해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

이 절차의 전반적인 목표는 광학 현미경과 전자 현미경 방법의 조합을 수행하여 석회화 이벤트의 위치와 구조를 결정하는 것입니다. 이는 세포 내 pH 및 칼슘 신호에 민감한 형광 지표를 사용하여 감지할 수 있는 석회화를 담당하는 생애 단계인 변태 동안 살아있는 유충관 벌레를 모니터링하여 수행됩니다. 세포 내 pH 이미징을 통해 석회화 과정에서 세포질 안팎으로 양성자의 농도를 연구할 수 있습니다.

우선, 해양 튜브 벌레 유충의 세포 내 pH 이미징, 유능한 수영 유충은 세포 내 pH 지시약 염료인 SNARF-1 AM으로 염색됩니다. 그런 다음 유충을 얇은 유리 관찰 창이 있는 바닷물이 담긴 IBMX 접시로 옮기고 형광 현미경에 올려 염료에 흡수되는 488나노미터 파장의 빛에 부딪힙니다. 염료에서 580나노미터 및 640나노미터 배출물이 수집됩니다. 세포 내 pH의 값은 이러한 값의 비율로부터 계산될 수 있습니다.

광학 현미경을 사용하면 더 높은 pH 수준과 관련된 시간 및 조직 영역을 식별할 수 있습니다. 이는 추가 분석을 위해 관심 시점을 결정하기 위한 첫 번째 단계입니다. 두 번째 단계에서는 전자 현미경 검사와 관련된 시점에 고정제로 튜브 웜을 보존합니다.

칼슘 신호에 대한 SEM-EDS 매핑을 사용하여 새롭게 광물화되는 수명 단계가 확인됩니다. 그런 다음 칼슘 신호가 높은 영역을 SEM/EBSD를 사용하여 스크리닝하여 결정질 광물의 존재를 확인합니다. 마지막으로, 집속 이온 빔을 사용하여 광물을 절단하고 TEM 관찰을 위해 얇은 부분을 준비합니다.

이 섹션은 선택적 영역 회절 패턴을 얻는 데 사용됩니다. 이 기술 또는 벌크 X선 회절 분광법과 같은 기존 테스트 방법의 주요 장점은 광학 및 전자 현미경 방법으로 관찰된 특정 구조를 직접 관찰할 수 있으므로 개별 석회화 현상을 시간 및 공간 수준에서 직접 연구할 수 있다는 것입니다. 칼슘 및 세포 내 pH 지표로 석회화를 연구할 때 이러한 관련 생리학적 사건의 시간 척도를 식별할 수 있습니다.

적시에 검체를 보존하는 것은 유익한 SEM 분석을 위해 매우 중요합니다. 생물학적 석회화의 첫 번째 사건을 찾을 때 SEM/EDX는 칼슘의 원소 분포를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 칼슘이 더 많은 위치는 탄산칼슘의 존재를 나타낼 수 있지만 X선 회절 패턴의 존재만이 결정 구조가 있음을 확인할 수 있습니다.

이러한 정보는 EBSD 및 TEM을 사용하여 얻을 수 있습니다. 전자 후방 산란 회절은 미세 구조 및 전자 REM 각도가 브래그 회절 조건을 충족하는 한 결정질 또는 다결정 물질을 식별하기 위한 결정학적 특성화 기술입니다. 일반적으로 후방 산란 전자는 입자 또는 결정 배향 맵이 있는 연마된 표본에서 70도 각도의 기울기로 수집됩니다.

다듬어지지 않은 샘플의 경우 모든 서비스 시리즈가 EBSD 각도 요구 사항을 충족하는 것은 아니기 때문에 이러한 고르지 않은 표면에서 이러한 맵을 생성하는 것이 어렵습니다. 그러나 점 IG의 형태로 EBSD 각도 요구 사항이 충족되는 한 이러한 고르지 않은 표면에서 Cacucci 회절 패턴을 계속 수집할 수 있습니다. Cacucci 회절 패턴은 결정질 광물이 존재한다는 명확한 확인을 제공합니다.

우리의 방법은 직접적이고 빠르며 다른 광물화 조직에 암시될 수 있습니다. 여기서 집속 이온 빔은 마이크로샘플을 제조하는 데 사용되며, 이는 TEM 섹션을 준비하는 매우 직접적인 방법이기도 합니다. 변태 과정을 조사하기 위해 약 5일 동안 실험실에서 튜브 웜을 배양했습니다.

유능한 유충은 원을 그리는 대신 앞으로 헤엄칠 것입니다. 이것은 그들이 변태할 준비가 되었다는 것을 의미합니다. 유능한 유충을 바닷물의 형광 용액에 배양하고 용기를 호일로 덮어 광표백을 방지하고 밤새 동물을 배양합니다.

튜브 웜 유충은 유충을 유지하지만 용액이 통과할 수 있도록 하는 나일론 메쉬에 대해 세척됩니다. 여과된 해수로 유충을 두 번 씻어 과도한 염료 용액을 제거합니다. 여과기를 페트리 접시에 눌러 단단히 밀봉한 후 밀봉을 해제하여 세척 용액을 버리십시오.

유충이 건조되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 10-20마리의 유충을 IBMX로 얇은 유리 바닥 접시에 각각 넣고 이미징할 때까지 접시를 덮습니다. 다음으로, 형광 신호를 감지하기 위해 적절한 이색성 미러와 함께 적절한 필터 큐브를 삽입합니다.

살아있는 유기체의 이미지를 캡처할 수 있을 만큼 충분히 빠르도록 셔터 시간을 최적화합니다. 다음으로, Z-Stack 옵션에서 광학 절편 매개변수를 선택하고 현미경 스테이지를 위아래로 이동하여 이미지 획득의 시작 및 중지 위치를 정의합니다. 레이어 사이에 1마이크로미터 거리를 설정합니다.

이미징 후 모든 데이터를 회색조 TIF 파일로 내보냅니다. 이 작업은 파일, 내보내기를 선택하여 수행할 수 있습니다. 파일 형식이 TIF 이미지로 표시되는지 확인한 다음 시작을 클릭합니다.

Z-Stack의 각 레이어에 있는 각 채널의 그레이스케일 이미지는 이미지 분석을 위해 준비된 동일한 이미지 폴더에 있습니다. 마지막으로, ImageJ를 사용하여 각 형광 채널에 대한 합성 이미지를 생성합니다. 다음 JoVE 비디오는 세포 내 pH에 대한 보정 및 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

바닷물에 4%파라포름알데히드 용액을 사용하여 가교 고정제를 사용하여 변태를 겪고 있는 튜브 웜을 보존합니다. 16%파라포름알데히드 1부를 바닷물 3부에 섞고 하룻밤 동안 고정시키기만 하면 됩니다. 1차 고정제를 폐기하고 조직 구조를 더욱 안정화하기 위해 1% 사산화오스뮴 수용액에 30분 동안 검체를 다시 고정합니다.

흄 후드에서 작업하고 명확하게 표시된 별도의 폐기물 병을 준비하고 포름알데히드와 사산화오스뮴을 준비하십시오. 다음으로, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 샘플을 탈수하고 교체 사이에 5분을 허용합니다. 다음 단계는 에탄올과 HMDS의 1:1 용액으로 시료를 건조하여 시료를 덮을 수 있을 만큼만 탈수

흄 후드에서 표본이 건조될 때까지 기다린 다음 순수 HMDS로 절차를 반복합니다. 샘플의 통제된 골절을 만들려면 다이아몬드 블레이드를 접시에 대고 몇 명의 개체를 둘러싸고 삼각형 절단을 만듭니다. 페트리 접시를 덮은 상태에서 배양 접시를 알루미늄 스텁에 놓고 부드럽게 눌러 제어된 골절을 만듭니다.

해부 현미경을 사용하여 관찰하고 몇 가지 손상되지 않은 튜브 벌레가 들어 있는 골절 조각을 조심스럽게 집어 올립니다. 은색 페인트로 샘플을 SEM 샘플 홀더에 붙이고 가장자리 주위를 은색 페인트로 칠하여 충전을 줄입니다. 이제 SEM-EDS 분석을 위해 샘플을 이미지화할 준비가 되었습니다.

s를 삽입하십시오.amp홀더에 있는 현미경에 넣습니다. 샘플의 방향을 지정하고 샘플을 전자 컬럼 아래에 놓습니다. VP SEM 모드에서 샘플을 분석합니다.

필요에 따라 초점과 난시를 최적화합니다. 단일 유기체가 전체 시야를 채우도록 배율을 선택합니다. 전체 시야의 지도를 획득하여 샘플에 대한 칼슘의 원소 분포를 분석하고, 15분 이상 또는 데이터가 유기체 내 칼슘의 뚜렷한 국소화를 보여줄 때까지 지도를 실행합니다.

관심 영역에 대한 포인트 수량화를 얻으려면 Single Point 도구를 사용하여 Point ID 옵션을 선택합니다. 관심 영역을 클릭하여 스캔을 수행합니다. 배율을 줄이면서 일련의 이미지를 캡처하여 위치를 주의 깊게 기록하십시오.

EBSD용 샘플을 준비하려면 평평한 SEM 홀더에서 샘플을 제거하고 은색 페인트를 사용하여 45도 미리 기울어진 스터브에 붙입니다. 참조 SEM 이미지를 사용하여 관심 동물과 검사할 동물의 정확한 영역을 찾습니다. s를 기울입니다.tage 이제 샘플 표면이 전자빔에 대해 약 70도가 되도록 합니다.

무대를 올리세요. AZtec 소프트웨어에서 EBSD 모드를 선택합니다. 관심 단계로 아라고나이트를 선택하십시오.

EBSD 카메라를 삽입하고 약 90%의 신호를 달성하도록 카메라 조건을 설정합니다.빠른 빔 래스터를 사용하여 배경을 획득한 다음 Aztec에서 이미지를 캡처합니다. Spot Analysis 도구를 사용하여 더 높은 칼슘 신호를 보인 샘플의 위치를 클릭합니다. Cacucci 패턴이 감지되었는지 스캔합니다.

패턴이 존재하고 데이터베이스에서 선택한 단계 중 하나와 일치하면 자동으로 인덱싱됩니다. 집속 이온 빔을 사용하여 마이크로샘플 준비를 진행하기 전에 스퍼터 코팅으로 준비된 SEM 시료를 백금 층으로 보호합니다. 샘플을 FIB SEM 챔버에 삽입하고 샘플을 배치한 다음 살아있는 이온 유도 2차 전자 이미지를 획득합니다.

EBSD의 EDS 매핑에 의해 이전에 결정된 대로 참조된 이미지에서 관심 영역을 찾습니다. 필요에 따라 스테이지를 회전하여 창의 프레임과 일치하는 관심 있는 기능을 얻고, 관심 있는 기능을 수용할 수 있는 영역을 표시하도록 배율을 조정한 다음 탄소와 텅스텐을 증착할 상자를 정의합니다. FIB 스냅샷을 캡처한 다음 텅스텐 캡 주위에 4개의 상자 패턴을 그려 마이크로샘플링 위치를 정의합니다.

그런 다음 스테이지를 58도로 기울이고 마이크로샘플의 바닥을 자릅니다. 스테이지를 다시 0으로 기울이고 텅스텐 마이크로샘플링 프로브를 삽입한 다음 샘플에 닿을 때까지 내립니다. 프로브 끝과 텅스텐 코팅 사이에 텅스텐을 증착하여 텅스텐 프로브와 샘플을 연결 한 다음 최종 절단을 수행하고 섬의 나머지 부분에서 마이크로 샘플을 분리하고 첨부 된 마이크로 샘플로 프로브를 들어 올립니다.

TEM 구리 하프 그리드를 측면 입구 홀더에 놓고 마이크로샘플이 TEM 그리드에 접촉할 때까지 텅스텐 프로브를 내립니다. 마이크로샘플은 전자가 투명해질 때까지 더 밀링됩니다. TEM 분석 전에 두 듀어를 액체 질소로 채우고 가속 전압을 300킬로볼트로 설정합니다.

라멜라가 부착된 하프 그리드를 표준 TEM 홀더에 놓습니다. 빔을 형광체 스크린의 중앙에 배치하고 빔을 수축 및 확장하며 모든 빔 이동이 동심원이 되도록 합니다. 스테이지 이동 노브를 사용하여 샘플을 탐색 및 찾고, 샘플의 배율을 높이고, 샘플에 초점이 맞춰질 때까지 Z-Height를 조정합니다.

필요에 따라 광학 접안렌즈를 사용하십시오. 카메라를 삽입하고 형광체 스크린을 제거합니다. 카메라의 과포화를 방지하기 위해 필요에 따라 빔을 확장합니다.

초점과 카메라 매개변수를 조정하여 이미지를 캡처합니다. 회절 패턴을 획득하려면 관심 피처를 중앙에 배치하고 대물렌즈 조리개를 제거한 다음 회절 조리개를 삽입합니다. 회절 렌즈 모드로 변경합니다.

회절 패턴의 중심이 카메라 또는 형광체 스크린을 태우는 것을 방지하기 위해 블랭커를 삽입합니다. 결정학적 분석을 위해 패턴의 이미지를 캡처합니다. 다음은 튜브 웜의 변태 중 석회화 과정에 대한 몇 가지 관찰 결과입니다.

튜브 웜의 pH 값은 IBMX 변태 자극 후 증가했으며 세포 내 pH가 31시간에 8 이상으로 증가하기 시작했습니다. 석회화와 관련된 조직은 칼라 영역입니다. SEM-EDS 신호에 대한 지도는 1일차 튜브 벌레가 칼슘의 균일한 분포를 가지고 있음을 보여주며, 이는 석회화 과정이 아직 시작되지 않았음을 나타냅니다.

변태 자극 2일 후 일부 튜브 벌레는 이미 너무 많이 석회화되어 더 이상 새로 석회화된 물질을 관찰하기에 적합하지 않습니다. 이 예시에 사용된 것과 같은 튜브 웜 표본에서 석회화는 아직 초기 단계이므로 칼슘 정량화는 미네랄의 존재를 특성화하기 위한 관심 위치를 결정하는 데 도움이 되었습니다. SEM-EBSD를 사용하여 검사했을 때, 강한 칼슘 신호가 있는 국소 영역도 아라고나이트의 결정 구조를 가지고 있었습니다.

집속 이온 빔을 사용하여 TEM에 대해 표본을 준비하고 아라고나이트 광물의 회절 패턴을 보다 결정학적으로 자세히 분석했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다세포 유기체에서 광물화 이벤트를 찾는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 광학 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하면 석회화 과정에 대한 높은 수준의 생리학적, 물질적 이해를 얻을 수 있습니다.