혈관 유래 미세 유체 네트워크의 이미지 유도, 레이저 기반의 제조

이 프로토콜의 전반적인 목표는 펨토초 펄스 레이저가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 유도 레이저 기반 분해를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 하이드로겔에 내장된 3차원 혈관 유래 생체 모방 미세유체 네트워크를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술의 중요한 장점은 합성 구조물에서 생체 내 혈관 구조의 밀도, 비틀림, 크기 범위 및 전체 구조를 정확하게 요약하는 3차원 생체 모방 미세유체 네트워크를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 미세유체 제조 접근 방식은 조직 공학 구조, 생체 모방 질병 모델 및 초고밀도 칩 장치와 같은 생체 내에서 더 많은 것을 생성할 수 있는 능력을 향상시킬 것입니다.

현미경 소프트웨어의 적절한 설정 및 구현은 직관적이지 않고 원하는 미세유체 네트워크를 형성하는 데 중요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 가상 마스크 생성, 현미경 구성, 현미경 소프트웨어에 가상 마스크 업로드를 포함한 많은 준비 단계가 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. PEGDA 하이드로겔을 광중합하려면 먼저 바닥에서 20mm 구멍이 뚫린 60mm 페트리 접시에 양면 접착제 링을 부착합니다.

다음으로, 흄 후드에서 TEOA가 포함된 HBS 1ml를 호일로 덮인 2밀리리터 호박색 원심분리기 튜브에 추가합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 1밀리몰 Eosin Y 디소듐 염을 튜브에 추가합니다. 이제 유리 피펫을 사용하여 소량의 NVP를 유리 비커에 피펫팅합니다.

이 부피에서 3.5 마이크로 리터의 NVP를 가져 와서 혼합물로 옮깁니다. 다음으로, 10mg의 3.4 킬로달톤 PEGDA를 두 번째 호일로 덮인 튜브에 추가합니다. 그런 다음 혼합물 0.2ml를 추가하여 5% 중량 부피 PEGDA 프리폴리머 용액을 만듭니다.

이제 PEGDA가 완전히 용해될 때까지 프리폴리머 용액을 볼텍스합니다. 그런 다음 기포 없이 PDMS 금형에 60마이크로리터를 피펫팅합니다. 이제 아크릴로 된 40mm 숫자 1.5 유리 커버슬립을 PDMS 스페이서의 용액 중앙에 놓습니다.

그런 다음 95밀리와트를 전달하도록 보정된 백색 광원 아래에 어셈블리를 놓습니다. 폴리머를 3분 동안 경화시킵니다. 다음으로, 금형과 커버슬립 사이에 증류수를 흐르게 하여 PDMS에서 하이드로겔을 분리하고 하이드로겔을 헹굽니다.

그런 다음 하이드로겔에서 물을 흡수하지 않도록 커버슬립의 가장자리를 조심스럽게 두드려 건조시킵니다. 이제 준비된 페트리 접시에 커버 슬립을 부착하십시오. 약간의 압력이 도움이 됩니다.

그런 다음 하이드로겔을 증류수에 담그십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정하고 하이드로겔 시각화 구성에서 시작합니다. 그런 다음 하이드로겔과 페트리 접시를 무대 인서트에 끼우고 무대에 놓습니다.

다음으로, 페트리 접시에 최소 5ml의 증류수를 채우고 하이드로겔과 접촉하지 않도록 수침 대물렌즈를 하이드로겔 바로 위까지 낮춥니다. 이제 라이브를 클릭하여 아르곤 레이저 라인을 켭니다. 그런 다음 하이드로겔의 윗면에서 Eosin Y 신호가 보일 때까지 하이드로겔에 초점을 맞춥니다.

하이드로겔을 찾는 데 도움이 되도록 백분율 출력 또는 핀홀 크기를 일시적으로 늘려 보십시오. 하이드로겔의 상단과 하단, 그리고 웰 바닥의 위치를 표시하십시오. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 가로로 이동하고 우물의 가장자리를 찾습니다.

초점 창에서 Z 위치 상자 옆에 있는 아래쪽 화살표를 사용하여 하이드로겔 내에서 초점면을 150미크론 아래로 떨어뜨립니다. 다음 단계는 매우 중요합니다. 스테이지 창에서 X 및 Y 위치를 0으로 만든 다음 표시된 다른 모든 위치를 삭제하고 0으로 설정된 위치만 표시합니다.

이제 주입 채널을 형성하는 프로세스를 시작하려면 먼저 이미지를 스냅한 다음 영역 창의 사각형 버튼을 사용하여 혈관 네트워크의 주입구가 될 영역을 간략하게 표시합니다. 그런 다음 채널 형성 구성으로 이동합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.

일단 Z 스택 창에서 오프셋 상단과 위쪽에 있는 가운데 버튼을 클릭하여 Z 스택을 현재 위치의 중앙에 배치합니다. 그런 다음 Inlet이 얼마나 커야 하는지에 따라 1 간격으로 슬라이스 수를 설정합니다. 이제 속도가 3으로 설정되어 있고 백분율 전력이 100으로 설정되어 있는지 확인하십시오.

그런 다음 구성 저장을 진행하고 실험 시작 버튼을 클릭합니다. 채널이 저하되는 동안 하이드로겔을 시각화하려면 시야의 영역이 검은색인 경우 채널 창에서 게인 마스터를 늘리거나 영역이 흰색인 경우 게인 마스터를 줄입니다. 성능 저하 후 하이드로겔 시각화 구성으로 돌아가서 live를 클릭하여 입구가 형성되었는지 확인합니다.

먼저 영역 창에서 가상 마스크의 Z 스택에서 ovl 파일을 로드하고 화살표 버튼을 클릭하여 시야에서 ROI를 확인합니다. 그런 다음 라이브를 클릭하여 하이드로겔 시각화 구성을 스캔하고 조이스틱 또는 스테이지 창을 사용하여 하이드로겔을 배치하여 주입구가 혈관 네트워크 내의 올바른 위치에 연결되도록 합니다. 다음으로, 초점 창의 단계 크기를 사용하고 아래쪽 화살표를 클릭하여 이전 중앙 Z 위치에서 50미크론 아래에 있는 현미경 매크로의 첫 번째 위치로 초점면을 드롭합니다.

다시 말하지만, 이제 X 및 Y 위치를 다시 영점화하고, 표시된 다른 모든 위치를 삭제하고, 이 위치만 새 영점으로 표시하는 것이 중요합니다. 이 새 구성을 저장해야 합니다. 이제 채널 형성 구성에서 시계열 및 표백 창만 선택합니다.

그런 다음 매크로를 열고 저장 탭을 선택합니다. 이전에 만든 레시피를 선택하고 적용을 클릭합니다. 스토어를 클릭하지 마십시오. 그렇지 않으면 레시피를 덮어씁니다.

설정을 확인한 후 채널 형성 구성을 다시 저장한 다음 현미경 매크로에서 업데이트를 클릭합니다. 현재 위치 목록을 덮어쓰려면 no를 클릭한 다음 microscope 매크로에서 start를 클릭하여 레시피를 시작합니다. 분해 과정이 완료된 후 더 낮은 레이저 출력에서 하이드로겔 시각화 구성을 사용하여 하이드로겔의 기본 Eosin Y 신호보다 더 밝은 신호를 가진 FITC 표지 덱스트란을 볼 수 있습니다.

형광으로 표지된 덱스트란을 도입하기 전에 하이드로겔의 우물에서 약간의 물을 흡수합니다. 그런 다음 여과된 FITC 표지 덱스트란 10마이크로리터에 피펫팅합니다. 설명된 절차는 대량의 미세혈관 이미지를 이미지 유도 미세유체 네트워크 형성을 위한 일련의 가상 마스크로 변환하는 데 사용되었습니다.

생성된 미세유체 네트워크는 그것이 파생된 생체 내 혈관 구조와 비교되었습니다. 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 통해 생체 내 혈관 구조의 크기, 비틀림 및 복잡한 구조를 재현하는 3D 생체 모방 미세유체 네트워크를 제작할 수 있었습니다. 압력 헤드와 주사기 펌프는 모두 이러한 임베디드 미세유체 네트워크에서 유체 흐름을 시작하는 데 사용되었습니다.

형광 표지된 70킬로달톤 덱스트란과 10미크론 폴리스티렌 비드가 압력 헤드 유도 흐름에 의해 왼쪽에서 오른쪽으로 이동하는 것이 관찰되었습니다. 대안적으로, 주사기 펌프 구동 흐름은 2차 미세유체 장치 내부의 하이드로겔을 광중합하여 시작되었습니다. 여기에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 레이저 기반 분해를 구현하여 주사기 펌프 구동 흐름 및 65킬로달톤 덱스트란의 풍부함을 위해 하우징된 하이드로겔에 2D 혈관 유래 네트워크를 제작했습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 펨토초 펄스 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 유도 레이저 기반 하이드로겔 분해를 사용하여 생체 모방 미세유체 네트워크를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 출력, 파장 및 스캔 속도를 포함한 레이저 매개변수는 분해되는 하이드로겔 제형에 따라 조정 및 최적화되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

당신의 실험에 감사하고 행운을 빕니다.