MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

MALDI 이미징 질량 분석법은 저희가 유기체, 생리학적, 병리학적인 상태를 나타내는 관계되는 대사 산물 풍부함 및 배급을 측정하고 구상하는 것을 허용하는 변화체학의 분야에 있는 유일한 전진입니다. MALDI Imaging의 주요 장점은 라벨링할 필요 없이 C2에서 대사 산물을 검출할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하기 위해 Dr.Patricia Casita 연구실의 대학원생인 Sami Sauma

Yuki Chen과 Kelly Veerasammy, 제 연구실의 학생 연구원. 수확 후 즉시 조직을 액체 질소, 냉각, 알루미늄 호일 보트와 폴리스티렌 상자에 넣었습니다. 폴리스티렌 상자의 뚜껑을 둘러싸서 조직의 크기에 따라 2-10 분 동안 조직을 동결시킵니다.

조직이 충분히 얼면 집게를 사용하여 보트를 제거하고 드라이 아이스의 호일 안에 고정된 조직을 저온 유지 장치로 운반합니다. 조직을 절단하기 전에 슬라이드에서 숨을 쉬지 않도록 주의하십시오. 장갑과 저항으로 설정된 전압계를 사용하여 분석을 위해 적절한 수의 MALDI 호환 인듐 주석 코팅 유리 슬라이드의 전도도를 테스트합니다.

라벨을 붙인 후 깨끗한 종이 타월과 섭씨 영하 20도로 설정된 70% 에탄올 세척 저온 유지 장치에 슬라이드를 놓습니다. 조직 샘플을 저온 유지 장치에 넣고 조직의 유형에 따라 저온 유지 장치 챔버와 표본 헤드의 온도를 설정합니다. 조직이 30분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 후 극저온 조직 임베딩 컴파운드를 사용하여 조직을 척에 장착합니다.

그리고 깨끗한 칼날을 무대에 놓고 잠그고 무대의 위치와 표본의 각도를 조정하여 원하는 절단 각도를 얻습니다. 그리고 관심 영역이 드러날 때까지 조직을 절단합니다. 원하는 영역에 도달하면 10-12 미크론 두께의 단면을 확보하고 사전 냉각된 브러시를 사용하여 각 단면을 획득할 때 각 슬라이드의 라벨이 붙은 면에 각 단면을 신중하지만 빠르게 수집합니다.

슬라이드에 안전하게 장착할 수 있도록 슬라이드 아래에 손가락을 대고 섹션을 따뜻하게 합니다. 섹션은 5-10초 후에 투명해지고 약 30-60초 후에 불투명해집니다. 모든 섹션이 수집되면 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 드라이 아이스를 신성모독자에게 운반합니다.

또는 슬라이드를 진공 상자에 넣어 운반할 수 있습니다. 슬라이드를 건조제가 든 세속기에 놓고 45-60분 동안 슬라이드를 진공 건조합니다. 건조 후 즉시 사용하지 않을 경우 슬라이드를 슬라이드 트랜스포터에 넣고 트랜스포터에 질소를 채웁니다.

파라필름으로 홀더를 밀봉하고 홀더를 지퍼 백에 넣습니다. 그런 다음 첫 번째 지퍼 백을 섭씨 영하 80도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있는 건조제가 들어 있는 두 번째 라벨이 붙은 지퍼 백에 넣습니다. 탈수 후에, 조직 단면도의 이상으로 활주의 빈 공간에 X 표를 두기 위하여 대담한 점 은색 감적을 이용하고 MALDI 활주 금속 표적으로 각 은 X.Load의 위에 두번째 까만 검정 X를 두기 위하여 감적을 이용하고 활주 위에 플라스틱 덮개를 두십시오.

플라스틱 덮개에 샘플 위치를 간략하게 설명하고 슬라이드와 MALDI 타겟을 평판 스캐너 표면에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 미리 보고 원하는 영역을 선택합니다. 슬라이드를 16비트 그레이 스케일, 2, 인치당 400도트로 스캔하고 나중에 사용할 수 있도록 이미지를 저장합니다.

슬라이드에 매트릭스를 적용하려면 자동 매트릭스 분무기 장치를 켜고 밸브가 부하 위치에 있는지 확인하고 분무기 소프트웨어를 시작하십시오. 배기 팬이 제대로 작동하는지 확인하고 통신 탭에서 시스템이 올바르게 통신하고 있는지 확인합니다. 용매 펌프를 분당 100마이크로리터로 시작하고 제곱인치당 약 500파운드의 배압을

그리고 질소 탱크를 제곱인치당 30파운드로 설정하여 매트릭스 분무기로의 압축 공기 흐름을 시작합니다. 분무기 전면의 압력 조절기를 제곱인치당 10파운드로 조정하고 분무기 노즐 온도를 원하는 대로 설정합니다. 밸브와 로드 위치에서 주사기를 사용하여 70% 메탄올 7밀리리터로 루프를 플러시한 후 루프에 매트릭스 6밀리리터를 채웁니다.

빈 유리 슬라이드를 홀더와 분무기에 넣고 양쪽 끝을 테이프로 눌러 움직임을 방지하고 유속과 온도가 안정적인지 확인합니다. 시작을 눌러 노즐 온도를 설정하고 선택한 방법에 맞게 펌프 유량을 조정합니다. 밸브를 부하에서 스프레이로 전환하고 계속을 클릭합니다.

시스템이 완료될 때까지 실행되도록 허용했습니다. 증착이 완료되면 밸브를 스프레이에서 로드로 전환하고 계속을 클릭합니다. 현미경으로 매트릭스 코딩 패턴을 조사합니다.

미세한 매트릭스 결정의 균일한 층이 관찰되면 방금 설명한 대로 매트릭스를 적절한 샘플 슬라이드에 증착합니다. 모든 슬라이드가 처리되면 분무기 노즐이 막히지 않도록 제조업체의 지침에 따라 시스템을 청소하십시오. 여기에서는 100 Dalton 간격마다 선택된 질량 방전 스펙트럼의 MALDI MS 이미징 데이터 분석의 출력 이미지를 보여주며, 이는 저분자 대사 산물에서 고분자량 지질에 이르는 스펙트럼 식별에 대한 유용성을 명확하게 보여줍니다.

각 도로는 출생 후 1일, 21일 및 60일에 수집된 세 가지 조직에 걸쳐 특정 대사 산물 종의 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함하는 이온 히트 맵을 묘사합니다. MALDI MSI 방법론의 강점은 발달 이정표 또는 특정 해부학적 구조에 대한 질량 대 전하 비율로 식별되는 특정 종의 특이성을 식별할 수 있는 능력입니다. 이 분석에서 일부 대사 산물은 성인의 출생 후 1일 신생아 또는 출생 후 60일째에 풍부하거나 테스트 연령에 걸쳐 균일하게 분포하는 것으로 관찰되었습니다.

다른 분자 종은 회백질, 백질 또는 뇌척수액 및 심실에서 특이적으로 풍부하게 관찰되었습니다. 하이포잔틴(hypoxanthine), 글루탐산(glutamic acid), N-아세틸 아스파르트산(N-acetyl aspartic acid), 아라키돈산(arachidonic acid) 및 여러 지질(lipid)을 포함한 대표적인 대사 산물의 공간 분포도 분석했습니다. 대사 상태(metabolic stata)의 충실도를 유지하기 위해서는 적절한 검체 해부, 보관 및 사이로 절편이 인위적인 대사 변화를 방지하는 데 중요합니다.

MALDI 실험을 수행한 후 발견한 대사 산물의 정체를 확인할 수 있습니다. 이는 mirco-extraction 및 액체 크로마토그래피 탠덤 MS를 통해 달성할 수 있습니다. MALDI MS Imaging은 공간 해상도로 대사체학 기반 조사를 용이하게 하고 연구자에게 정량적 및 시각적 매체에서 대사 데이터를 확인할 수 있는 기회를 제공합니다. 최근 식단이 신경퇴행성 질환에 미치는 영향, 장내 마이크로바이옴과 뇌의 관계

따라서 신경 발달에서 신경 퇴행에 이르기까지 신경 과학에서 신진대사 연구는 매우 중요합니다. 장-뇌 상호 작용의 주요 사실. 그리고 MALDI 이미징 시설 아이디어가 특정 조작이 뇌에 있을 수 있는 효과를 시각화하는 데 실제로 뛰어난 기술을 제공할 수 있는 것은 이러한 맥락에서 이루어집니다.