Name: MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 MALDI 이미징 질량 분석을 이용한 쥐 뇌 조직에서 강글리오사이드 검출 및 시각화를 위한 DAN 매트릭스 승화 기법. 이 방법은 신경생물학 연구에서 지질 분포와 기능을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 웨스턴 온타리오 대학교 MALDI 석사 시설의 Kristina Jurcic의 기술 지원과 이 작업에 자금을 지원한 NSERC(National Sciences and Engineering Council)에 감사드립니다. 저자는 또한 이 원고에 제시된 승화 기술을 최적화하는 데 조언을 해준 Caprioli 그룹(Vanderbilt University, TN)과 Chaurand 그룹(Université de Montreal, QC)에 감사를 표합니다.

모든 동물의 처리 절차는 웨스턴 온타리오의 동물 관리위원회 (2016-014) 대학을 준수 설명. 1. 조직 준비 및 단면 <ol><li> &quot;신선한 냉동 추출&quot;(FFE)로 알려진 과정을 통해 쥐에서 뇌 조직의 압축을 풉니 다. <ol><li> 펜토 바르 비탈 나트륨의 과다 복용과 함께 쥐를 안락사와 사지의 반사 신경을 모니터링 할 수 있습니다. 모든 반사 신경이 중단되면, 단두대를 사용하여 쥐의 머리를 절단. </li><li> 조심스럽게 메스를 사용하여 두개골에서 근육과 다른 조직을 분리합니다. 전방 부분에 두개골 (난원 매그넘)의 기초부터 시작하여 뇌를 노출하기 위해 두개골을 깰 뼈 절단 집게를 사용합니다. </li><li> 뇌가 노출되면, 조심스럽게 수술 주걱으로 그것을 밖으로 퍼 즉시 플래시 동결에 대한 분쇄 된 드라이 아이스에 배치합니다. 주 : 뇌가 매우 가단 될 것입니다. 에 뇌를 배치 할 때 따라서 세심한주의를 기울입니다드라이 아이스. 뇌 분쇄 또는 표면에 대하여 가압되는 경우에는 그 형상을 변경하고, 그 위치에서 정지한다. </li></ol></li><li> 드라이 아이스에 80 ° C 냉장고 및 장소 - 신선한 냉동 조직 (안 포름 알데히드 관류 또는 OCT에서 포함)를 제거합니다. </li><li> 드라이 아이스 또는 저온 유지 동결 바 중 하나에 저온 유지 장치 홀더와 장소에 물 몇 방울을 배치합니다. 를 눌러 조직 가볍게 저온 유지 장치 홀더에 그것은 조직의 기초 주위에 물이 정지 될 때까지 동결 길게하기 시작 제자리에 앵커. 필요한 경우 추가 홀더에 조직을 확보하기 위해 추가 물을 추가합니다. 주 : 물은 원하는 신호의 검출에 영향을 미칠 수있는 화합물과 조직의 오염을 피하기 위해 조직을 장착하는 대신 간섭 단층 매체로 사용된다. </li><li> 저온 유지 장치의 위치 조직. 원하는 해부학 적 위치까지 제 조직. 12 μm의 - 절단 두께가 8 사이에 있는지 확인하십시오. 참고 : 경우 공동 저온 유지 장치에 조직을 절편디바이스는, 이러한 블레이드, 브러쉬, 안티 - 롤 바, 홀더 별도의 재료 화합물 매립 오염을 방지하기 위해 사용되는 것이 필수적이다. 그라 이오 스탯의 내부는 완전히 사용하기 전에 에탄올로 청소해야합니다. </li><li> 그라 이오 스탯 안티 - 롤 바를 사용하여 천천히 섹션 조직 섹션을 평평. 롤 바의 위치가 올바르지 않거나 날이 무딘 경우 조직에 구멍 또는 표시가 발생할 수 있습니다. 깨끗한 붓을 사용하여 플랫폼을 슬라이스의 중심으로 조직을 이동합니다. </li><li> 설치 <ol><li> 슬라이싱하는 동안 저온 유지 장치에 배치함으로써 도전 슬라이드 또는 금속판을 고정. 슬라이드가 완전히 고정되면 신중 깨끗한 붓을 사용하여 슬라이드의 도전성 표면에 단면 조직을 움직인다. 모든 조직 절편을 슬라이드에 올바르게 배치되면 섹션을 해동 할 때까지, 슬라이드 아래에 손가락을 배치 조직 반대를 누릅니다. 참고 : 섹션은 접거나 해동 과정시시 컬 수있다이 설치 방법을 사용하여. 이것은 조직을 해동시 저온 유지 장치에서 슬라이드 유지함으로써 감소 될 수있다. 이러한 문제가 문제가 될 경우, 대안, 따뜻한 장착 방법은 아래에 나열되어 있습니다. </li><li> 다르게는, 실온 인듐 - 주석 산화물 (ITO)의 슬라이드 (금속 플레이트)를 가지고 가볍게, 슬라이싱 플랫폼 표면에 냉동 조직 절편에 도전면을 아래로 누른다. 이것은 균일 작은 컬링 또는 조직 폴딩 슬라이드의 표면에 조직 절편 녹고 이어질 것이다. 참고 : 설치 특정 단백질과 지질의 손실을 초래할 수있는이 방법을 사용하면 결로가 섹션 아래에 표시 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 10 분 - 5 데시 케이 터에서 조직과 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 2. 승화의 장치 셋업 참고 : 흄 후드에서 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 금속 가위 리프트에 핫 플레이트, 핫 플레이트에 알루미늄 용기에 모래 목욕을 배치해당 면적 (핫 플레이트보다 즉, 큰)의. 핫 플레이트를 켜고 140 ° C까지 온도를 설정합니다. 참고 : DAN 매트릭스의 융점이 187 사이입니다 - ° 190 C. 열판의 온도를 초과하지 마십시오. <ol><li> 핫 플레이트의 온도 피드백 프로브가 장착 된 경우, 실험을하는 동안, 모래의 온도를 모니터링하고 온도 일관성을 보장하기 위해 사용. 이 기능은 다양한 승화 실험에서 실험의 재현성을 지원 할 수 있습니다. 주 : 모래 목욕은 고온에서 깨질 수있는 유리 용기로 알루미늄 용기에 포함되어야한다. </li></ol></li><li> 승화 장치의 바닥면에 DAN 행렬 300mg의 배치. 장치의 중심부에 매트릭스를 놓고 승화되는 대략 폭과 슬라이드의 길이가 균일 한 층에 확산. 주의 : DAN 행렬 독성이다. 따라서, 중요한 마모 장갑, 마스크 및 안전성은항상 고글 분말 행렬을 처리 할 때. 이 빛에 민감로 DAN 어둠에 보관해야합니다. </li><li> 플레이트 승화 중에 슬라이드의 표면 전체에 걸쳐 냉각 온도의 균일 한 분포를 확보하기 위해서는 콘덴서의 바닥과 직접 접촉과 장치의 내부 표면 상에 금속판 테이프입니다. 대안 적으로, 모래 콘덴서의 바닥은 평탄면을 확보한다. <ol><li> 플레이트의 바깥 쪽 가장자리를 따라 테이프를 놓고 유리 내부의 측면에 부착. 테이프가 플레이트 아래에 배치하고, 내측 유리 표면의 하단에 부착되는 경우, 온도 분포가도 없을 수 있고, 상기 슬라이드의 표면에 걸쳐 불균일 한 매트릭스 분포 될 수있다. </li><li> 빈 (테스트)를 테이프로 다시 슬라이드의 외측 가장자리에 배치 된 테이프와 상기 금속 플레이트의 표면을 가로 질러 대각선으로 밀어. </li></ol></li><li> w는, 장치의 상부 및 하부 부분을 연결중간에 고무 O 링 i 번째 완전한 밀봉을 보장합니다. </li><li> 장치의 중심을 금속 U 조인트를 배치하고, 장치의 상부 및 하부 절반이 함께 단단히 밀봉까지 악을 조인다. 모래 목욕 위의 금속 O 링에 놓습니다. </li><li> 분쇄 된 얼음의 소수를 타고 콘덴서에 넣습니다. 얼음 비자금을 만드는 차가운 물 전체 1/2 ¼ 콘덴서를 입력합니다. 아이스 슬러시는 부착 장치의 내부이어서 슬라이드 금속판을 냉각한다. 정상 상태에 도달하도록 온도를 적어도 5 분을 기다린다. </li><li> 콜드 트랩 용기에 에탄올 300 mL로 붓고 용기로 유리를 배치합니다. 콜드 트랩 용기의 바닥에 에탄올에 드라이 아이스의 3 작은 조각 - 2를 삭제합니다. 출력이되지 않는 반면에 냉각 트랩 입력은 상기 실린더의 하단에 실행 유리관있다. </li><li> 고무 튜브를 이용하여 콜드 트랩 출력 진공 펌프를 연결한다. 고무의 다른 부분을 사용하여튜브는 승화 장치에 냉각 트랩 입력을 연결합니다. 튜브가 단단히 가능한 경우 금속 클램프를 사용하여 고정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 50mT의 - (30)의 진공을 제공하는 진공 펌프를 사용한다. 펌프가 압력 평형 적어도 5 분 동안 실행할 수 있습니다. 진공 펌프 때문에 장치의 감소 압력이 설정되면 승화 장치의 U-링에 바이스 다시 강화해야 할 수 있습니다. 주 : 고 진공 게이지가 실험 기간 동안 진공의 압력을 모니터링하고 실험의 가장 높은 재현성을 달성하기 위해서 압력 누출 테스트는 펌프에 연결하는 것을 추천합니다. 그러나, 대부분의 펌프는 따라서 게이지는 숙련 된 사용자를위한 필수하지 않을 수 있습니다, 일정한 압력을 유지하도록 설계되었습니다. 또한, 진공 밀봉 그리스 진공 압력을 유지하는 데 도움이 될 수있다. </li></ol> 3. 승화 <ol><li> 모래 목욕 온도가 STABIL이 있는지 확인140 ° C에서 상기 장치가 연결되어있는 모든 튜브 모래 욕 상기 금속 O 링에 고정되어, 진공 상태에 있는지화된. </li><li> 7 분 타이머를 설정하지만 타이머를 시작하지 마십시오. 승화의 U-관절이 잘 금속 O 링 위에까지 천천히 승화 장치에 가위 리프트와 모래 목욕을 위로 올립니다. 이 여분의 공간은 모래에 장치의 조정을 할 수 있습니다. <ol><li> 신속 장치는 모래에 균등하게 앉아 있는지 확인하기 위해 모래 표면에 부드럽게 승화를 누른 다음 바로 타이머를 시작합니다. </li></ol></li><li> 타이머가 울리면, 진공 펌프의 전원을 끄고 조심스럽게 승화 더 이상 모래 목욕을 터치하고, 금속 O 링에 안전하게 앉아 때까지 가위 리프트를 내립니다. <ol><li> 천천히 장치 내의 압력을 해제 마이크로 배기 밸브를 풀고. 승화 장치의 고무 튜브 주위에 금속 클램프를 풀고 천천히 튜브를 느슨하게 시작합니다. RU에 한 번bber 튜브가 약간 완화되어, 잔류 압력이 탈출 할 수 있도록 일측에 상기 튜브 구부러. </li><li> 주위 압력 반환 조심스럽게 승화 장치에서 고무 튜브를 제거합니다. </li></ol></li><li> 장치의 U-관절에 나쁜를 풀고 제거합니다. 조심스럽게 승화 장치의 두 부분을 분리하고 내부 유리의 상단에서 슬라이드를 당깁니다. 매트릭스 분포를도 확인하는 슬라이드를 검사합니다. 주 : 매트릭스 요철이면 승화의 바닥 분말 매트릭스는 재배치 될 수 있거나 승화 장치가 다음 슬라이드 모래에 재배치 될 수있다. 승화 공정이 동일한 매트릭스를 이용하여 여러 번 반복 할 수 있지만, 매트릭스 결국 승화 시간을 보상하기 위해 약간의 조정해야 할 것 같은 감소 반복 열 노출 분말의 양에서 어둡게 될 것이다. 이러한 이유로, 매트릭스 BEI의 양을 모니터하는 것이 중요NG는 슬라이드 사이의 매트릭스 증착의 일관성을 보장하기 위해 각 실험 후 승화 </li><li> 승화 행렬의 분포 및 양이 충분하면, 승화 반복 섹션 (3)의 내부에 조직과 새로운 슬라이드 테이프. 주 : 품질 관리 (QC)을 위해, 승화 행렬의 양은 전에 승화 후 슬라이드를 계량하고 상기 슬라이드 (2)의 표면적을 갖는 승화 매트릭스의 무게를 분할하여 각 실험 후 측정 할 수 있고, 그것은 주목해야한다 높은 정밀도 균형을 사용하지 않는 QC의 완전 정량화 수단 반대로 인해 4 소수점 포인트와 비늘 사이의 변화 이후 가장 저울의 정밀도의 부족으로, 이러한 측정은 최적의 매트릭스 증착을위한 가이드를 사용한다 (그림 참조 3). </li></ol> 4. 조직 저장 / 재수 <ol><li> 승화 후, 저장소는 밀폐 용기 또는 작은 카스에 슬라이드밀봉 된 비닐 봉지에두기가. </li><li> 2 시간 또는 하룻밤 -20 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 품어. 주 : 냉동 프로세스의 목적은 매트릭스 조직에 물질의 탈착을위한 재수 단계로서 작용한다. 냉동 프로세스는 C 12 -80 °에 저장 될 때까지 1 주간 지질 신호의 열화를 방지하는 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 샘플 냉동실에 저장되는 시간의 양이 상당히 (연구실에서 관찰 된 바와 같이) 신호 검출을 변경하지 않고 실험자의 필요에 따라 어느 정도 변할 수있다. 샘플은 -20 ° C에서 이상 24 시간 동안 냉동 그러나, 우리는 행렬의 일부 변색을 발견했습니다. 따라서, 우리는 그 시간 전에 승화 조직 이미징 이상 배양 기간 동안 -80 ° C에서 조직을 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> 10 분 - 5 데시 케이 터에서 냉장고 (컨테이너)과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. </li></ol> 5. 이미징 및nalysis <ol><li> 데시 케이 터에서 슬라이드를 제거하고 촬영하는 동안 MALDI 악기의 질량 정확성을 보장하기 위해 장비 기준을 적용합니다. 표준의 유형은 장비에 따라 달라집니다. 표준은 일반적으로 (그림 3D) 영상화하는 주변 조직, 전체 슬라이드에 걸쳐 균등하게 적용됩니다. </li><li> MALDI 악기에 슬라이드를 삽입하고 영상 실험에 대한 제조업체의 지침 (악기 방법은 1000에 최적화되어야한다 - 2,000 질량 범위)에 따릅니다. 대표 결과 (그림 4)는 70 μm의 래스터 20 촬영 / 스펙트럼 (획득 시간 ~ 2 시간)으로 reflectron 부정적인 모드에 인수되었다. </li></ol>

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이 작품은 MALDI IMS 실험에서 같은 강글리오사이드와 같은 음으로 하전 된 지질의 검출을위한 조직에 매트릭스 승화의 표준화 된 프로토콜을 자세히 설명합니다. MALDI IMS에 대한 샘플 준비는 매우 다양하고 관심있는 분석의 고유 한 특성에 맞게 사용자 정의 할 수 있어야합니다. 조직 샘플의 표면 상에 매트릭스의 적용은 IMS에서의 검색 결과의 품질에 관해서 시료 준비 과정의 중요한 측면이다. 매트릭스가 관심의 분석과 호환되며 스펙트럼의 매트릭스에서 파생 된 유물의 무료 보장, 행렬을 선택할 때 특별한주의를 기울여야한다. 승화 조직에서 지질의 작은 비편 재화와 매트릭스 액정 균질성 고도를 제공 건조 매트릭스 증착 기술이다. 특히 DAN 행렬 쥐 뇌에서 입증 된 바와 같이, 강글리오사이드라는 음전하 막 지질 그룹의 탈착 고감도를 도시섹션, 및 이미징 대부분의 응용 프로그램과의 호환성을 허용, 장시간 진공 하에서 안정적입니다. DAN 행렬은 양전하 지질 종에 대한 높은 친 화성을 갖는, 따라서 MALDI IMS <sup cl...

매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS)되고 고도로 추구 그대로 샘플 표면에 걸쳐 지질, 펩타이드 및 단백질의 공간적 분포의 시각화를위한 기술 후. MALDI IMS는 이전에 미리 정제의 분석을위한 분석 기술로 알려져 있지만, 최근에는, 그 때문에없이 고해상도 영상 / 해부학 적 기준점과 질량 분석의 정확성을 결합 할 수있는 능력의 많은 분야에서 주목을 받고있다 외부 표시를 위해 필요합니다. 이 기술을 이용하여 연구의 과학적 풀 성장을 계속하기 때문에, IMS 실험의 개발 및 최적화를 지원하기 위해 표준화되고 쉽게 추적 프로토콜에 대한 필요성이 증가된다. 강글리오사이드, 중추 신경계에서 매우 풍부한 세포막 지질 그룹 멤브레인 내에 내장의 위치뿐만 MALDI IMS 실험 이상적은 특정하게 정시기존의 면역 라벨을 사용하여 탐지하는 것은 불가능 말이지. 또한, 우리는 세포 신호 전달의 조절 자로서 기능이 지질은, 다른 것들 중에서도, 뇌 손상 3, 4, 5 이후에 변경된다 건강한 쥐 뇌 고유의 해부학 적 분포 패턴을 가지고, MALDI IMS를 사용하여 도시 하였다. 강글리오사이드는 대부분 지질 종에 비해 더 높은 질량 범위에 위치하고, 따라서 MALDI 이미징 플랫폼에 가장 적합한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> 그림 1 : MALDI IMS 실험의 워크 플로우. 승화를 사용하여 MALDI IMS 실험의 일반적인 워크 플로 다이어그램. -80 ° C에서 냉동 조직은 저온 유지 장치로 구분되며, 10 μm의 섹션은 해동 전도성 ITO 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드는 다음 승화 될 때까지 데시 케이 터에 배치됩니다. SLI는DES는 승화 장치에 삽입하고 행렬의 짝수 층은 조직 샘플의 표면에 도포된다. 시료를 10 분 동안 데시 케이 터에 배치 된 -20 ℃ 냉동고에서 밤새 동결. 기준이 적용 되었다면, 시료에 레이저가 이온화 매트릭스 분자의 이탈을 야기하는 조직을 가로 질러 지향되는 MALDI 기기에 삽입된다. 이온은 검출기에 도달 할 때까지 자신의 질량 (비행 시간 형 / TOF)을 기반으로 비행 튜브와 분리를 이동한다. 소정의 질량 - 대 - 전하 (m / z) 범위 내에서 분석의 이온 풍요 로움에 대한 정보는 분자 영상과 질량 스펙트럼 모두로 표시됩니다. 이 데이터는 시각화 영상화 조직 내의 관심 분석 물질의 이온 풍부 정량화 모두에 사용될 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 샘플 준비프로세스의 각 단계는 관심의 분석에 정의해야합니다으로 MALDI IMS에 대한 높은 변수입니다. MALDI 기반 실험의 정의 기능은 분석하기 전에 샘플 표면 상에 증착 된 코팅 기질의 사용이다. 흡수 및 제거 프로세스 중에 레이저로부터 방사 에너지를 전달하는 역할 이외에도, 상기 매트릭스는 또한 그에 대한 관심 (6, 7)의 화합물의 분석을 용이하게 샘플로부터 여러 분석 물을 분리하는 역할을한다. 시료 표면에 대한 매트릭스의 균질 한 애플리케이션은 시료 준비 과정에서 가장 중요한 단계이다. 부적절한 매트릭스 증착은 큰 이종 매트릭스 결정 형성과 유물의 개발, 낮은 이온 신호와 가난한 재현성 7로 이어질 수 있습니다. 특정 매트릭스의 친화 특정 분석 물을 분리하기 위하여, 행렬의 형태는 실험 선정 인해 수상당히 결과를 변경. 단백질 및 펩티드의 이미징에 사용되는 기질은 종종 촬상 지질에 사용되는 것과 상이하고, 처리는 또한 그러한 성공적 조직으로부터의 신호를 검출하기 위해 세척 및 재수 화 단계와 같은 추가의 절차에 대한 필요성에 의해 복잡해진다. 세척 단계는 지질 신호 (8)의 향상을 위해 존재하지만, 이들은 대부분 지질 종의 검출을위한 전제 조건 아니다. 지질 이미징 실험의 매트릭스를 선택하는 경우, 적합한 행렬의 범위를 좁히는 것 등이 주목 지질의 극성을 고려하는 것이 중요하다. 예를 들어, 강글리오사이드는 그들에게 전반적으로 부정적인 극성을 제공 시알 산 잔기를 포함한다. 효과적으로 탈착 및 조직으로부터 강글리오사이드를 이온화 수 행렬들이있다; 그러나, 스펙트럼 진공하에 매트릭스의 안정성 행렬 유래의 피크와 같은 요인을 고려하에 수행되어야한다. 1,5-diaminonapthalene (DAN) 행렬 이미징 애플리케이션의 대부분의 악기 진공 상태에서 충분히 안정하고, 지질 탈착 고감도를 입증하고 양성 및 음성 이온 모드 둘 모두에서 지질의 분석에 이용 될 수있다. 이러한 히드 록시 벤조산 (DHB) -9- aminoacridine (9-AA) 및 5- 클로로 -2- 머 캅토 벤조 티아 졸 (CMBT) 다른 네거티브 지질 친 화성 매트릭스에 비해 DAN 매트릭스는 가장 효율적으로 쥐 뇌에서 강글리오사이드를 탈착 할 수 있었다 음이온 모드 (준비 원고)의 조직. 매트릭스 증착의 적절한 방법을 선택하면 행렬 자체를 선택하는 동일한 중요하다. 액체 추가를 허용하는 샘플 침투를 고체 매트릭스는 유기 용매에 용해시키고, 공압에 의해 증착 또는 분무기 또는 감시인 자동화 항 젖은 매트릭스 증착 방법은 단백질 및 펩티드의 탈착에 특히 효과적매트릭스와 화합물 및 공동 결정의 ction. 이러한 기술은 또한 지질 애플리케이션 분석 비편 재화 얼룩 매트릭스 액정 형성을 위해 사용될 수 있지만, 특히 조직이,도 9에 의한 지질 용매에의 높은 용해성 풍부 공통 사건이된다. 지질 용이 조직에서 이온화되므로 이러한 기술의 단점의 대부분을 회피하면서, 예컨대 승화 건조 매트릭스 증착 기술은 분무기에 간단하고 비용 효율적인 대안을 제공한다. MALDI IMS 실험에서 승화의 성공은 습식 매트릭스 기술 1, 10에 비해 증가 재현성 선도 같은 결합 매트릭스 분석 물질에 대한 면적을 증가 미세 매트릭스 형태 증가 매트릭스 순도 및 균일 한 매트릭스 증착 등의 기능에 기인한다. 승화 invo바로 조직 샘플의 표면 상에 증착 한 다음 분쇄 된 매트릭스 기체 상 전이 고체 결과 냉각 된 샘플의 표면 아래에 진공 분말 행렬 가열 아이브. 승화 동안 매트릭스 증착 시간, 온도 및 재현성이 높은 결과를 제공하는 압력과 같은 다양한 요인들에 의해 제어 될 수있다. 하나의 승화 실험은 폐기하기 전에 여러 번 재사용 될 수있는 선택된 기질의 종류에 따라 5 내지 20 분에 걸릴 수있다. 이 장치는 자동 분무기의 가격의 일부에서 상업적으로 구입하실 수 있습니다 쉽게 청소 및 유지 보수를 위해 따로 촬영됩니다. 낮은 비용과이 행렬 증착 기술의 상대적 단순 시작 또는 MALDI IMS 지질 이미징 애플리케이션에 확장 연구자에 이상적이다. IMS에 대한 조직의 승화 프로토콜 디테일 정보 (11)에보고되었지만, 몇몇 표준 프로토콜 w 존재HICH 어려운 광범위한 시행 착오없이 기술을 확립 할 수있게, 음이온 모드에서 높은 질량 지질을 이미징 승화 실험을 수행과 관련된 기본적인 흐름에 초점을 맞춘다. 다음은 고해상도 이미지 및 갱글 검출하는 쥐 뇌 부 상 DAN 행렬의 승화 그 격차를 목표 실험 프로토콜이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> 그림 2 : 승화 장치. 사진 (A) 및 승화 장치의 개략도 (B). 진공 펌프를 에탄올 300 mL로 채워진 냉각 트랩에 고무관으로 연결된다. 콜드 트랩은 다음 승화 장치 고무관으로 연결된다. 장치는 금속 U 조인트와 함께 밀봉 유리의 두 개의 분리 된 조각들로 구성된다. 승화의 위쪽 절반얼음 비자금으로 가득 콘덴서가 포함되어 있습니다. 샘플 플레이트는 유리 밀봉 장치 내부에, 콘덴서의 하부에 녹화된다. 승화 장치의 하단은 균일하게 샘플 플레이트에 직면 퍼져 DAN 행렬을 포함하고 있습니다. 승화하는 동안, 유리 장치 바로 아래에, 핫 플레이트에 의해 140 ℃로 가열 한 모래 욕에 배치된다. 온도 프로브 실험에 대한 설정 온도와 비교하여 모래 욕 온도 피드백을 통해 승화 실험을하는 동안 안정된 온도를 유지하는 데 도움. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>서브리메이터</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diaminonapthalene (DAN) 매트릭스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>100 지</td></tr>온도 피드백이 있는 <tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 잭</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Cold Trap</td><td></td><td></td><td>현장 제작</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 2단</td></tr><tr><td>인듐-주석-산화물(ITO) 슬라이드</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI 1111000</td><td>유형 II, 각 1.1mm/25</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 기기</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>데시케이터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>탁상용 데시케이터</td></tr></tbody></table>

maldi 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 dan 매트릭스의 승화

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

샘플 준비는 최적의 검출 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS) 실험 분석의 시각화를위한 열쇠입니다. 각 단계는 관심있는 분석의 고유 한 특성에 적합하도록 최적화해야합니다으로 샘플 준비 과정을 통해 수행 할 수있는 적절한 프로토콜을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 프로세스는 탈착 효율적 관심 분자를 ​​이온화 할 수있는 호환 가능한 행렬을 발견 할뿐만 아니라 적절한 매트릭스 증착 기술을 선택하지 포함한다. 건조 매트릭스 증착 기술은 지질의 이온화에 특히 효과적인 반면, 예를 들어 용매에 용해 매트릭스를 수반 행렬 습식 증착 기술은, 대부분의 단백질 및 펩티드의 탈착 우수하다. 승화 인해 homogenei MALDI IMS에 의해 조직 내 지질의 검출 용 드라이 매트릭스 증착하는 매우 효율적인 방법으로보고되어왔다매트릭스 액정 증착 최소 분석 비국 재화의 TY 많은 습식 증착 방법 1, 2에 비해. 대체로, 그것은 차가운 표면에 가압 샘플과 진공 밀봉 챔버에서 샘플 가루 행렬을 배치하는 것을 포함한다. 장치는 냉각 된 조직 샘플의 표면 상에 분말 형 행렬의 승화 결과, 가열 조 (모래 또는 기름)으로 저하된다. 여기에서 우리는 MALDI IMS를 사용하여 쥐의 뇌에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 1,5- 디아 미노 (DAN) 매트릭스를 사용하여 승화 프로토콜을 설명합니다.

승화 실험 종료 후, 유리에있어서의 두 개의 반쪽들은 응축기를 녹화, 흄 후드와 슬라이드에서 분리된다 (도 3a)를 제거 할 수있다. 이 시점에서, 슬라이드, 다음 슬라이드 조정되어야 할 수도 모래 욕에있어서의 불균일 한 매트릭스 분포, 시간, 온도, 또는 위치를 조사한다. 성공적인 DAN 승화 실험 조직의 해부학 적 특징이 명확하게 가시화 될 수있는 슬라이드 글라스 슬라이드 행렬의 양 표면을 따라 회색 / 갈색 행렬의 짝수 코팅 될 것이다하는 조직의 양 비슷 (그림 3B). 너무 매트릭스 조직에 승화 한 경우, 예를 들어, 매트릭스의 두께가 뚜렷한 것이다 조직 만 일반적인 형태의 기능을 포함한다. 너무 작은 행렬이 승화되는 경우, 조직은 헥타르 것슬라이드 (그림 3C)의 나머지 부분보다 어두운 외관을했습니다. 둘 다 너무 너무 작은 행렬은 MALDI 악기 가난한 신호가 발생합니...

MALDI Imaging Mass Spectrometry를 사용하여 gangliosides를 검출하기 위해 DAN 매트릭스를 쥐의 뇌 조직으로 승화시키는 프로토콜이 제시됩니다.

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

이 승화 프로토콜의 전반적인 목표는 MALDI 이미징 질량 분석 실험에서 강글리오사이드(gangliosides)를 검출하기 위한 상세하고 따라하기 쉬운 시료 준비 과정을 제공하는 것입니다. 이 방법은 건강한 뇌와 뇌 병리 모두에서 강글리오사이드의 해부학적 분포와 기능을 포함하여 신경생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜을 약간만 수정하여 다양한 지질 종의 고품질 이미징에 적용할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 쥐의 뇌 조직을 적출하여 크라이오스탯(cryostat) 준비를 합니다. 그런 다음 조직을 크라이오스탯에 배치합니다. 원하는 해부학적 위치까지 조직을 절편화합니다.절단 두께가 8에서 12 micron 사이가 되도록 하십시오. 크라이오스탯의 안티 롤 바(anti-roll bar)를 사용하여 평평하게 펴진 조직 절편을 천천히 절단합니다. 롤 바의 위치가 잘못되었거나 칼날이 무뎌진 경우, 조직에 구멍이나 자국이 생길 수 있습니다.깨끗한 페인트 붓을 사용하여 조직을 절편 플랫폼의 중앙으로 이동시킵니다. 조직 맵핑을 위해, 절편 제작 중에 전도성 슬라이드나 금속판을 크라이오스탯(cryostat) 내에 배치하여 동결시킵니다. 슬라이드가 완전히 동결되면, 깨끗한 페인트 붓을 사용하여 절편 조직을 슬라이드의 전도성 표면 위로 조심스럽게 옮깁니다.모든 조직 절편이 슬라이드 위에 올바르게 배치되면, 조직 반대편의 슬라이드 아래에 손가락을 대고 절편이 녹을 때까지 누릅니다. 그다음 조직이 부착된 슬라이드를 데시케이터에 5~10분 동안 둡니다. 또는, 가열된 슬라이드를 사용하여 전도성 면이 아래로 향하게 하여 평평하게 펴진 조직 절편 위를 가볍게 누릅니다.흄 후드 내에서 알루미늄 용기에 담긴 모래 중탕조를 핫플레이트 위에 놓습니다. 핫플레이트는 적절한 표면적을 가진 금속 시저 리프트 위에 설치되어 있어야 합니다. 핫플레이트의 전원을 켜고 온도를 140 °C로 설정합니다.온도 피드백 프로브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 모래 온도를 모니터링하고, 온도가 일정하게 유지되도록 합니다. 다음으로, 300 milligrams의 DAN 매트릭스를 승화 장치의 바닥면에 놓습니다. 승화시킬 슬라이드의 대략적인 너비와 길이에 맞게 장치 중앙에 매트릭스를 고르게 펴줍니다.금속판을 장치의 내부 표면에 배치하여 금속판이 응결기의 바닥면에 직접 닿게 하십시오. 빈 테스트 슬라이드를 금속판 표면에 대각선으로 가로질러 배치하고, 슬라이드의 양쪽 끝 가장자리에 테이프를 붙여 고정합니다. 장치의 상단과 하단 부분을 고무 O-링으로 연결하여 중앙 부분이 완전히 밀폐되도록 하십시오.금속 U-조인트를 장치의 중앙에 배치하고, 장치의 상단과 하단 절반이 서로 단단히 밀봉될 때까지 바이스를 조입니다. 그런 다음, 모래 중탕 주변의 금속 O-링 안에 장치를 배치합니다. 이어서, 응축기에 으깬 얼음을 한 줌 넣습니다.콘덴서의 1/4에서 1/2 정도를 찬물로 채워 얼음 슬러시를 만듭니다. 얼음 슬러시는 장치 내부의 금속판을 냉각시키고, 결과적으로 그 위에 부착된 슬라이드를 냉각시킵니다. 온도가 정상 상태에 도달할 때까지 최소 5분 동안 기다립니다.그런 다음, 콜드 트랩 용기에 300 mL의 메탄올을 붓고 유리 기구를 용기 안에 넣습니다. 고무 튜브를 사용하여 진공 펌프를 콜드 트랩 출력단에 연결합니다. 또 다른 고무 튜브를 사용하여 콜드 트랩 입력단을 승화 장치에 연결합니다.금속 클램프를 사용하여 튜브가 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 진공 펌프를 사용하여 30~50 millitorr의 진공 상태를 유지하십시오. 압력 평형을 위해 펌프를 최소 5분 동안 가동하십시오.드라이아이스 조각 2~3개를 콜드 트랩 용기 바닥의 에탄올에 넣습니다. 콜드 트랩은 매트릭스 입자가 진공 펌프에 축적되는 것을 방지하는 역할을 합니다. 진공 펌프를 가동하면 장치 내부의 압력이 감소하므로 승화 장치의 U-링에 고정된 바이스를 조여야 할 수도 있습니다.모래탕 온도가 140 °C로 안정되었는지 확인하십시오. 또한 진공 장치가 켜져 있는지, 그리고 모든 튜브가 연결된 상태로 장치가 모래탕 위의 금속 O-링에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 타이머를 7분으로 설정하되, 아직 시작하지는 마십시오.시저 리프트와 모래 중탕기를 승화 장치까지 천천히 올려, 승화기의 U-조인트가 금속 O-링보다 충분히 높게 위치하도록 합니다. 이렇게 여유 공간을 두면 모래 위에서 장치를 조정할 수 있습니다. 승화기를 모래 표면에 가볍고 빠르게 눌러 장치가 모래 위에 균일하게 안착되었는지 확인합니다.그런 다음, 즉시 타이머를 시작하십시오. 타이머가 울리면 진공 펌프를 끄고, 승강기를 조심스럽게 내려 승화기가 모래 중탕에 더 이상 닿지 않고 금속 O-링에 안정적으로 안착하도록 하십시오. 마이크로 벤트 밸브를 천천히 풀어 장치 내부의 압력을 해제하십시오.승화 장치의 고무 튜브 주변에 있는 금속 클램프를 풀고, 튜브를 천천히 헐겁게 하기 시작합니다. 고무 튜브가 약간 느슨해지면, 튜브를 한쪽으로 구부려 잔류 압력이 빠져나가게 합니다. 주변 압력으로 돌아오면, 승화 장치에서 고무 튜브를 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 장치의 U-조인트에 있는 바이스를 풀어 제거합니다. 승화 장치의 두 부분을 조심스럽게 분리하고 내부 유리 기구 상단에서 슬라이드를 뽑아냅니다. 슬라이드를 확인하여 매트릭스가 균일하게 분포되었는지 확인합니다.승화된 매트릭스의 분포와 양이 충분하다면, 조직이 부착된 새 슬라이드를 승화기 내부에 테이프로 고정하고 승화 과정을 반복하십시오. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 이미징 및 분석을 진행합니다. 질량 분석 스펙트럼은 1000에서 2000의 질량 범위 내에서 아놀라이트(anolytes)의 이온 풍부도를 나타냅니다.주요 A-계열 강글리오사이드가 스펙트럼을 따라 표시되어 있습니다. 여기에는 쥐 뇌 내 강글리오사이드의 해당 분자 이미지가 나타나 있습니다. 이 분자 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 중첩 및 의사 색상 처리(pseudocolored)를 통해 여러 강글리오사이드 종의 해부학적 분포를 색상 코드로 보여줍니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 보고된 프로토콜에서 흔히 누락되는 시료 준비 과정의 많은 변수가 IMS 결과의 품질에 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이 절차를 수행할 때는 각 실험 후 승화되는 매트릭스의 양을 모니터링하고, 슬라이드에 맞게 승화 시간을 적절히 수정하는 것이 중요합니다. 이 기술은 개발 이후 연구자들이 뇌 손상, 신경 퇴행성 질환 및 자연 노화 과정에서 ganglioside와 같은 막 지질의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 방법은 뇌 내 지질의 풍부함과 해부학적 분포에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 뇌 외 조직을 포함한 다른 시스템과 식물 및 곤충 모델에도 적용될 수 있습니다. 손상된 뿌리를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 장갑, 마스크 및 보안경과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

L-DOPA를 사용하여 도파민 대체 약물은 파킨슨병에서 가장 일반적으로 사용되는 증상을 치료하지만, 불수의 이상 운동, 되나 운동 이상증을 포함한 부작용이...

파킨슨병의 Neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법

면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

대기압에서 작동하는 질량 분석 이미징(MSI) 소스는 중적외선 레이저 탈착과 전기 분무 후 이온화를 결합하여 개발되었습니다. 외인성 얼음 매트릭스는 조직 관련 물질의 공명 탈착을 촉진하기 위해 에너지 흡수 매트릭스로 사용되었습니다. 이 원고는 전신 신생아 마우스의 IR-MALDSI MSI를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

강글리오사이드는 시알산 함유 글리코스핑고지질로서 뇌에 특히 풍부하다. 양친매성 성질은 최적의 회수와 정확한 분석을 보장하기 위해 유기/수성 추출 및 정제 기술을 필요로 합니다. 이 기사에서는 분석 및 분취 스케일 강글리오사이드 추출, 정제 및 박층 크로마토그래피 분석에 대한 개요를 제공합니다.

Ganglioside 추출, 정제 및 프로파일링

뇌 오가노이드의 질량 분석 이미징(MSI)을 위한 고급 방법이 개발되어 이러한 모델 내에서 대사 산물 분포를 매핑할 수 있습니다. 이 기술은 초기 발달 및 질병 단계에서 뇌 대사 경로와 대사 산물 서명에 대한 통찰력을 제공하여 인간의 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해를 약속합니다.

질량분석법을 사용한 인간 뇌 오가노이드의 분자 이미징 

이 프로토콜은 형광 유도 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법에 microMS를 사용하여 1차 쥐 신경 세포의 분자 프로파일링을 향상시키는 방법을 설명합니다.

Fluorescence-Guided Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Laser-Induced Postionization Mass Spectrometry of Individual Rat Neural Cells

이 프로토콜은 질량분석법 영상을 이용해 글리코겐과 N-결합 당류를 엄격하고 재현 가능하게 측정하기 위한 주요 단계를 상세히 설명합니다.

질량분석법을 이용한 글리컴의 공간 분자 영상

배우세요 MALDI 이미징 질량 분석을 이용한 쥐 뇌 조직에서 강글리오사이드 검출 및 시각화를 위한 DAN 매트릭스 승화 기법. 이 방법은 신경생물학 연구에서 지질 분포와 기능을 이해하는 데 활용됩니다.

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

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