많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

본 영상의 목적은 토양 미생물 군집 구조 결정 및 다량의 샘플을 이용한 연구를 위해, 전체 지질 및 지표 지질의 상대적 함량을 모두 분석하는 데 필요한 노력과 정확도의 균형을 맞추면서 처리량을 높이는 미생물 세포막 지질 추출 방법을 설명하는 것입니다. 현장에서는 토양의 불균질성을 고려하여 해당 부지를 대표할 수 있는 방식으로 토양 샘플을 수집해야 합니다. 샘플링 시점의 미생물 군집을 보존하기 위해, 샘플은 현장에서 얼음에 채워 운송해야 합니다.

실험실로 돌아오면, 거친 체질을 통해 뿌리와 돌을 제거하고 덩어리를 부숩니다. 이 과정은 시료를 균질화하는 역할도 합니다. 하위 시료들을 적절한 용기에 담아 동결 건조를 준비하고, 가능한 한 빨리 동결 건조하십시오.

토양을 동결 건조한 후, 추출 전까지 데시컨트가 포함된 밀폐 용기에 보관하십시오. 동결 건조된 토양은 -80 °C에서 보관하는 것이 가장 좋습니다. 추출 준비 단계로 보관 중인 동결 건조 토양을 꺼내어 분쇄하십시오. 분쇄 방법으로는 볼 밀(ball mill), 볼 메터(ball meter) 또는 막자사발을 사용할 수 있습니다.

토양을 분쇄한 후, 토양 시료를 다시 충분히 균질화하여 냉동고에 보관하십시오. 모든 실험 기구는 매우 깨끗해야 합니다. 잔류 세제, 그리스 또는 오염 물질은 최종 GC 크로마토그램에서 피크로 나타나 결과에 영향을 줄 수 있습니다.

추출은 용매로 헹궈낸 30 milliliter 테플론 원심분리 튜브에서 수행합니다. 튜브에 hexane 2~3 milliliter를 넣고 몇 초 동안 볼텍싱합니다. hexane을 다른 튜브로 옮겨 담은 후 다시 볼텍싱합니다.

2~3 mL의 hexane을 사용하여 6개의 튜브를 연속적으로 헹굴 수 있습니다. hexane으로 헹군 튜브는 흄 후드 내에 거꾸로 세워 보관하고, 사용한 hexane은 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 유리 기구는 사용 직전에 소성 처리하거나 용매로 헹구어 사용할 수 있습니다.

머플링(Muffling)은 고온에서 잔류물을 산화시켜 유리 기구가 깨끗하게 유지되도록 합니다. 유리 기구를 알루미늄 호일로 2~3겹으로 감싼 뒤 머플 가마(muffle furnace)에 넣습니다. 온도를 450 °C로 설정하고, 가마가 설정 온도에 도달하면 최소 4시간 30분 동안 굽습니다.

가열로에서 꺼내기 전 최소 1시간 동안 냉각시키십시오. 헥산으로 헹군 테플론 튜브에 라벨을 붙이고 무게를 잽니다. 테플론 원심분리 튜브에 토양을 넣고 토양 질량을 측정하기 위해 다시 무게를 잽니다.

추출이 제대로 이루어졌는지 확인하려면 배치당 최소 두 개의 공시료(blank)를 만들고, 가급적 이전에 추출한 적이 있는 토양과 같은 확인 표준물질을 포함하십시오. 지질 추출. 인산염 완충액, 클로로포름 및 메탄올을 위한 5~10 mL 리피펫(re-pipette) 3개를 준비합니다.

클로로포름은 표면 장력이 낮고 밀도가 매우 높은 액체입니다. 분주하는 양이 정확하고 일정하도록 주의하십시오. 병의 액체 양을 최소 절반 이상으로 유지하십시오.

흄 후드 내에서 테플론 튜브에 담긴 토양에 인산염 완충액, 클로로포름, 메탄올 순으로 시약을 추가합니다. 이는 시료 물질로부터 지질을 물리적으로 1차 추출하는 단계입니다. 시약 용액의 조제법은 서면 프로토콜에 포함되어 있습니다.

유기상과 수성상을 적절하게 분리하기 위해서는 용매의 비율과 첨가 순서가 중요합니다. 버퍼를 첨가한 후 클로로포름을 넣기 전에 토양이 충분히 적셔질 수 있도록 시간을 두십시오. 편리한 경우, 두 번째 및 그 이후의 추출 단계에서는 추출액들을 혼합하여 단일 분량으로 한 번에 첨가할 수 있습니다.

테플론 튜브의 캡을 단단히 닫고 빛으로부터 보호하기 위해 덮어줍니다. 튜브가 잘 고정되었는지 확인하며 쉐이커 위에 수평으로 놓습니다. 속도를 'high'로 설정하고 1시간 동안 흔들어 줍니다.

튜브를 흔드는 동안, 각 시료당 두 개의 긴 유리 튜브를 다음과 같이 준비합니다. 튜브에 라벨을 부착하고, 토양에 첨가했던 것과 동일한 부피의 클로로포름과 동일한 부피의 인산염 완충액을 넣습니다. 25 °C의 쉐이커에서 테플론 튜브를 꺼낸 후, 2,500 RPM에서 10분 동안 튜브를 원심 분리합니다.

그런 다음, 조명을 끈 상태의 흄 후드 내에서 테플론 튜브의 상층액을 긴 튜브 중 하나로 옮깁니다. 유리 튜브에서 층 분리가 관찰되어야 합니다. 하층에는 주로 클로로포름과 같은 유기 용매와 지질이 포함되어 있습니다.

이 추출 과정을 반복합니다. 상층액을 이전에 준비한 두 번째 튜브에 붓습니다. 이렇게 하면 토양에서 지질을 물리적으로 두 번 추출하게 됩니다.

대부분의 토양의 경우, 이 정도면 충분합니다. 모든 롱 클래스 튜브를 테플론 코팅 캡으로 단단히 닫고 10회 정도 뒤집어 섞어줍니다. 하룻밤 동안 중력 분리를 통해 상을 분리합니다.

두 상이 완전히 분리될 때까지 샘플을 하룻밤 동안 그대로 둡니다. 이를 위해 샘플을 어두운 보관함에 넣거나 알루미늄 호일로 감싸 실온에 보관하십시오. 추출물이 주말 동안 분리되도록 두어도 무방합니다.

둘째 날, 지질 분리 과정입니다. 둘째 날에는 수성층을 흡입하여 제거하고, 진공 증발 시스템을 통해 용매를 제거함으로써 지질을 농축합니다. 또한, 샘플을 워터배스나 샌드배스에 넣고 질소 가스를 완만하게 흘려주어 건조시킬 수도 있습니다.

이제 튜브 속의 액체는 잘 분리되어 대부분 투명해야 합니다. 그렇지 않거나 두 층 사이의 경계면이 특히 두꺼운 경우, 하루 더 분리 과정을 진행하십시오. 후드 내에 진공 흡입기를 설치하십시오.

이것은 Tygon 튜브와 파스퇴르 피펫으로 진공 펌프에 연결된 사이드 암 플라스크입니다. 펌프를 작동시킨 상태에서 피펫을 사용하여 수성층을 플라스크로 빨아들입니다. 상층부와 계면을 흡입하십시오.

이는 약 2/3 지점이 될 것입니다. 2~3 세트의 유리관에 대해 동일하게 수행하십시오. 상층에는 약간의 토양 입자가 포함될 수 있습니다.

가능한 경우 이를 제거하십시오. 두 번째 또는 세 번째 튜브 세트의 추출물을 조심스럽게 디캔팅하여 처음 두 튜브의 추출물과 합치십시오. 고체 물질이 섞여 들어가지 않도록 주의하며 튜브를 회전시켜 벽면을 헹구십시오.

각 샘플마다 깨끗한 피펫을 사용하고, 나머지 샘플에 대해 이 과정을 반복하십시오. 클로로포름 추출물을 합친 후 몇 분 동안 그대로 두었다가 액체 표면을 확인합니다. 흔히 잔류수의 얇은 층이 형성됩니다.

이 물질이 존재한다면, 다음 단계로 진행하기 전에 흡입하여 제거하십시오. 잔류수가 지방산 이중 결합을 공격할 수 있으나, 시료를 건조할 때 아주 적은 양은 용매와 함께 공증발될 것입니다. 진공 증발 장치를 사용하여 모든 시료를 건조하십시오.

튜브 캡을 단단히 닫고 -80°C 냉동고에 보관하십시오. 3일 차, 비누화 및 메틸화 단계입니다. 먼저 항온수조의 전원을 켭니다. 수위를 확인하고 1번 수조는 95°C로, 2번 수조는 80°C로 설정하십시오. 리피펫을 사용하여 건조된 지질에 비누화 시약인 Reagent 1을 1mL 첨가하십시오.

캡을 단단히 닫고 짧게 볼텍싱한 후 랙에 세워 둡니다. 이 단계가 끝나면 튜브 랙을 95 °C 항온 수조에 넣고 5분간 기다립니다. 수조에서 튜브 랙을 꺼내 튜브에 누출이 없는지 확인합니다.

이는 튜브 내에서 거품처럼 기포가 올라오는 것으로 확인할 수 있습니다. 누출되는 튜브의 캡을 다시 조이거나 교체하십시오. 워터 배스에서 튜브를 10분 동안 더 가열하십시오.

항온수조의 온도 설정을 80 °C로 낮추고 15분 동안 추가로 배양합니다. 튜브를 꺼내어 랙을 수돗물이 담긴 팬에 넣어 식힙니다. 얼음물을 사용하지 마십시오.

시료가 식으면, 각 시료에 2 mL의 메틸화 시약(시약 2)을 첨가합니다. 다시 캡을 단단히 닫고 5~10초 동안 볼텍싱합니다. 시약이 과량으로 들어가면 용액에 입자 형태의 염이 침전물로 보일 수 있으며, 이는 때때로 발생하는 현상입니다.

랙을 80 °C 항온수조에 넣고 10분 동안 배양합니다. 튜브가 담긴 랙을 항온수조에서 꺼내어 냉각을 위해 수돗물이 담긴 팬에 넣습니다. 랙을 흔들어 냉각 과정을 가속화합니다.

리피펫을 사용하여 각 튜브에 헥산과 메틸 tert-부틸 에테르(시약 3) 1.25 milliliters를 넣어 상을 추출합니다. 캡을 단단히 밀봉하고 튜브를 쉐이커에 올려 10분 동안 흔들어 줍니다. 흔든 후에는 상이 분리될 수 있도록 튜브 랙을 10분 동안 그대로 둡니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 현재 상층에 위치한 유기층을 짧은 유리관으로 옮깁니다. 액체의 대부분을 회수하는 것이 좋습니다. 아주 적은 양의 수성층이 섞여 들어가더라도 추출에는 지장이 없습니다.

시약 3을 첨가하고 흔든 뒤, 층이 분리되도록 두고 상층액을 옮기는 수성 상 추출 과정을 반복합니다. 하층의 상태에 따라 이 과정을 한 번 더 반복하여 총 세 번의 전이를 수행할 수 있습니다. 짧은 튜브에 담긴 추출물에 수산화나트륨 희석액인 염기성 세척액 시약 4를 3 milliliter 첨가합니다.

시험관 뚜껑을 단단히 닫고 20~30초 동안 볼텍싱한 후, 2,000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층의 유기상을 흡입하고 4mL 갈색 바이알로 옮깁니다. 이때 수성상이 흡입되지 않도록 각별히 주의하십시오.

다음 단계는 진공 증발 장치에서 용매를 완전히 증발시키는 것입니다. 4일 차에는 GC 분석을 위해 추출물을 준비합니다. 피펫을 사용하여 건조된 상이 들어 있는 4 mL 바이알 각각에 시약 3을 100 µL씩 첨가합니다.

시료를 볼텍스한 후 10분 동안 그대로 둡니다. 두 번째 피펫을 사용하여 현탁된 FAMEs를 GC 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. 4 mL 바이알에 용매의 또 다른 분취량을 추가하고 짧게 볼텍스합니다.

바이알 벽면에 남아 있는 FAMEs가 완전히 용해되도록 바이알을 굴려줍니다. 두 번째 피펫을 사용하여 용매를 GC 바이알로 옮깁니다. 세 번째 용매 분량을 바이알에 추가하고 볼텍싱한 후, 이를 GC 바이알로 옮겨 전송 과정을 완료합니다.

GC 바이알의 캡을 닫고 냉동고에 보관하십시오. 분석 전까지 밀봉된 GC 바이알을 냉동고에 보관하십시오. GC 분석.

이 시스템을 사용하려면 특정 GC 컬럼을 이용하여 분석을 수행해야 합니다. 가스 크로마토그래프에는 비활성화된 유리 울 플러그가 장착된 4 mm ID 유리 인렛 라이너가 포함된 split splitless 인렛이 설치되어 있습니다. 인렛은 250 °C로 설정되며 정압 모드로 작동합니다.

운반 가스로는 수소를 사용합니다. 검출기 보조 가스로는 질소와 공기가 필요합니다. Agilent Ultra 2 컬럼을 사용합니다.

컬럼의 길이는 25 m이며, 내부 직경은 2 mm, 고정상 막 두께는 33 µm입니다. 이 컬럼의 고정상은 5% phenyl, 95% methylpolysiloxane으로, DB-5 타입 컬럼으로도 알려져 있습니다. 지질 추출물을 분석하기 위해, 2 µL의 분취액을 100:1 분할 비율로 주입하며 이때 오븐 온도는 170 °C로 설정합니다. 주입 후, 오븐 온도가 분당 5 °C씩 300 °C까지 상승하도록 프로그래밍한 뒤 12분 동안 유지합니다.

MIDI 표준 시료를 일련의 주입 과정을 통해 분석하고, 그 결과에 따라 MIDI 매뉴얼의 지침대로 조정을 수행합니다. 이렇게 보정이 완료되면 때때로 미세한 조정이 필요할 수 있으나, 일반적으로 이 파라미터들을 사용하여 양호한 결과를 얻을 수 있습니다. MIDI 시스템은 각 샘플에 대해 검출된 피크당 한 줄로 구성된 표가 포함된 보고서를 생성합니다.

소프트웨어는 피크 유지 시간, 피크 면적, 피크 식별 결과와 함께 피크 식별에 사용되는 파라미터인 ECL(추정 사슬 길이) 및 유지 시간에 따른 변동과 검출기 응답을 정규화하는 데 사용되는 파라미터인 응답 계수를 보고합니다. ECL은 일련의 직쇄 FAMEs 중에서 각 미지의 FAME이 어느 위치에서 용출되는지를 나타냅니다. 예를 들어, 미지 시료의 유지 시간이 탄소 사슬 12개와 13개인 시료의 유지 시간 중간에서 용출된다면, ECL은 탄소 사슬 12.5개로 보고됩니다.

소프트웨어는 각 피크의 ECL을 데이터베이스에 있는 FAMEs의 ECL과 비교하며, 일치하는 경우 해당 이름을 미지 시료에 할당합니다. 데이터베이스 내 두 FAMEs의 ECL이 매우 유사한 경우, 소프트웨어는 가장 가까운 이름을 우선으로 하여 두 이름 모두를 보고합니다. 보고서의 데이터 테이블은 스프레드시트나 데이터베이스로 취합할 수 있습니다.

응답 계수를 보정한 후, 피크 면적을 외부 또는 내부 표준 물질의 피크 면적과 비교하여 추출물의 농도를 구할 수 있습니다. 추출된 토양의 질량으로 나누면, 데이터는 토양 g당 FAME의 질량으로 표현하거나, 각 FAME의 분자량을 함께 사용하여 토양 g당 나노몰(nanomoles)로 표현할 수 있습니다. 이후 바이오마커 FAME들을 합산하여 미생물 길드(guild)의 생물량(biomass)을 산출할 수 있으며, 이러한 길드들에 대해 추가적인 분석이 가능합니다.

예를 들어, 여기서는 비료를 주지 않은 초원이 비료를 준 초원보다 더 많은 FAME 생물량을 보이는 것을 알 수 있습니다. 두 경우 모두 인근 옥수수밭보다 더 많은 생물량을 가지고 있습니다. 또한, FAME는 곰팡이 또는 박테리아와 같은 특정 기능 그룹과 연관되어 있습니다.

이러한 연관성은 생태계마다 다르므로, 이를 과도하게 일반화하지 않는 것이 중요합니다. 이러한 유형의 분석은 특정 그룹이 특정 환경에서 더 풍부한지를 보여줍니다. 여기서는, 비료를 주지 않은 초원이 옥수수밭보다 균류가 더 풍부합니다.

마지막으로, 전체 미생물 군집 조성을 살펴보는 또 다른 방법은 비계량적 다차원 척도법(nonmetric multidimensional scaling, NMDS) 또는 주성분 분석(principal components analysis, PCA)과 같은 서열화 방법을 사용하여 모든 FAME의 상대적 풍부도를 한 번에 비교하는 것입니다. 서열화 분석에서 미생물 군집의 유사성이 높을수록 서로 더 가깝게 배치됩니다. 따라서 예시 데이터에서 옥수수와 비시비 초원은 서로 매우 멀리 떨어져 있는 반면, 일부 시비 초원 샘플의 미생물 군집은 옥수수와 유사하거나 다른 샘플은 비시비 초원과 유사한 양상을 보입니다.

미생물 군집은 동일한 환경 내에서도 변동성이 매우 큰 경우가 많으므로, 항상 명확하게 구분되지 않을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미생물 세포막의 지질 바이오마커를 토양에서 추출하는 과정에 대해 충분히 이해할 수 있을 것입니다. 인지질 지방산 추출은 고유한 미생물 바이오마커의 식별을 통해 미생물 길드와 전체 미생물 생물량을 평가하는 효율적이고 빠르며 경제적인 방법입니다.