MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

이 승화 프로토콜의 전반적인 목표는 MALDI 이미징 질량 분석 실험에서 강글리오시드를 검출하기 위해 상세하고 따라하기 쉬운 샘플 준비 프로세스를 제공하는 것입니다. 이 방법은 건강한 뇌와 뇌 병리학 모두에서 강글리오사이드의 해부학적 분포 및 기능을 포함하여 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 지질 종의 고품질 이미징에 적용할 수 있고 프로토콜에 대한 변경이 거의

이 절차를 시작하려면 쥐에서 뇌 조직을 추출하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 저온 정지를 준비합니다. 그런 다음 조직을 저온 유지 장치에 넣습니다. 원하는 해부학적 위치까지 조직을 절단합니다.

절단 두께가 8미크론에서 12미크론 사이인지 확인하십시오. cryostat 안티 롤 바를 사용하여 조직 섹션을 천천히 평평하게 만듭니다. 롤 바 배치가 잘못되었거나 블레이드가 무딘 경우 조직에 구멍이나 표시가 발생할 수 있습니다.

깨끗한 페인트 브러시를 사용하여 조직을 슬라이싱 플랫폼의 중앙으로 이동합니다. 조직을 매핑하려면 전도성 슬라이드나 금속판을 자르는 동안 저온 유지 장치에 넣어 동결합니다. 슬라이드가 완전히 얼면 깨끗한 페인트 브러시를 사용하여 섹션 조직을 슬라이드의 전도성 서비스로 조심스럽게 이동합니다.

모든 조직 섹션이 슬라이드에 올바르게 배치되면 티슈 맞은편 슬라이드 아래에 손가락을 놓고 섹션이 해동될 때까지 누릅니다. 그런 다음 티슈와 함께 슬라이드를 건조기에 5-10분 동안 놓습니다. 또는 따뜻한 슬라이드를 사용하여 전도성이 있는 면이 아래로 향하게 하여 평평한 조직 부분에 대해 가볍게 누릅니다.

흄 후드에서 작업하면서 알루미늄 용기에 담긴 모래 목욕을 핫플레이트에 놓습니다. 핫플레이트는 적절한 표면적의 금속 가위형 리프트에 있어야 합니다. 핫플레이트를 켜고 온도를 섭씨 140도로 설정합니다.

온도 피드백 프로브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 모래 온도를 모니터링하고 온도 일관성을 보장합니다. 다음으로, 300mg의 DAN 매트릭스를 승화 장치의 바닥 표면에 놓습니다. 매트릭스를 장치 중앙의 균일한 층으로 승화되는 슬라이드의 대략적인 너비와 길이까지 펼칩니다.

플레이트가 콘덴서 바닥과 직접 접촉하도록 장치의 내부 표면에 금속판을 놓습니다. 슬라이드의 바깥쪽 가장자리에 테이프를 붙인 상태에서 금속판 표면을 대각선으로 가로지르는 빈 테스트 슬라이드를 테이프로 붙입니다. 장치의 상단과 하단 부분을 중간에 고무 O-링으로 연결하여 완전히 밀봉되도록 합니다.

장치 중앙에 금속 U-조인트를 놓고 장치의 위쪽 및 아래쪽 절반이 단단히 밀봉될 때까지 바이스를 조입니다. 그런 다음 장치를 모래 수조 주변의 금속 O-링에 놓습니다. 다음으로 콘덴서에 으깬 얼음 한 줌을 넣습니다.

콘덴서에 찬물을 1/4에서 1/2 정도 채워 얼음 슬러시를 만듭니다. 얼음 슬러시는 장치 내부의 금속판을 냉각시키고 이후에 슬라이드가 부착됩니다. 온도가 안정된 상태에 도달할 때까지 최소 5분 동안 기다립니다.

그런 다음 콜드 트랩 용기에 메탄올 300mL를 붓고 유리 그릇을 용기에 넣습니다. 고무 튜브를 사용하여 진공 펌프를 콜드 트랩 출력에 연결합니다. 다른 고무 튜브를 사용하여 콜드 트랩 입력을 승화 장치에 연결합니다.

튜브가 금속 cl을 사용하여 단단히 고정되었는지 확인하십시오.amps. 진공 펌프를 사용하여 30-50 millitorr의 진공을 제공하십시오. 압력 평형을 위해 펌프를 최소 5분 동안 작동시키십시오.

콜드 트랩 용기 바닥에 있는 에탄올에 작은 드라이아이스 조각 2-3개를 떨어뜨립니다. 콜드 트랩은 매트릭스 입자가 진공 펌프에 축적되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 승화 장치의 U-링에 있는 바이스는 장치의 압력 감소로 인해 진공 펌프가 켜지면 조여야 할 수 있습니다.

모래 수조 온도가 섭씨 140도에서 안정화되었는지 확인하십시오. 또한 진공 청소기가 켜져 있고 모든 튜브가 연결된 상태에서 장치가 모래 수조 위의 금속 O-링에 고정되어 있는지 확인하십시오. 타이머를 7분으로 설정하되 타이머를 시작하지 마십시오.

승화기의 U-조인트가 금속 O-링보다 훨씬 위에 있을 때까지 가위 리프트와 모래 목욕을 승화 장치까지 천천히 올립니다. 이 여분의 공간을 통해 모래 위에서 장치를 조정할 수 있습니다. 장치가 모래 위에 고르게 놓이도록 모래 표면을 빠르게 부드럽게 누릅니다.

그런 다음 즉시 타이머를 시작하십시오. 타이머가 울리면 진공 펌프를 끄고 승화기가 더 이상 모래 욕조에 닿지 않고 금속 O-링에 단단히 고정될 때까지 시저 리프트를 조심스럽게 내립니다. 마이크로 벤트 밸브를 천천히 풀어 장치의 압력을 해제합니다.

승화 장치의 고무 튜브 주위에 있는 금속 클램프를 풀고 천천히 튜브를 풀기 시작합니다. 고무 튜브가 약간 느슨해지면 튜브를 한쪽으로 구부려 잔류 압력이 빠져나갈 수 있도록 합니다. 주변 압력이 돌아오면 승화 장치에서 고무 튜브를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 장치의 U- 조인트에있는 바이스를 풀고 제거하십시오. 승화 장치의 두 반쪽을 조심스럽게 분리하고 내부 유리 제품 상단에서 슬라이드를 당겨 빼냅니다. 슬라이드를 검사하여 균일한 행렬 분포를 확인합니다.

승화된 매트릭스의 분포와 양이 충분하면 승화기 내부에 조직이 있는 새 슬라이드를 테이프로 붙이고 승화 과정을 반복합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징 및 분석을 수행합니다. 질량 스펙트럼은 1000에서 2000 질량 범위 내에서 양극질의 이온 풍부함을 표시합니다.

주요 A 시리즈 강글리오사이드는 스펙트럼을 따라 표시되어 있습니다. 여기에 보이는 것은 쥐의 뇌에 있는 강글리오사이드의 해당 분자 이미지입니다. 분자 이미지는 색상 코딩을 통해 여러 ganglioside 종의 해부학적 분포를 보여주며, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 오버레이되고 의사 착색되었습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 샘플 준비 프로세스에 보고된 프로토콜에서 종종 누락되는 IMS 결과의 품질에 영향을 줄 수 있는 많은 변수가 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 실험 후에 승화되는 매트릭스의 양을 모니터링하고 슬라이드에 따라 승화 시간을 수정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 뇌 손상, 너존 질환 및 자연적인 노화 과정 후 강글리오사이드와 같은 막 지질의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 방법은 뇌 내 지질의 풍부함과 해부학적 분포에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 뇌 외부의 조직, 심지어 식물 및 곤충 모델을 포함한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 손상된 뿌리로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때는 항상 장갑, 마스크 및 보안경과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.