인간 - 온 - 칩 디바이스 설계에 가장 유리할 것으로 예상된다. 이 제조 기술은 암전 5,6- 및 혈액 - 뇌 장벽 모델 (25)을 포함한 체외 질병 모델의 생성에 대한 관심이있을 수있다. 레이저 기반 겔 열화는 이전 신경 생장 21-23의 안내 트랙을 만드는 데 사용 된 바와 같이,이 기법은 영상 유도 확장은 사용자 정의 된 3 차원 공간 배치의 셀 위치를 고급 조직 공학 전략에서 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td>는 <td>프로토콜에서 "프로그래밍 소프트웨어"로 명명됨. 알고리즘</td></tr><tr><td>FIJI(Fiji는 Just Image J)</td>에 대한 자세한 내용은 소스 9 참조. 프로토콜<td>에서 "이미지 처리 소프트웨어"로 명명된</td> <td>NIH</td><td>버전 1.51a</td></tr><tr><td>LSM 780 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td>는 <td>프로토콜에서 "laser-scanning confocal microscope"로 명명됨. 레이저 기반 하이드로겔의 경우 </td></tr><tr>프로토콜에서 "현미경 소프트웨어"라는 이름의<td>성능 저하 Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>릴리스 버전 6.0</td><td>; Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td>에 대한 사용 "<td>현미경 매크로"프로토콜; Zeiss LSM-780 (Zen과 함께)</td></tr> <tr><td>Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>Zeiss LSM-780에 사용하기 위해</td></tr><tr><td>카멜레온 비전 II Modelocked Ti : S 레이저</td><td>Coherent</td><td></td><td>는 프로토콜에서 "고출력 펄스 레이저"로 명명</td></tr><tr><td>되었습니다. 염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올 아민 (TEOA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>가연성; 피부와 눈에 자극성; 연기 후드에서 작업</td></tr><tr><td>나트륨 수산화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL 진공 여과 컵, 0.2 &micro; 집에서 합성된 m PES Membrane</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td></td>는 <td>합성 방법에 대해 소스 33을 참조; 아르곤 아래에 보관</td>, Eosin Y 디소듐 염 Sigma-Aldrich E6003-25G 1-비닐-2-피롤리디논 (NVP)Sigma-Aldrich V3409-5G, 아르곤 아래에 저장; 발암성; 연기 후드에서 작업 3M 양면 테이프, 9500PC, 6.0 mil <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW 라이너</td><td>FLEXcon</td><td>양면</td><td>테이프 처리를 위한 FLX000620 백업</td></tr><tr><td>모델 SC 플로터(접착제 커터)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td>는 <td>커버 슬립을 페트리 접시에 연결하기 위해 링 모양으로 접착제를 절단하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 20mm 구멍이 있는 60mm 페트리 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>고강도 조명기 (백색 광원)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>파워 미터</td><td>Newport</td><td>1916-R</td>은 <td>백색광 소스를 사용할 때 524 nm에서 전력을 감지</td></tr>합니다<tr>. 파워 <td>미터와 함께 사용하기 위한</td><td>슬림 프로파일 완드 검출기</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>는 PDMS 금형을 만드는 데 사용됩니다. 방법은 소스 7을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 사</td><td>내에서</td><td></td> 합성된 40mm 라운드는 <td></td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescein, 2,000,000MW, 음이온성, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td> 방법에 대한 소스 7을 참조합니다. <td>2,000kDa는 5% 3.4kDa PEGDA 하이드로겔</td></tr><tr><td>1mL 주사기, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td>로 쉽게 확산되지 않습니다.<td></td></tr><tr><td>Acrodisc 주사 필터, 0.2 &micro; m Supor 멤브레인, 저단백질 결합</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>스티키-슬라이드 VI0.4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>하이드로겔을 수용하는 데 사용할 수 있는 미세유체 장치</td></tr></tbody></table>

혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

이 상세한 프로토콜은 PEGDA의 하이드로 겔에 포함 된 혈관 유래 미세 유체 네트워크의 제작을위한 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하의 구현을 설명합니다. 여기서는 영상 유도 레이저 제어를 허용 가상 마스크의 생성을 설명; 미세 유체 네트워크 제조 및 압력 헤드 구동 흐름에 적합한 micromolded PEGDA 하이드로 겔의 광중합; 펨토초 펄스의 Ti와 결합 시판의 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 설치 및 사용 : 하이드로 겔 저하를 유도 S 레이저; 그리고 제작 된 미세 유체 네트워크 촬상 형광 종 및 공 촛점 현미경을 사용. 이러한 복잡성의 번호를 포함하는 미세 가공을 위해 상용 현미경 사용에 중요한 단계는 같은 프로토콜의 대부분은 현미경 소프트웨어 및 현미경 매크로의 적절한 설정 및 구현에 집중된다. 이 techniqu의 영상 유도 구성 요소E함으로써 소재 미세 디자인 거의 모든 구성이 복잡한 마이크로 유체 시스템의 제작을 가능 3D 이미지 스택 또는 사용자가 생성 한 3D 모델의 구현을 허용한다. 조직 공학에 예상되는 영향으로,이 프로토콜에 설명 된 방법은 organ- 인간 - 온 - 어 - 칩 장치에 대한 고급 생체 모방 microtissue 구조의 제작에 도움을 수 있습니다. 생체 내 혈관의 복잡한 구조, 비틀림, 크기 및 밀도를 흉내 필수적 생물학적 전송 과정은 약물 약동학과 질병의 정확한 시험 관내 모델 선도 이러한 구조로 복제 될 수있다.

3 차원 혈관이 유래 미세 유체 네트워크를 생성하는 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하의 구현을 입증하기 위해, 우리는 칼을 예리하게 스캐닝 현미경 (KESM) (26), (27)를 통해 인수 한 마우스 뇌 혈관의 3D 이미지 스택을 사용 . 전술 한 바와 같이 미세 혈관 큰 데이터 세트의 선택된 3 차원 영역은 영상 유도 미세 망 형성을위한 가상 마스크의 시리즈로 전환시켰다. 제조 후, 생성 된 미세 유체 네트워크를 FITC 표지 2,000 kDa의 덱스 트란 용액으로 관류시키고, 공 초점 현미경을 통해 영상화. 네트워크 구조 (도 1a 및 C) 상기 제조 된 미세 유체 네트워크 (도 1b 및 D)를 정의 생체 내 혈관의 화상 스택 Z-돌기 (도 1A 및 B) 및 3D 렌더링 (도 1C를 생성하는 데 사용하고, 디 </strong&gt;). 이미지의 비교는 영상 유도, 레이저 기반 하이드로 겔 저하 크기, 비틀림 및 생체 내 혈관의 복잡한 구조를 요점을 되풀이 3D 생체 모방 미세 유체 네트워크의 제작을 가능하게 보여줍니다. 이 기술은 직경의 광범위한 네트워크를 포함하는 제조 의무가있다; 그림 1에서 3.3에서 직경 28.8 μm의에 이르기까지 다양한 채널이 생성되었습니다. 그림 1B의 왼쪽 상단에 그림 1D의 왼쪽 모서리에있는 큰 직사각형 구조가 네트워크에 흐름을 소개하는 입구 채널 있음을 유의하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> 그림 1 : 미세 유체 네트워크 혈관 유래. 마우스 뇌 혈관 (A 및 C)의 화상 스택으로부터 유도 가상 마스크의 시리즈는 FABRICA에 사용 된영상 유도 레이저 기반 열화 통해 PEGDA 하이드로 겔 (B 및 D)에 포함 된 생체 모방 차원 미세 네트워크 TE. 미세 유체 네트워크는 2,000 kDa의 FITC 표지 덱스 트란과 관류 및 공 초점 현미경을 통해 이미지화했다. Z-돌기 (A 및 B)와 두 개의 네트워크의 3D 렌더링 (C 및 D)의 농도, 조직 및 생체 내 혈관의 전체 구조 요점을 되풀이 미세 유체 네트워크를 생성 할 수있는 능력을 입증한다. 화살표 (D)는 덱스 트란을 소개하기 위해 만든 직사각형 입구를 표시합니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 우리는 유체 (F)을 시작하는 두 가지 방법, 압력 머리와 주사기 펌프를 구현이 포함 된 미세 유체 네트워크에서 낮은. 예를 들어, (30)가 30 ㎛의 직사각형 채널은 가압 헤드 (7)를 통해 구동되는 유체 흐름과 더불어, micromolded PEGDA 하이드로 겔 두 개의 웰 (도 2a)를 연결하는 제조 하였다. 웰에서 생성 된 좌, 압력 헤드가 오른쪽에있는 마이크로 채널을 통해 잘 유입을 유도. 도 2A, 테트라 메틸 (TRITC)의 초기 전면 - 표지에서 70 kDa의 덱스 트란이 경과 현미경을 사용하여 채널을 통해 이동이 관찰되었다. (가) 오른쪽의 잘에 채널을 통해 잘 왼쪽에서 나중에도 2b에, 10 μm의 직경 형광 폴리스티렌 구가 흘렀다. 상기 입구 잘 micromolded에 존재하는 유체의 체적에 의해 제어 흐름의 기간 및 유입구 사이에 발생하는 정압 구배에 의해 제어되는 유량과 잘 출구 micromolded 하이드로 압력 헤드 구동 흐름 간단한 방법을 제공한다 의 흐름에 대한duction 외부 하우징 또는 주사기 펌프 없이도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> 그림 2 : Micromolded PEGDA 하이드로 겔의 압력 헤드 구동 흐름. PEGDA는 임베디드 마이크로 의해 연결된 두 개의 웰을 포함하는 하이드로 겔을 형성하는 micromolded 하였다. 압력 헤드는에 잘 일에서 30 일까지 30 μm의 직사각형 채널을 통해 흐름 개시 잘 왼쪽 TRITC을 표지, 70 kDa의 덱스 트란 (A1-A3) 및 10 μm의 폴리스티렌 구 (B1-B3)에서 생성 된 다른. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 또한, 미세 유체 네트워크 내에서 일정한 유체 흐름을 생성, 주사기 펌프 구동 F로우는 주사기 펌프 인터페이스하기위한 입구 및 출구 포트 보조 미세 유체 소자 내부에 겔을 광중합에 의해 개시 될 수있다. 도 3a에, 시판되는 사전 제작 된 미세 유체 소자는 장치 (7)의 폭을 가로 질러 광중합 하이드로 겔의 1 mm 밴드 나타낸다. 레이저 기반 열화 하이드로 자립 여기 기술 된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 수납 하이드로 겔의 미세 유체 채널 네트워크를 제조하기 위해 구현되었다. 주사기 펌프 생성 흐름은 20 ㎛의 직경의 원통형 채널은 미세 유체 소자 내에 수용 하이드로 겔로 제조 된도 3b에서 알 수있다. 5 μL / s 유량이인가되면, 구체는 시야를 이동하는 반면 스트리킹 의해 입증이 20 μm의 직경 채널 개별 2 μm의 형광 폴리스티렌 스피어 용이 유체 흐름없이 (도 3B1)를 해결 (그림 3B2 &lt;/ STRONG&gt;). 이와 같은 접근법은 TRITC 표지의 유동을 모니터링하는 차원 혈관 유래 네트워크를 통한 흐름을 유도하기 위해 사용하고, 주위의 하이드로 겔 (도 3C)에 네트워크를 통해 확산 및 65 kDa의 덱스 트란. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> 그림 3 : 미세 유체 하우징에 PEGDA 히드로 겔 중합 된 주사기 펌프 구동 형 흐름. 17 X 3.8 X 0.53 mm (X, Y, Z) 마이크로있는 시판 미리 제조 된 미세 유체 소자 (A)는로 표시되는 광중합 1 X 3.8 X 0.53 mm (X, Y, Z) PEGDA 하이드로 겔을 수납 검은 색 화살표. 20 ㎛의 직경의 실린더 형 채널은 하이드로 겔을 분해시키고, 2 ㎛의 폴리스티렌 스피어는 장치 (B)를 통해 펌핑 하였다. 구체 명확 유체 흐름 (B1)없이 해결되지만, 5 μL / s의 유속에 줄무늬로 나타나는(B2). 다른 수납 하이드로 겔에서는 2 차원 혈관 유래 네트워크를 제작하고, TRITC 표지 된 65 kDa의 덱스 트란 네트워크 (C)를 통해 펌핑 하였다. 저속 현미경은 채널을 가득 주변으로 확산 하이드로 겔로 형광 덱스 트란을 모니터링 하였다. (B) 및 (C)의 흰색 화살표는 유체의 흐름 방향을 나타낸다. (C)의 교정 바는 형광 덱스 트란의 강도를 나타냅니다. 스케일 바 (C)에서 (B1)에서 20 μm의 (B2) 및 50 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA) 하이드로겔에 내장된 혈관 유래 생체 모방 미세유체 네트워크를 제조하기 위해 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 구현하는 방법을 설명합니다. 이러한 생체 모방 미세유체 시스템은 조직 공학 응용 분야, 체외 질환 모델 생성 및 고급 "온칩" 장치 제작에 유용할 수 있습니다.

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 펨토초 펄스 레이저가 장착된 공초점 현미경을 사용하여, 이미지 가이드 레이저 기반 분해 방식을 통해 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 하이드로겔 내에 내장된 3차원 혈관 유래 생체 모방 미세유체 네트워크를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 합성 구조물 내에서 생체 내 혈관의 밀도, 굴곡도, 크기 범위 및 전체적인 구조를 정확하게 재현하는 3차원 생체 모방 미세유체 네트워크를 생성할 수 있다는 점입니다. 이러한 미세유체 제작 접근 방식은 더욱 생체 내와 유사한 조직 공학 구조물, 생체 모방 질환 모델 및 초고밀도 칩 상 장치를 생성하는 능력을 발전시킬 것입니다.현미경 소프트웨어의 적절한 설정과 구현은 직관적이지 않지만, 원하는 미세유체 네트워크를 형성하는 데 매우 중요하므로 이 방법에 대한 시각적 시연이 필수적입니다. 가상 마스크 생성, 현미경 구성 및 현미경 소프트웨어로의 가상 마스크 업로드를 포함한 많은 준비 단계가 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. PEGDA 하이드로겔을 광중합시키려면, 먼저 바닥에 20 millimeter 구멍이 뚫린 60 millimeter 페트리 접시에 양면 접착제 링을 부착하십시오.다음으로, 흄 후드 내에서 호일로 덮인 2 mL 갈색 원심분리 튜브에 TEOA가 포함된 HBS 1 mL를 넣습니다. 그런 다음, 1 mM Eosin Y disodium salt 10 µL를 튜브에 추가합니다. 이제 유리 피펫을 사용하여 NVP 소량을 유리 비커에 옮깁니다.이 부피에서 NVP 3.5 µL를 취해 혼합물에 옮깁니다. 그다음, 호일로 덮인 두 번째 튜브에 3.4 kDa PEGDA 10 mg을 넣습니다. 이어서 혼합물 0.2 mL를 추가하여 5% w/v PEGDA 전중합체 용액을 만듭니다.이제 PEGDA가 완전히 용해될 때까지 프리폴리머 용액을 볼텍싱합니다. 그 다음, 기포가 생기지 않도록 주의하며 60 µL를 PDMS 몰드 위에 피펫으로 분주합니다. 이제 PDMS 스페이서 위의 용액 중앙에 아크릴화된 40 mm 1.5번 유리 커버슬립을 배치합니다.그 후, 95 milliwatts가 출력되도록 보정된 백색 광원 아래에 조립체를 배치합니다. 폴리머를 3분 동안 경화시킵니다. 다음으로, 몰드와 커버슬립 사이에 증류수를 흘려 하이드로젤을 PDMS에서 분리하고 하이드로젤을 헹궈냅니다.그런 다음, 하이드로젤에서 물이 흡수되지 않도록 주의하며 커버슬립의 가장자리를 조심스럽게 닦아 건조시킵니다. 이제 준비된 페트리 접시에 커버슬립을 부착합니다. 약간의 압력을 가하면 도움이 됩니다.그런 다음, 하이드로젤을 증류수에 담급니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저 주사 공초점 현미경을 설정하고 하이드로젤 시각화 구성으로 시작합니다. 이어서 하이드로젤과 페트리 접시를 스테이지 인서트에 맞게 고정하고 스테이지 위에 올립니다.다음으로, 페트리 접시에 최소 5 mL의 증류수를 채우고, 수침 렌즈를 하이드로젤과 접촉하지 않도록 하이드로젤 바로 위까지 내립니다. 이제 'live'를 클릭하여 아르곤 레이저 라인을 켭니다. 그런 다음, 하이드로젤 상단에서 Eosin Y 신호가 보일 때까지 하이드로젤의 초점을 맞춥니다.하이드로젤을 더 쉽게 찾으려면 출력 퍼센트나 핀홀 크기를 일시적으로 늘려 보십시오. 하이드로젤의 상단과 하단, 그리고 웰의 바닥 위치를 표시합니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 가로 방향으로 이동하며 웰의 가장자리를 찾으십시오.초점 창에서 Z 위치 상자 옆의 아래쪽 화살표를 사용하여 하이드로젤 내의 초점 평면을 150 microns 아래로 내립니다. 다음 단계가 매우 중요합니다. 스테이지 창에서 X 및 Y 위치를 0으로 설정한 다음, 표시된 다른 모든 위치를 삭제하고 0으로 설정된 위치만 표시합니다.이제 유입 채널 형성 과정을 시작하기 위해, 먼저 이미지를 캡처한 다음 영역 창의 사각형 버튼을 사용하여 혈관 네트워크의 유입구가 될 영역의 외곽선을 그립니다. 그런 다음 채널 형성 설정으로 이동하십시오. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다.해당 화면으로 이동한 후, Z 스택 창 상단의 중앙 버튼과 offset 버튼을 클릭하여 현재 위치에서 Z 스택의 중심을 맞춥니다. 그다음, 필요한 인렛 크기에 따라 간격을 1로 설정하여 슬라이스 수를 지정합니다. 이제 속도가 3으로 설정되어 있는지, 그리고 출력 퍼센트(percent power)가 100%로 설정되어 있는지 확인하십시오.그런 다음 설정을 저장하고 실험 시작 버튼을 클릭하십시오. 채널의 분해 과정 동안 하이드로겔을 시각화하려면, 시야 영역이 검은색인 경우 채널 창에서 gain master를 높이고, 영역이 흰색인 경우 gain master를 낮추십시오. 분해 후에는 하이드로겔 시각화 설정으로 돌아가 live를 클릭하여 입구가 형성되었는지 확인하십시오.먼저, regions 창에서 가상 마스크의 Z 스택으로부터 임의의 ovl 파일을 불러온 다음, 화살표 버튼을 클릭하여 시야 내의 ROI를 확인합니다. 그런 다음, live를 클릭하여 하이드로젤 시각화 구성을 스캔하고, 조이스틱이나 stage 창을 사용하여 하이드로젤의 입구가 혈관 네트워크 내의 정확한 위치에 연결되도록 배치합니다. 다음으로, focus 창의 step size를 이용해 아래쪽 화살표를 클릭함으로써, 이전의 중심 Z 위치에서 50 µm 아래인 현미경 매크로의 첫 번째 초점 평면으로 내립니다.다시 한번, 현재 X 및 Y 위치를 재영점화하고, 표시된 다른 모든 위치를 삭제한 후, 이 위치만을 새로운 영점으로 표시하는 것이 매우 중요합니다. 이 새로운 설정을 반드시 저장하십시오. 이제 채널 형성 설정에서 시계열 및 블리칭 윈도우(bleaching windows)만 선택하십시오.다음으로, 매크로를 열고 저장 탭을 선택합니다. 이전에 작성한 레시피를 선택하고 적용을 클릭합니다. 저장(store)을 클릭하면 레시피가 덮어쓰여지므로 주의하십시오.설정을 확인한 후, 채널 형성 구성을 다시 저장하고 현미경 매크로에서 update를 클릭하십시오. 현재 위치 목록을 덮어쓰겠냐는 물음에 no를 클릭한 다음, 현미경 매크로의 start를 클릭하여 레시피를 시작하십시오. 분해 과정이 완료되면, 하이드로겔의 고유한 Eosin Y 신호보다 더 밝은 신호를 나타내는 FITC 표지 dextran을 관찰할 수 있도록 더 낮은 레이저 출력의 하이드로겔 시각화 구성을 사용하십시오.형광 표지된 덱스트란을 주입하기 전에, 하이드로젤 웰에서 물을 일부 흡수하여 제거합니다. 그 다음, 여과된 FITC 표지 덱스트란 10 µL를 피펫으로 넣습니다. 설명된 절차는 대량의 미세혈관 이미지를 이미지 안내 미세유체 네트워크 형성을 위한 일련의 가상 마스크로 변환하는 데 사용되었습니다.결과적으로 제작된 미세유체 네트워크를 기반이 된 생체 내 혈관 구조와 비교하였습니다. 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 통해 생체 내 혈관의 크기, 굴곡도 및 복잡한 구조를 재현하는 3D 생체 모사 미세유체 네트워크를 제작할 수 있었습니다. 이러한 내장형 미세유체 네트워크 내에 유체 흐름을 유도하기 위해 압력 헤드와 시린지 펌프가 모두 사용되었습니다.형광 표지된 70 kilodalton dextran과 10 micron polystyrene beads가 압력 수두 유도 흐름에 의해 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하는 것을 관찰하였습니다. 대안적으로, 보조 미세유체 장치 내부에서 하이드로젤을 광중합하여 시린지 펌프 구동 흐름을 개시하였습니다. 여기에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여, 레이저 기반 분해를 구현함으로써 하이드로젤 내에 2D 혈관 유래 네트워크를 제작하였으며, 이를 통해 시린지 펌프 구동 흐름 및 65 kilodalton dextran의 관류를 확인하였습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 이미지 유도 레이저 기반 하이드로젤 분해를 통해 생체 모사 미세유체 네트워크를 생성하기 위해 펨토초 펄스 레이저가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 분해하려는 하이드로젤 조성에 따라 출력, 파장, 스캔 속도를 포함한 레이저 파라미터를 조정하고 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

우리는 PDMS 기질에 패턴화된 제니핀과 피브로넥틴을 미세유체 증착하는 방법을 제시하여 혈관 평활근 세포 밀집형 조직의 생존력을 연장할 수 있습니다. 이 조직 제조 방법은 이전의 혈관 근육 박막 기술과 결합되어 질병 관련 시간 경과에 대한 혈관 수축성을 측정합니다.

미세 패턴 혈관 근육 박막의 확장 문화 미세 유체 Genipin 증착 기술

이 논문은 내피 세포의 생리 학적 특성을 요점을 되풀이 미세 혈관을 설계하는 사출 성형 방법을 제공한다. 미세 유체 기반의 공정은 흐름, 세포 성분, 형상, 생화학 그라디언트로 테일러 조건과 특허 3 차원 혈관 네트워크를 생성합니다. 제조 공정 및 잠재적 응용 예들이 설명된다.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

프로토콜에는 회전 타원 체에 perfusable 혈관 네트워크를 설계 하는 방법을 설명 합니다. 회전 타원 체의 주변 microenvironment 신생 유도 microchannels 미세 장치에는 회전 타원 체 연결을 고안 이다. 메서드를 사용 하면 3 차원 문화에 오랫동안 기다려온 기술 회전 타원 체의 관류를 수 있습니다.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 종양온어칩(tumor-on-a-chip) 모델을 제시하여 고처리량 기초 및 중개 인간 암 연구를 수행하고, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 로딩, 유지 관리 및 평가 절차에 대한 설명과 함께 맞춤형 의학 접근법을 발전시킵니다.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

여기에서는 전폐절제술을 모방하도록 설계된 OOC(Organ-on-Chip) 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 글리코칼릭스 손상과 전폐절제술 후 합병증 사이의 잠재적 상관관계를 조사합니다.

3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

배우세요 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 사용하여 PEGDA 하이드로겔 내 혈관 유래 생체 모방 미세 유체 네트워크를 제조하는 방법을 익히세요. 이 기술은 조직 공학 및 질병 모델링 연구에 활용됩니다.

혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

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