عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا العضلية الهيكلية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي وتحديد معدلات التنفس لمجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا الأول والثاني والرابع.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطاقة الحيوية للميتوكوندريا مثل الأمراض والمتلازمات المرتبطة بخلل الميتوكوندريا ، مثل الأمراض العصبية المتنوعة والإنتان والاضطرابات المرتبطة بالعمر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عدم وجود معظم العوامل الخلوية في تحضير الميتوكوندريا المعزول ، والتي قد تتداخل مع تحليل وظائف الميتوكوندريا. ستظهر الإجراء ساندرا ناسوز ، الفنية من مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، احصل على دورق من عينات عضلات الهيكل العظمي كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الدورق على دلو ثلج. باستخدام مقص ناعم ، افرم العضلات إلى قطع بحجم واحد إلى ملليمترين.

بعد ذلك ، اشطف المنديل المفروم مرتين باستخدام عازلة عزل مثلج باستخدام 20 مل لكل غسلة. الأنسجة المغسولة في 10 ملليلتر من عازلة العزل لكل جرام من الأنسجة ثم أضف خمسة ملليغرامات من أنسجة البروتياز-G. ثم ضع الدورق في حمام جليدي باستخدام محرك مغناطيسي وحركه لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المعلق ب 10 مل إضافية من عازلة العزل مع 0.2٪ BSA منزوع الدسم لكل جرام من الأنسجة. بعد ذلك ، قم بصب كل المخزن المؤقت للعزل من الدورق اغسل المنديل مرتين باستخدام عازل عازل مثلج مكمل بنسبة 0.2٪ BSA باستخدام 20 مل لكل غسلة.

بعد ذلك ، أعد تعليق الأنسجة في 10 ملليلتر من عازلة العزل المكملة ب BSA لكل جرام من الأنسجة. استخدم الخالط الزجاجي شبه الأوتوماتيكي مع مدقة فضفاضة لتجانس الأنسجة. بعد ذلك ، انقل المتجانس إلى أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

باستخدام ماصة مصلية ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات مع 10 ملليلتر من المثلج الباردة BSA المكمل بوسط العزل لكل جرام من الأنسجة. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 350 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية للاحتفاظ بالمادة الطافية ، والتخلص من الحبيبات. قم بتصفية المادة الطافية في دورق محفوظ على الجليد من خلال طبقتين من الشاش. انقل التعليق المفلتر إلى أنبوب طرد مركزي وجهاز طرد مركزي 7 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم تخلص من الطافف. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا الخام في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للعزل المكمل BSA لكل جرام من الأنسجة. جهاز الطرد المركزي هذا التعليق 7 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 20 مل من محلول الغسيل. جهاز طرد مركزي عند 7 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. كرر عملية إعادة التعليق والطرد المركزي هذه مرة أخرى.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول الغسيل. حدد تركيز البروتين باستخدام أي طريقة قياسية. بعد ذلك ، احتفظ بمعلق الميتوكوندريا المركز على الجليد حتى يصبح جاهزا لإجراء فحوصات قياس إعادة التنفس.

للبدء ، أعد تعليق تركيز الميتوكوندريا في مخزن التنفس إلى تركيز نهائي يبلغ 0.4 ملليغرام لكل مليلتر من بروتين الميتوكوندريا. بعد ذلك ، قم بشفط وسط التنفس من غرفة الأوكسجين معايرة الهواء. أضف 2.1 مل من معلق الميتوكوندريا المعزول.

أدخل سدادة لإغلاق غرفة الأوكسجراف. ثم حرك معلق الميتوكوندريا باستمرار عند 700 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. سجل التنفس الخلوي عند خط الأساس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة.

لبدء التنفس المعقد المعتمد على I ، قم بحقن 12.5 ميكرولتر من 0.8 مولر مالات في غرفة أوكسجراف محضرة بتعليق الميتوكوندريا المعزول من خلال منفذ حقن التيتانيوم الخاص بالسدادة. ثم قم بحقن 10 ميكرولتر من اثنين من الغلوتامات المولية. سجل التنفس الخلوي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة.

بعد ذلك ، قم بحقن 10 ميكرولتر من 0.05 مولار ADP في الغرفة من خلال منفذ الحقن. سجل التنفس الخلوي حتى تزداد إشارة تدفق الأكسجين ثم تنخفض وتستقر. للتنفس المعقد المعتمد على II ، قم بحقن ميكرولترين من 0.2 مللي مولار روتينون في غرفة أوكسجراف محضرة بتعليق الميتوكوندريا المعزول.

سجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة. ثم حقن 20 ميكرولتر من سكسينات مولية واحدة. سجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة.

بعد ذلك ، قم بحقن 10 ميكرولتر من 0.05 مولار ADP في الغرفة من خلال منفذ الحقن. سجل التنفس الخلوي حتى تزداد إشارة تدفق الأكسجين ثم تنخفض وتستقر. بالنسبة للتنفس المعقد المعتمد على الوريد ، قم بحقن 2.5 ميكرولتر من 0.8 مللي مولار أسكوربات في غرفة أوكسجرافية محضرة بتعليق الميتوكوندريا المعزول.

بعد ذلك ، قم بحقن 2.5 ميكرولتر من 0.2 مولار TMPD و 10 ميكرولتر من 0.05 مولار ADP. سجل التنفس الخلوي حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة. ثم حقن 10 ميكرولتر من أزيد الصوديوم المولاري.

سجل التنفس الخلوي حتى تنخفض إشارة تدفق الأكسجين ، ثم تستقر. في هذه الدراسة ، يتم عزل الميتوكوندريا السليمة عن العضلات الهيكلية. ثم يتم قياس معدلات التنفس المعقدة المعتمدة على I عن طريق قياس التنفس عالي الدقة.

كما يتضح ، يزداد معدل تنفس الميتوكوندريا فور إضافة ADP. ينخفض معدل التنفس بعد استنفاد ADP إلى مستويات مماثلة لتلك التي لوحظت قبل إضافة ADP. يشير هذا إلى أن نسبة الحالة 3 والحالة 4 المعروفة باسم نسبة التحكم في الجهاز التنفسي ، أو RCR ، مرتفعة وأن سلامة الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها جيدا أثناء إجراء العزل.

ثم يتم ملاحظة معدلات التنفس المعقدة المعتمدة على II عن طريق تثبيط التنفس المعقد I بالروتينون وحقن الركيزة الثانية المعقدة السكسينات. ثم تتم إضافة ADP ، مما يؤدي إلى زيادة فورية في التنفس. بمجرد استنفاد ADP ، ينخفض التنفس إلى مستويات مماثلة لتلك التي لوحظت قبل إضافة ADP ، مما يشير إلى ارتفاع RCR ، حيث يتم الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا جيدا أثناء العزلة.

تتم ملاحظة معدلات التنفس المعقدة المعتمدة على IV عن طريق إضافة ascorbate و TMPD و ADP. ثم يضاف أزيد الصوديوم لتثبيط الوريد المركب ، ويتم تفسير الاختلاف في استهلاك الأكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم على أنه التنفس الوريدي المركب الحقيقي. يشير معدل التنفس المعقد المرتفع المعتمد على الوريد الذي لوحظ في الحالة 3 إلى الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعة ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء معايرة لأجهزة استشعار الأكسجين مسبقا قبل التجانس. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياسات محتوى ADP الخلوي ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، والنشاط الأنزيمي لسينسيز ATP كمستويات ركيزة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت التغييرات في معدلات التنفس ناتجة عن نقص ركيزة الميتوكوندريا ، أو إمكانات الغشاء ، أو انخفاض النشاط الأنزيمي لسينسيز ATP.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا عن عضلة الهيكل العظمي عن طريق الطرد المركزي التفاضلي وكيفية قياس معدلات التنفس لمجمعات الميتوكوندريا الأول والثاني والرابع باستخدام قياس التنفس عالي الدقة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال استقلاب طاقة الميتوكوندريا لاستكشاف وظيفة طاقة الميتوكوندريا في مجالات مثل أمراض الميتوكوندريا الوراثية ، والاعتلال العضلي ، وإصابة نقص التروية في الميتوكوندريا المعزولة. لا تنس أن العمل مع مضادات المايسين A والروتينون وأزيد الصوديوم و FCCP يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.