많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

이 비디오의 목표는 토양 미생물 군집 구조 및 많은 샘플을 사용한 연구를 결정하기 위해 총 지질과 지표 지질의 상대적 풍부도를 모두 특성화하는 데 사용하기 위해 미생물의 세포막에서 지질을 추출하기 위한 노력과 정확성의 균형을 맞추면서 처리량을 증가시키는 방법을 설명하는 것입니다. 현장에서는 토양 이질성을 고려하여 현장을 대표하는 방식으로 토양 샘플을 수집해야 합니다. 샘플링 시 미생물 군집을 보존하려면 샘플을 현장에서 얼음으로 운반해야 합니다.

실험실로 돌아 오면 뿌리와 돌을 제거하고 굵은 체로 덩어리를 부수십시오. 이는 또한 샘플을 균질화하는 역할도 합니다. 서브 샘플을 적절한 용기에 넣어 동결 건조를 준비하고 가능한 한 빨리 동결 건조하십시오.

토양이 동결 건조되면 추출할 때까지 건조제와 함께 밀봉된 용기에 보관하십시오. 냉동실에서 건조된 토양을 80도에서 보관 C.As 추출을 준비하고 동결 건조된 토양을 저장소에서 제거하고 분쇄하는 것이 가장 좋습니다. 연삭 방법에는 볼 밀, 볼 미터 또는 모르타르 및 유봉이 포함됩니다.

토양을 분쇄한 후 다시 토양 샘플을 철저히 균질화하고 냉동실에 보관하십시오. 모든 실험기구는 꼼꼼하게 청소해야 합니다. 잔류 세제, 그리스 또는 먼지는 최종 GC 크로마토그램에서 피크로 나타나 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

추출은 30ml 테프론 원심 분리기 튜브에서 수행되며, 용매로 헹궈야 합니다. 2-3 밀리리터의 헥산을 튜브에 넣고 몇 초 동안 소용돌이칩니다. 헥산을 다른 튜브와 소용돌이에 디캔팅합니다.

2-3밀리리터의 헥산을 사용하여 6개의 튜브를 연속적으로 헹굴 수 있습니다. 헥산으로 헹궈진 튜브를 흄 후드에 거꾸로 보관하고 사용한 헥산은 적절한 폐기물 용기에 폐기하십시오. 유리 제품은 사용 직전에 솔벤트로 헹구거나 헹굴 수 있습니다.

머플링은 고온에서 잔류물을 산화시켜 유리 제품이 깨끗한지 확인합니다. 유리 제품을 2-3겹의 알루미늄 호일로 싸서 머플 퍼니스에 넣습니다. 섭씨 450도로 설정하고 용광로가 설정점에 도달하면 최소 4 1/2시간 동안 굽습니다.

퍼니스에서 제거하기 전에 냉각을 위해 최소 1시간을 허용하십시오. 헥산으로 헹궈진 테프론 튜브에 라벨을 붙이고 무게를 잰다. 테프론 원심분리 튜브에 토양을 추가하고 토양 질량을 다시 측정합니다.

추출이 올바르게 작동했는지 확인하려면 항상 배치당 최소 두 개의 블랭크를 만들고 검사 표준(가급적이면 이전에 추출된 토양)을 포함하십시오. 지질 추출. 인산염 완충액, 클로로포름 및 메탄올을 위한 5-10ml 재피펫 3개를 준비합니다.

클로로포름은 표면 장력이 낮은 매우 밀도가 높은 액체입니다. 조제하는 양이 정확하고 일관성이 있는지 주의하십시오. 병에 액체를 절반 이상 채우십시오.

흄 후드에서 테프론 튜브의 토양에 인산염 완충액, 클로로포름 및 메탄올 순서로 시약을 추가합니다. 이것은 샘플 물질에서 지질을 물리적으로 추출하는 첫 번째 방법입니다. 시약 용액에 대한 레시피는 서면 프로토콜에 포함되어 있습니다.

용매 비율과 첨가 순서는 유기상과 수성상의 적절한 분리에 중요합니다. 클로로포름을 추가하기 전에 완충액 첨가 후 토양이 젖을 때까지 기다립니다. 편리하다면 추출액을 결합하고 두 번째 추출 및 후속 추출을 위해 단일 부분 표본으로 추가할 수 있습니다.

테프론 튜브를 단단히 덮고 빛으로부터 보호하십시오. 셰이커에 수평으로 놓고 잘 고정되었는지 확인하십시오. 속도를 높게 설정하고 한 시간 동안 흔듭니다.

튜브가 흔들리는 동안 다음과 같이 각 샘플에 대해 두 개의 긴 유리관을 준비합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 토양에 첨가된 것과 동일한 부피의 클로로포름과 동일한 부피의 인산염 완충액을 추가합니다. 셰이커에서 테프론 튜브를 제거한 후 2°C에서 10분, 2RPM으로 500분 동안 튜브를 원심분리합니다.

그런 다음 조명을 끈 흄 후드에서 테프론 튜브의 상층액을 긴 튜브 중 하나로 디캔팅합니다. 상 분리는 유리관에서 볼 수 있어야 합니다. 하층에는 유기 용매, 주로 클로로포름과 지질이 포함되어 있습니다.

이 추출이 반복됩니다. 앞서 준비한 두 번째 튜브에 상등액을 붓습니다. 이제 토양에서 지질을 물리적으로 두 번 추출했습니다.

대부분의 토양에서는 이것이 적절합니다. 모든 긴 클래스 튜브에 테프론이 늘어선 캡으로 단단히 덮고 10회 뒤집어 혼합합니다. 하룻밤 사이에 중력에 의해 위상을 분리합니다.

두 상의 분리를 완료하기 위해 샘플을 밤새 방해받지 않고 그대로 두십시오. 이렇게하려면 샘플을 어두운 캐비닛에 보관하거나 실온에서 알루미늄 호일로 덮으십시오. 주말 동안 추출물을 분리하도록 허용해도 됩니다.

둘째 날, 지질 분리. 2일차에는 수층을 흡인하고 진공 증발 시스템에서 용매를 제거하여 지질을 농축합니다. 샘플을 물이나 모래 수조에 넣고 질소를 부드럽게 주입하여 건조시킬 수도 있습니다.

이제 튜브의 액체가 잘 분리되고 대체로 투명해야 합니다. 그렇지 않거나 두 층 사이의 계면이 특히 두꺼운 경우 분리를 하루 더 계속하십시오. 후드에 진공 흡입기를 설정합니다.

이것은 잎 Tygon 튜빙과 목초지 피펫이 있는 진공 펌프에 연결된 사이드 암 플라스크입니다. 펌프가 작동 중인 상태에서 피펫을 사용하여 수성상을 플라스크로 끌어냅니다. 최상위 계층과 인터페이스를 흡인합니다.

이것은 약 2/3 정도가 될 것입니다. 2-3 세트의 유리관에 이것을하십시오. 최상층에는 몇 개의 토양 입자가 포함될 수 있습니다.

가능하면 제거하십시오. 두 번째 및 세 번째 튜브 세트의 추출물을 조심스럽게 디캔팅하여 처음 두 세트의 추출물과 결합합니다. 고체 물질을 붓는 것을 배제하고 회전하여 튜브 벽을 헹굽니다.

각 샘플에 대해 깨끗한 피펫을 사용하고 나머지 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 클로로포름 추출물이 결합되고 몇 분 동안 그대로 두면 액체 표면을 검사합니다. 종종 잔류 물의 얇은 층이 형성됩니다.

이 경우 계속하기 전에 흡인하십시오. 잔류 물은 지방산 이중 결합을 공격할 수 있지만 샘플이 건조됨에 따라 매우 적은 양이 용매와 함께 증발해야 합니다. 진공 증발 장치를 사용하여 모든 샘플을 건조시킵니다.

튜브를 단단히 덮고 80 °C의 냉동고에 보관하십시오.Day 3, 비누화 및 메틸화. 먼저 수조를 켭니다. 수위를 확인하고 목욕 1을 95°C로, 목욕 2를 80°C로 설정합니다.재피펫을 사용하여 비누화 시약인 시약 1 1 밀리리터를 건조된 지질에 첨가합니다.

뚜껑을 단단히 닫고 잠시 와류를 일으킨 다음 랙에 놓습니다. 이 단계를 마치면 튜브 랙을 95°C 수조에 넣고 5분 동안 기다립니다. 수조에서 튜브 랙을 제거하고 튜브에 누출이 있는지 확인하십시오.

이것은 거품처럼 튜브에서 거품이 솟아오르는 것으로 표시됩니다. 누출 튜브의 캡을 다시 조이거나 교체하십시오. 수조에서 튜브를 10분 더 계속 가열합니다.

수조의 온도 설정을 80°C로 낮추고 15분 더 배양을 계속합니다. 튜브를 제거하고 랙을 수돗물 팬에 넣어 식힙니다. 얼음물을 사용하지 마십시오.

샘플이 냉각되면 각 샘플에 2ml의 메틸화 시약인 Reagent 2를 추가합니다. 다시 한 번, 뚜껑을 단단히 닫고 5-10초 동안 소용돌이치십시오. 과립형 염은 용액에서 침전제로 보일 수 있으며, 이는 때때로 과도한 시약으로 인해 발생합니다.

랙을 80°C 수조에 넣고 10분 동안 배양합니다. 수조에서 튜브 랙을 제거하고 냉각을 위해 수돗물 팬에 넣습니다. 냉각 프로세스를 가속화하기 위해 랙을 교반합니다.

재피펫을 사용하여 1.25ml의 헥산 및 메틸 3차 부틸 에테르 1개, 시약 3을 각 튜브에 추가하여 상을 추출합니다. 뚜껑을 단단히 밀봉하고 튜브를 셰이커에 10분 동안 넣습니다. 흔든 후 상이 분리될 때까지 튜브 랙을 10분 동안 그대로 두십시오.

이제 최상층인 유기상을 목초지 피펫을 사용하여 짧은 유리관으로 옮깁니다. 대부분의 액체를 회수하는 것이 가장 좋습니다. 매우 적은 양의 수성상은 추출을 손상시키지 않습니다.

Reagent 3을 추가하고, 진탕하고, 상이 분리되도록 하고, 상상(top phase)을 전달하여 수성 상 추출을 반복합니다. 하단 단계의 상태에 따라 이 작업을 한 번 더 반복하여 총 3번의 전송에 대해 수행할 수 있습니다. 수산화나트륨의 묽은 용액인 염기 세척제 3ml, 시약 4를 짧은 튜브의 추출물에 첨가합니다.

시험관을 단단히 덮고 20-30초 동안 소용돌이친 다음 2, 000RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 깨끗한 목초지 피펫을 사용하여 상단 유기상을 흡인하고 4ml 호박색 바이알로 옮깁니다. 수성 상을 흡인하지 않도록 매우 주의하십시오.

다음 단계는 진공 증발 장치에서 용매를 건조되도록 증발시키는 것입니다. 4일차, GC 분석을 위한 추출물 준비. 피펫터를 사용하여 100마이크로리터의 시약 3을 건조상이 들어 있는 4ml 바이알 각각에 추가합니다.

샘플을 볼텍스한 다음 10분 동안 그대로 두십시오. 두 번째 파이펫터를 사용하여 현탁된 FAME을 GC 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 4ml 바이알에 용매의 또 다른 부분 표본을 추가하고 간단히 와류를 일으킵니다.

바이알을 굴려 바이알 벽에 남아 있는 FAME이 용해되었는지 확인합니다. 두 번째 피펫터를 다시 사용하여 용매를 GC 바이알로 옮깁니다. 바이알에 세 번째 용매 분취액을 추가하고 와류를 일으킨 다음 GC 바이알로 옮겨 전달을 완료합니다.

GC 바이알의 뚜껑을 닫고 냉동실에 보관합니다. 분석하기 전에 밀봉된 GC 바이알을 냉동고에 보관하십시오. GC 분석.

이 시스템을 사용하려면 특정 GC 컬럼을 사용하여 분석을 수행해야 합니다. 가스 크로마토그래프에는 비활성화된 유리솜 플러그가 있는 4mm ID 유리 주입구 라이너가 장착된 분할형 비분할 흡입구가 장착되어 있습니다. 입구는 250°C로 설정되며 정압 모드에서 작동됩니다.

운반 가스는 수소입니다. 질소와 공기는 감지기가 가스를 지지하기 때문에 필요합니다. Agilent Ultra 2 컬럼이 사용됩니다.

기둥은 길이가 25m이고 내경이 2mm이고 고상막 두께가 33마이크로미터입니다. 이 컬럼의 고정상은 5%페닐, 95%메틸폴리실록산이며 DB-5 유형 컬럼이라고도 합니다. 지질 추출물을 분석하기 위해 2마이크로리터 분취액을 170 C.Post 도의 오븐 온도와 함께 100:1 분할 비율로 주입하고, 오븐은 최대 300°C까지 분당 5도씩 증가한 다음 12분 동안 유지하도록 프로그래밍합니다.

MIDI 표준을 일련의 주입하고 그 결과를 MIDI 설명서의 지침에 따라 조정하는 데 사용합니다. 이러한 방식으로 보정되면 시스템은 때때로 약간의 조정이 필요할 수 있지만 일반적으로 이러한 매개변수를 사용하여 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. MIDI 시스템은 실현된 피크당 하나의 라인이 있는 테이블을 포함하는 각 샘플에 대한 보고서를 생성합니다.

이 소프트웨어는 피크 식별에 사용되는 파라미터인 ECL 또는 추정된 체인 길이, 머무름 시간과 관련하여 변동 및 검출기 응답을 정규화하는 데 사용되는 파라미터인 응답 계수와 함께 피크 머무름 시간, 피크 면적, 피크 식별을 보고합니다. ECL은 일련의 직선 체인 FAME 중 알 수 없는 각 FAME이 용리되는 위치를 표현합니다. 예를 들어, 미지 물질의 머무름 시간이 12 및 13 탄소 사슬의 머무름 시간 사이의 중간에서 용리되는 경우 ECL은 12.5 탄소 사슬로 보고됩니다.

이 소프트웨어는 각 피크의 ECL을 데이터베이스에 있는 FAME의 ECL과 비교하고, 일치하는 항목이 발생하는 위치에 해당 이름을 알 수 없는 곳에 할당합니다. 데이터베이스에 있는 두 개의 FAME에 매우 가까운 ECL이 있는 경우, 소프트웨어는 가장 가까운 이름을 먼저 나열하여 두 이름을 모두 보고합니다. 보고서의 데이터 테이블을 스프레드시트 또는 데이터베이스로 조합할 수 있습니다.

반응 계수를 조정한 후, 피크 면적을 외부 또는 내부 표준물질의 피크 면적과 비교하여 추출물의 농도에 도달할 수 있습니다. 추출된 토양의 질량을 나누어 데이터를 토양 그램당 FAME 질량으로 표현하거나 각 FAM의 분자량을 사용하여 토양 그램당 나노몰로 표현할 수 있습니다. 그런 다음 Biomarker FAME을 합산하여 미생물 길드의 바이오매스를 산출할 수 있으며 이러한 길드를 추가로 분석할 수 있습니다.

예를 들어, 여기에서 우리는 비료화된 대초원보다 FAME 바이오매스가 더 많은 비료되지 않은 대초원을 볼 수 있습니다. 둘 다 인근 옥수수 밭보다 더 많은 바이오매스를 가지고 있습니다. 또한 FAME은 곰팡이 또는 박테리아와 같은 특정 기능 그룹과 관련이 있습니다.

이러한 연관성은 생태계에 따라 다르므로 과도하게 일반화하지 않는 것이 중요합니다. 이러한 유형의 분석은 특정 그룹이 특정 환경에서 더 풍부한지 여부를 보여줍니다. 이곳에서는 옥수수 밭보다 비옥하지 않은 대초원에서 곰팡이가 더 많이

마지막으로, 전체 미생물 군집 구성을 살펴보는 또 다른 방법은 비계량적 다차원 스케일링(nonmetric multidimensional scaling), NMDS 또는 주성분 분석(principal components analysis, PCA)과 같은 ordination 방법을 사용하여 모든 FAME의 상대적 풍부도를 한 번에 살펴봄으로써 비교하는 것입니다. 서품식에서는 더 유사한 미생물 군집이 서로 더 가까워질 것입니다. 따라서 예시 데이터에서 옥수수와 수정되지 않은 대초원은 매우 멀리 떨어져 있는 반면, 일부 비료가 적용된 대초원 샘플에는 옥수수와 유사한 미생물 군집이 있고 다른 일부는 수정되지 않은 대초원과 유사한 미생물 군집이 있습니다.

미생물 군집은 환경 내에서도 매우 다양하기 때문에 항상 깔끔하게 분리되지는 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미생물의 세포막에서 지질 바이오마커가 토양에서 추출되는 과정을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 인지질 지방산의 추출은 고유한 미생물 바이오마커의 식별을 통해 미생물 길드 및 총 미생물 바이오매스를 평가하는 효과적이고 빠르며 저렴한 방법입니다.