Name: 해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: 학습하세요 해양 tubeworm의 석회화 과정을 라이브 광학 및 전자 현미경 기술로 분석하는 방법을. Hydroides elegans를 사용하여 생체 광물화 메커니즘과 세포 내 pH 변화를 직접 관찰할 수 있습니다.

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저자는 Clemson Broadcast Productions, J. Bright의 오디오 녹음, A. D. McQuiston의 내레이션, 오디오 감미료, K. Murphy, G. Spake의 비디오 촬영, T. Messervy의 그래픽 아트, T. Messervy와 E. Rodgers의 비디오 편집에 큰 감사를 표합니다. 기술 지원 및 과학적 조언은 S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane 및 R. Dineshram의 조언에서 영감을 받았습니다. 이 연구는 HKSAR-RGC의 3가지 GRF 보조금(보조금 번호: 705511P, 705112P 및 17304914)의 지원을 받았습니다.

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라이브 광학 영상은 다세포 생물의 세포 이벤트를 관찰하는데 유용한 방법이다. 여기서, 내부 pH 및 칼슘 이온 지표 광물 부위에서의 이온 플럭스를 측정하기 위해 사용되었다. 이 지역에서는 활성 이온 펌프는 석회화 2, 3을 사용하도록 pH와 칼슘 농도를 상승시킬 필요합니다. 유기체 공부 형광 분자를 도포 할 때 사용되는 농도는 무시할만한 독성을 가지며, 생리적으로 적절한 방식으로 수행 유기체있게 보장하는 것이 중요하다. 하부 염색 농도를 독성이 적은 것, 통상보다 긴 시간 염색 (10)에 결합된다. 이 염색 기간 산소 결핍 및 폐기물의 축적을 최소화 배양 시간 동안 유충의 저농도를 유지하는 것이 중요하다. 이전 지역화를 포함하는의 FIB / TEM 방법을 추구하는관심 지역, 삶의 무대와 SEM-EDS와 SEM-...

생체 광물 형성 작용 (biomineralization)은 정교하게 정렬 한 무기물의 제조 결과 세포 활성 모음 브릿지 복잡한 일련의 이벤트이다. 문제는 동적 세포 프로세스 및 광학 및 전자 현미경 방법의 조합을 이용하여 복잡한 구조를 모두 무기물을 특성화한다. 세포 내 pH를 상승, 따라서, 증가 된 pH를 갖는 생활 단계를 식별하는 석회화 2, 3이 발생 될 가능성이있는 시간을 계시, CaCO3를 결정의 형성을 선호한다. 가족 Serpulidae에서 tubeworms 바다 4 공통 calcifiers 있습니다. 그것은 특히의 생물 연료 5, 6, 또한 해양 연구를위한 인기있는 무척추 동물 모델이다. 본 연구에서는, 무기질 구획 석회화 과정 두리NG의 생체 광물 형성 작용 (biomineralization)이 관찰된다. 변형의 빠른 처리 탄산 칼슘 구조물 (7, 8)의 출현을 포함한다. 우리는 tubeworm 인에서 수행 할 수있는 방법을 내부 pH를 측정 보여, 삶의 단계 및 석회화에 대한 중요한 조직은 어떻게 선별 할 수있다. 관심의 수명 단계가 식별 된 후에, 석회화에 대한 책임이있는 조직을 전자 현미경 법을 사용하여 더 높은 해상도로 특징 지어 질 수있다. 형광 현미경을 사용하여, 우리는 변성 유도 후 나타나는 탄산 칼슘에 필요한 시간을 결정한다. 삶의 유사한 단계 이후 원소 조성 분포에 대한 SEM-EDS 가시화하고, 증착 된 무기물 개의 상이한 전자 현미경 방법, 구체적으로는 SEM-EBSD 및 FIB-TEM을 사용하여 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>헥사메틸디실라잔&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 2% 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-이소부틸-1-메틸크산틴</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>니제리신, 유리산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>35mm 직경 접시, 구멍 크기 27mm, 유리 No.0, 비코팅</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, 아세톡시메틸 에스테르, 아세테이트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH 염화칼륨, ACS 등급</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 시약 등급, 결정질</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1M 부피 분석용 염산</td><td>Wako Pure Chemical 공업 주식회사</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>용적 분석용 0.05m 수산화나트륨 용액</td><td>와코 퓨어 케미컬 공업 주식회사</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>칼세인</td><td>시그마</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>이와키 주식회사</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>Mixed Cellulose 에스테르 멤브레인; 직경 47mm, 0.45 &마이크로; m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>DOE (1994)의 SOP06에 의한</td><td>완충</td><td></td><td></td>액용 인공 해수 cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 육수화물</td><td>와코 순수 화학 공업</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>와코 순수 화학 공업</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>나트륨 와코 순수 화학 공업</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>와코 순수 화학 공업</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판디올(트리스)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-아미노피리딘</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5-star Plus pH meter</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS 마이크로 조합 pH 전극 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, 버전 4.6, Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 집중 이온 및 전자 빔 (FIB-SEM) 시스템</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

탄산칼슘의 생물학적 생산의 첫 번째 사건을 특성화하려면 현미경 접근 방식의 조합이 필요합니다. 첫째, 세포 내 pH 분포와 칼슘 이온은 시간 경과에 따른 실시간 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 추가 전자 현미경 연구를 위해 관심 기능이 있는 수명 단계와 조직을 식별할 수 있습니다. 생애 단계와 관심 조직은 일반적으로 pH 및 Ca 신호가 더 높습니다. 
여기에서는 H. elegans를 사용하여 주사 전자 현미경(SEM)의 생물학적 표본에서 탄산칼슘 구조의 존재를 특성화하고, 에너지 분산 X선 분광법(EDS)을 사용하여 원소 조성을 시각화하고, 전자 후방 산란 회절(EBSD)을 사용하여 결정 구조의 존재를 확인하고, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 물질의 구성 및 구조를 분석합니다. 이 프로토콜에서는 집속 이온 빔(FIB)을 사용하여 TEM 분석에 적합한 치수로 샘플을 분리합니다. FIB는 현장 특정적 기법이므로 이전 기법의 정보를 사용하여 Ca 신호가 가장 높은 관심 영역을 식별하는 방법을 보여줍니다.

다음은 tubeworm 인의 변형시의 석회화 과정의 일부 관측은 다음과 같습니다. 도 1은 칼라 영역 근처의 pH 값은 변형 후 다른 조직에 비해 높다는 것을 보여준다. 그림 2I는 칼슘의 균일 한 분포, 더 큰 석회화 이벤트가 시작되지 않은 제안과 tubeworm 인을 보여줍니다; 도 2ii 관심 시점 초월 석회화 시사 장기간 석회화 한 tubeworm 인을 나타내고; 그림 2iii는 광물에 대한 책임이있는 조직을 이해하기 위해 추가 분석을 위해 선택한 관심의 석회화 단계와 tubeworm 인을 보여줍니다. 도 3은 높은 pH 값 칼 세인 염색 및 SEM-EDX 매핑 모두에서 높은 칼슘 이온 신호와 상관 관계를 나타낸다. 이러한 관찰로부터, 주목 수명 단계에서 조직을 하이에서 조사한더 현지화 된 기술, SEM-EBSD...

우리는 튜브웜인 Hydroides elegans의 석회화를 관찰하고 최초의 석회화된 물질을 찾고 특성화하는 데 유용한 다양한 현미경 방법의 사용을 보여줍니다. 생체 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하여 생체 광물화 연구에 중요한 기능 및 재료 정보를 제공합니다.

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 광학 및 전자 현미경법을 결합하여 석회화 현상의 위치와 구조를 결정하는 것입니다. 이는 세포 내 pH 및 칼슘 신호에 민감한 형광 지시제를 사용하여, 석회화를 담당하는 생애 단계인 변태 과정 중의 살아있는 관벌레 유생을 관찰함으로써 달성됩니다. 세포 내 pH 이미징을 통해 석회화 과정 중 세포질 내부와 외부로의 양성자 농도 변화를 연구할 수 있습니다.먼저, 해양 관벌레 유충의 세포 내 pH 이미징을 위해, 유영 능력이 있는 유충을 세포 내 pH 지시 염료인 SNARF-1 AM으로 염색합니다. 그 후 유충을 얇은 유리 관찰창이 있는 IBMX 함유 해수 디쉬로 옮겨 형광 현미경 위에 올리고, 염료에 흡수되는 488 nanometers 파장의 빛을 조사합니다. 염료에서 방출되는 580 nanometer 및 640 nanometer의 방출광을 수집합니다. 이 값들의 비율로부터 세포 내 pH 값을 계산할 수 있습니다.광학 현미경을 통해 pH 수치가 더 높은 시점과 조직 부위를 식별할 수 있습니다. 이는 추가 분석을 위해 관심 있는 시점을 결정하는 첫 번째 단계입니다. 두 번째 단계에서는 전자 현미경 관찰을 위해 해당 시점에서 고정액으로 관벌레를 보존합니다.SEM-EDS 매핑을 통해 칼슘 신호를 분석하여 새롭게 무기질화되는 생애 단계를 식별합니다. 그런 다음 SEM/EBSD를 사용하여 칼슘 신호가 높은 영역을 스크리닝하여 결정질 무기질의 존재를 확인합니다. 마지막으로, 집속 이온 빔(focused ion beam)을 사용하여 무기질 부위를 절단하고 TEM 관찰을 위한 박편을 제작합니다.이 섹션에서는 선택 영역 회절 패턴을 얻는 방법을 다룹니다. 이 기술이 벌크 X선 회절 분광법과 같은 기존 테스트 방법보다 갖는 주요 장점은 광학 및 전자 현미경 방법으로 관찰된 특정 구조를 직접 관찰할 수 있다는 점이며, 따라서 개별적인 석회화 사건을 시간적 및 공간적 수준 모두에서 직접 연구할 수 있습니다. 칼슘 및 세포 내 pH 지표를 사용하여 석회화를 연구하면 이러한 관련 생리학적 사건의 시간 척도를 식별할 수 있습니다.적절한 시점에 시편을 보존하는 것은 성공적인 SEM 분석을 위해 매우 중요합니다. 생물학적 석회화의 첫 사건을 찾을 때, SEM/EDX를 사용하여 칼슘의 원소 분포를 스크리닝할 수 있습니다. 칼슘이 더 많이 분포된 위치는 탄산칼슘의 존재를 나타낼 수 있지만, 결정 구조의 존재는 X선 회절 패턴이 나타나야만 확인할 수 있습니다.그러한 정보는 EBSD 및 TEM을 사용하여 얻을 수 있습니다. 전자 후방 산란 회절은 미세 구조와 전자 REM 각도가 브래그 회절 조건을 만족하는 한, 결정질 또는 다결정 재료를 식별하는 결정학적 특성 분석 기술입니다. 일반적으로, 결정립 또는 결정 방위 맵이 있는 연마된 시편에서 70도 기울기로 후방 산란 전자를 수집합니다.연마되지 않은 시료의 경우, 이러한 불균일한 표면으로부터 맵을 생성하는 것은 어렵습니다. 모든 표면 시리즈가 EBSD 각도 요구 사항을 충족하지 않기 때문입니다. 하지만 포인트 IG의 형태라면 EBSD 각도 요구 사항이 충족되는 한, 이러한 불균일한 표면에서도 Cacucci 회절 패턴을 수집할 수 있습니다. Cacucci 회절 패턴은 결정질 광물이 존재한다는 점을 명확하게 확인해 줍니다.본 방법은 직접적이고 신속하며, 다른 광화 조직에도 적용될 수 있습니다. 여기서는 집속 이온 빔을 사용하여 마이크로 샘플을 제작하였으며, 이는 TEM 절편을 준비하는 매우 직접적인 방법이기도 합니다. 변태 과정을 조사하기 위해 관벌레를 실험실에서 약 5일 동안 배양하였습니다.적격한 유생은 원형 운동 대신 전방 방향으로 헤엄치게 됩니다. 이는 유생이 변태 준비가 되었음을 의미합니다. 적격한 유생을 해수에 희석한 형광 용액에서 배양하며, 광퇴색을 방지하기 위해 용기를 호일로 덮고 동물을 하룻밤 동안 배양하십시오.튜브웜 유생을 나일론 메쉬에 대고 세척합니다. 이때 메쉬는 유생을 유지하면서 용액만 통과시킵니다. 여과된 해수로 유생을 두 번 세척하여 과잉 염료 용액을 제거합니다. 스트레이너를 페트리 접시에 밀착시켜 틈이 없게 만든 후, 밀착된 부분을 떼어내어 세척액을 버립니다.유충이 건조되지 않도록 주의하십시오. 그다음, IBMX가 들어 있는 얇은 유리 바닥 접시에 10~20마리의 유충을 각각 넣고 이미징 전까지 접시를 덮어둡니다. 이어서, 형광 신호를 검출하기 위해 적절한 다이크로익 미러가 포함된 적합한 필터 큐브를 삽입하십시오.살아있는 생명체의 이미지를 캡처할 수 있도록 셔터 속도를 충분히 빠르게 최적화하십시오. 다음으로, Z-Stack 옵션에서 광학 섹셔닝 파라미터를 선택하고, 현미경 스테이지를 위아래로 이동시켜 이미지 획득의 시작 및 종료 위치를 정의하십시오. 레이어 간 거리는 1 µm로 설정하십시오.이미징 후, 모든 데이터를 그레이스케일 TIF 파일로 내보냅니다. 이는 'File', 'Export'를 선택하여 수행할 수 있습니다. 파일 형식이 TIF 이미지로 표시되는지 확인한 다음 'Start'를 클릭하십시오.Z-Stack의 각 층, 각 채널의 그레이스케일 이미지는 이미지 분석이 가능하도록 동일한 이미지 폴더에 저장됩니다. 마지막으로 ImageJ를 사용하여 각 형광 채널에 대한 합성 이미지를 생성하십시오. 다음 JoVE 비디오는 세포 내 pH의 캘리브레이션 및 측정 방법을 보여줍니다.해수로 만든 4%paraformaldehyde 용액과 같은 가교 고정제를 사용하여 변태 중인 관벌레를 보존합니다. 16%paraformaldehyde 1분량을 해수 3분량과 혼합하여 하룻밤 동안 고정시킵니다. 1차 고정제를 폐기하고, 조직 구조를 더욱 안정화하기 위해 1%osmium tetraoxide 수용액에서 시료를 30분 동안 재고정합니다.반드시 흄 후드 내에서 작업하고 명확하게 라벨이 부착된 별도의 폐액 병을 준비하며, 포름알데히드와 사산화오스뮴을 준비하십시오. 다음으로, 단계별 에탄올 시리즈를 사용하여 샘플을 탈수시키고, 용액을 교체할 때마다 5분간 대기하십시오. 다음 단계는 에탄올과 HMDS가 1:1로 혼합된 용액으로 샘플을 탈수시키는 것이며, 이때 용액은 시료가 충분히 잠길 정도만 사용하십시오.흄 후드 내에서 시료의 수분이 완전히 증발할 때까지 기다린 후, 순수 HMDS를 사용하여 동일한 절차를 반복하십시오. 샘플에 제어된 파단을 만들기 위해, 다이아몬드 블레이드를 접시 가장자리에 대고 몇몇 개체를 포함하도록 삼각형 모양으로 절개하십시오. 페트리 접시의 덮개를 닫은 상태에서 배양 접시를 알루미늄 스터브에 밀착시키고, 부드럽게 눌러 제어된 파단을 만드십시오.해부 현미경을 사용하여 관찰하며, 온전한 관벌레가 몇 마리 포함된 파편 조각을 조심스럽게 집어 올립니다. 은 페인트를 사용하여 샘플을 SEM 샘플 홀더에 부착하고, 차징(charging) 현상을 줄이기 위해 가장자리를 은 페인트로 칠합니다. 이제 샘플이 SEM-EDS 분석을 위한 이미징 준비가 되었습니다.홀더에 담긴 시료를 현미경에 삽입합니다. 시료의 방향을 맞추고 전자 컬럼 아래에 배치합니다. VP SEM 모드에서 시료를 분석합니다.필요에 따라 초점과 난시를 최적화하십시오. 단일 유기체가 전체 시야를 가득 채우도록 배율을 선택하십시오. 전체 시야의 맵을 획득하여 시료 내 칼슘의 원소 분포를 분석하며, 데이터에서 유기체 내 칼슘의 뚜렷한 국소화가 나타날 때까지 또는 15분 이상 맵핑을 수행하십시오.관심 영역의 지점 정량화 값을 얻으려면 Single Point 도구를 사용하여 Point ID 옵션을 선택하십시오. 관심 영역을 클릭하여 스캔을 수행합니다. 배율을 점차 낮추어 일련의 이미지를 캡처함으로써 위치를 정확하게 기록하십시오.EBSD 분석을 위해 시료를 준비하려면, 평평한 SEM 홀더에서 시료를 제거한 다음 은 페인트를 사용하여 45도로 미리 기울어진 스터브에 부착하십시오. 참조 SEM 이미지를 사용하여 분석 대상 동물과 검토할 동물의 정확한 부위를 찾으십시오. 스테이지를 25도 기울여 시료 표면이 전자빔에 대해 약 70도가 되도록 합니다.스테이지를 올립니다. AZtec 소프트웨어에서 EBSD 모드를 선택합니다. 관심 상으로 aragonite를 선택합니다.EBSD 카메라를 장착하고, 신호 강도가 약 90%가 되도록 카메라 조건을 설정하십시오. 빠른 빔 래스터를 사용하여 배경을 획득한 다음, Aztec에서 이미지를 캡처하십시오. Spot Analysis 도구를 사용하여 칼슘 신호가 높게 나타난 시료 위치를 클릭하십시오. 스캔을 통해 Cacucci 패턴이 검출되는지 확인하십시오.패턴이 존재하고 데이터베이스의 선택된 상 중 어느 하나와 일치하면 자동으로 인덱싱됩니다. 집속 이온 빔을 이용한 마이크로 샘플 제작을 진행하기 전에, 스퍼터 코팅으로 백금 층을 입혀 준비된 SEM 시편을 보호하십시오. 샘플을 FIB SEM 챔버에 넣고, 샘플의 위치를 잡은 후 이온 유도 이차 전자 실시간 이미지를 획득하십시오.EBSD의 EDS 매핑을 통해 이전에 결정된 참조 이미지에서 관심 영역을 찾습니다. 관심 있는 특징들이 창의 프레임과 일직선이 되도록 스테이지를 필요에 따라 회전시키고, 해당 특징들을 수용할 수 있도록 배율을 조정하여 영역을 표시한 다음, 탄소와 텅스텐을 증착할 상자를 정의합니다. FIB 스냅샷을 캡처한 후, 텅스텐 캡 주변에 네 개의 상자 패턴을 그려 미세 샘플링 위치를 정의합니다.그다음 스테이지를 58도로 기울여 마이크로 샘플의 바닥 부분을 절단합니다. 스테이지를 다시 0도로 되돌리고 텅스텐 마이크로 샘플링 프로브를 삽입한 다음, 샘플에 닿을 때까지 내립니다. 프로브 팁과 텅스텐 코팅 사이에 텅스텐을 증착시켜 텅스텐 프로브와 샘플을 연결한 후, 최종 절단을 수행하여 마이크로 샘플을 아일랜드의 나머지 부분에서 분리하고 마이크로 샘플이 부착된 프로브를 들어 올립니다.TEM 구리 하프 그리드를 사이드 엔트리 홀더에 넣고, 마이크로 샘플이 TEM 그리드에 닿을 때까지 텅스텐 프로브를 내립니다. 마이크로 샘플이 전자 투과 가능해질 때까지 추가로 밀링합니다. TEM 분석 전에 두 듀워를 액체 질소로 채우고 가속 전압을 300 kilovolts로 설정합니다.라멜라가 부착된 하프 그리드를 표준 TEM 홀더에 넣습니다. 형광 스크린에서 빔을 중앙에 맞추고, 빔을 수축 및 확장하여 모든 빔 이동이 동심원을 이루는지 확인합니다. 스테이지 이동 노브를 사용하여 샘플을 찾아 이동하고, 샘플의 배율을 높인 뒤 샘플에 초점이 맞을 때까지 Z-Height를 조절합니다.필요에 따라 광학 접안렌즈를 사용하십시오. 카메라를 삽입하고 형광 스크린을 제거하십시오. 카메라의 과포화를 방지하기 위해 필요에 따라 빔을 확장하십시오.초점과 카메라 파라미터를 조정하여 이미지를 캡처합니다. 회절 패턴을 얻으려면 관심 영역을 중앙에 맞춘 뒤, 대물렌즈 조리개를 제거하고 회절 조리개를 삽입합니다. Diffraction Lens 모드로 전환합니다.회절 패턴의 중심부가 카메라나 형광 스크린을 태우는 것을 방지하기 위해 블랭커(blanker)를 삽입하십시오. 결정 구조 분석을 위해 패턴의 이미지를 캡처하십시오. 다음은 관벌레의 변태 과정 중 석회화 과정에 대한 관찰 결과입니다.IBMX를 통한 변태 자극 후 튜브웜의 pH 값이 증가하였으며, 31시간째에 세포 내 pH가 8 이상으로 증가하기 시작했습니다. 석회화와 관련된 조직은 칼라(collar) 영역입니다. SEM-EDS 신호 맵을 통해 1일 차 튜브웜의 칼슘 분포가 균일함을 확인하였으며, 이는 석회화 과정이 아직 시작되지 않았음을 나타냅니다.변태 유도 2일 후, 일부 관벌레는 이미 석회화가 과도하게 진행되어 새로 석회화된 물질을 관찰하기에 더 이상 적합하지 않았습니다. 본 예시에서 사용된 것과 같은 관벌레 표본의 경우, 석회화가 아직 초기 단계에 있으므로 칼슘 정량을 통해 미네랄의 존재를 특성 분석하기 위한 관심 영역을 결정하는 데 도움이 되었습니다. SEM-EBSD를 사용하여 조사했을 때, 강한 칼슘 신호가 나타난 국소 영역은 아라고나이트(aragonite)의 결정 구조를 가지고 있었습니다.집속 이온 빔(focused ion beam)을 사용하여 TEM용 시편을 제작하였으며, 아라고나이트(aragonite) 광물의 회절 패턴을 상세한 결정학적 수준에서 분석하였습니다. 이 영상을 시청하고 나면 다세포 생물 내에서 광물화 현상이 일어나는 위치를 찾는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 광학 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하면 석회화 과정에 대한 생리학적 및 재료학적 이해를 매우 높은 수준으로 얻을 수 있습니다.

characterization-calcification-events-using-live-optical-electron

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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