단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

이 방법의 전반적인 목표는 간단한 분획 메틸-트리부틸 에테르 추출을 사용하여 단일 샘플에서 극성 및 반극성 대사 산물, 지질 및 단백질을 포함한 모든 주요 분자 개체를 회수하고 분석하는 것입니다. 일반적으로 과학자들은 단일 샘플에서 여러 화합물 분류를 분석하는 데 어려움을 겪습니다. 여기에서 소개하는 MTBE 추출을 사용하면 단일 샘플에서 지질, 대사 산물 및 단백질과 같은 여러 화합물 클래스를 추출하고 분석할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 소량의 단일 시료 분취량에서 모든 분자 화합물 분류를 강력하게 추출할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다중체학 분석을 위한 실험적 기초를 제공하고 단백질체학, 지질체학 및 대사체학에 의한 분석에 사용할 수 있는 분획을 제공하기 때문에 시스템 생물학의 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 다음 프로토콜은 애기장대 잎 조직을 사용하여 시연됩니다.

애기장대는 Brassicaceae 계통의 작은 꽃 식물이며 양배추와 관련이 있습니다. 조직 균질화 튜브 홀더를 액체 질소로 최소 10분 동안 사전 냉각하여 이 절차를 시작합니다. 액체 질소에서 샘플을 제거하고 튜브 홀더에 넣습니다.

그런 다음 액체 질소에서 튜브 홀더를 제거합니다. 튜브 홀더를 조직 균질화기에 빠르게 넣고 균질화기를 설정하여 생물학적 물질을 미세하고 균질한 분말로 분쇄합니다. 잎의 경우 1분 동안 20헤르츠를 사용합니다.

균질화 시간과 속도는 조직에 따라 달라질 수 있습니다. 결과 샘플이 매우 미세한 분말이 될 때까지 균질화해야 합니다. 그리고 샘플은 균질화의 모든 단계에서 동결 상태로 유지되어야 합니다.

샘플을 균질화한 다음 튜브 홀더에서 생물학적 샘플을 제거합니다. 그리고 바로 사용하지 않을 경우 추가 추출이 가능할 때까지 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣으십시오. 2밀리리터 둥근 바닥 안전 잠금 마이크로 원심분리기 튜브 4개에 시료 번호를 표시합니다.

튜브와 일부 주걱을 액체 질소에 담가 예냉합니다. 튜브와 주걱이 식으면 튜브 중 하나를 분석 저울에 놓고 주걱을 사용하여 25mg의 조직 분말을 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 샘플의 정확한 중량을 기록한 다음 즉시 부분 표본을 액체 질소에 넣습니다.

식물 재료가 해동되지 않도록 이 단계를 빠르게 수행하십시오. 추가 추출이 이루어질 때까지 분주된 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 추출을 준비하기 위해 첨부 문서에 설명된 대로 준비된 메틸 tert-부틸 에테르 또는 MTBE 메탄올 추출 혼합물을 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 예냉각합니다.

분주된 샘플을 꺼내고 각 샘플 튜브에 예냉각된 추출 혼합물 1ml를 추가합니다. 이 단계를 빠르게 수행합니다. MTBE는 점도가 낮고 피펫 팁에서 떨어질 수 있습니다.

조직이 추출 혼합물 내에서 잘 균질화될 때까지 와류 믹서에서 각 샘플을 즉시 혼합합니다. 모든 샘플이 추출될 때까지 튜브를 벤치의 랙에 보관하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.

여기서 우리는 단백질을 침전시키고 효소 활동을 비활성화합니다. 모든 샘플을 100RPM의 오비탈 쉐이커에서 섭씨 4도에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 초음파 처리 수조에서 15분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.

다음으로, 상 분리로 분별하려면 650마이크로리터의 물과 메탄올 3:1 용액을 각 샘플 튜브에 추가합니다. 그런 다음 1분 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 20, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g의 속도로 표본을 원심 분리하십시오.

이 단계가 끝나면 두 액상이 혼합되지 않도록 튜브를 조심스럽게 다루고 침전된 펠릿이 중단되지 않도록 주의하십시오. 이 단계에서는 튜브 바닥에 고체 펠릿이 있는 두 가지 허용 가능한 액상이 있습니다. 비극성 상부상(non-polar upper phase)에는 지질이 포함되어 있습니다.

하부 수성상(lower aqueous phase)은 극성(polar) 및 반극성(semi-polar) 대사 산물을 포함합니다. 펠릿에는 단백질, 전분 및 세포벽이 포함되어 있습니다. 500마이크로리터의 용매를 상부 지질 함유 상에서 표지된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 남아있는 지질상을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 다음으로, 400마이크로리터의 용매를 하상에서 라벨이 붙은 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 200마이크로리터의 추가 분취액을 마이크로 퍼지 튜브로 옮겨 가스 크로마토그래피 기반 대사 산물 분석과 같은 추가 분석을 수행합니다.

초과 부피를 피펫팅하여 수성상의 나머지 부분을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음, 얻어진 단백질-전분-세포벽 펠릿을 세척하기 위해 500마이크로리터의 메탄올을 첨가한 다음 1분 동안 와류로 가열합니다. 10의 속도로 표본을 분리기, 4 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g.

지질의 산화적 변형을 방지하기 위해 질소 흐름 증발기를 사용하여 지질 샘플에서 용매를 증발시킵니다. 생성된 건조된 샘플은 즉시 분석해야 합니다. 가열하지 않고 진공 농축기에서 밤새 수성 샘플의 용매를 증발시킵니다.

건조된 수성 샘플은 분석 전에 섭씨 영하 80도에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 건조된 지질 분획을 400마이크로리터의 7-3 아세토니트릴에서 2-프로판올로 용액에 다시 현탁시킵니다. 유리병에 충분한 액체를 옮기고 뚜껑을 단단히 닫습니다.

그런 다음 유리 바이알을 섭씨 4도의 냉각된 자동 샘플러에 넣습니다. 시료당 2마이크로리터를 주입하고 분당 400마이크로리터의 유속으로 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 섭씨 60도로 유지되는 역상 C8 컬럼에서 지질을 분리합니다. 크로마토그래피 분리를 위해 함께 제공된 문서의 표 1에 설명된 이동상을 사용하십시오.

150 및 1500 전하 대 질량 비율 사이의 질량 범위를 포괄하는 적절한 MS 기기를 사용하여 양이온 및 음이온 모드에서 질량 스펙트럼을 획득합니다. 200 마이크로리터의 1:1 UPLC 등급 메탄올 용액에서 극성 상을 물에 다시 현탁시킵니다. 유리병에 충분한 액체를 옮기고 뚜껑을 단단히 닫습니다.

그런 다음 유리 바이알을 섭씨 4도의 냉각된 자동 샘플러에 넣습니다. 각 샘플에서 2마이크로리터를 주입하고 분당 400마이크로리터의 유속으로 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 섭씨 40도로 유지되는 RP C-18 컬럼에서 대사 산물을 분리합니다. 크로마토그래피 분리를 위해 함께 제공된 문서의 표 2에 나와 있는 파라미터와 함께 이동상을 사용하십시오.

50 및 1500 질량 대 전하 비율 사이의 질량 범위를 커버하는 적절한 질량 분석기를 사용하여 양극 및 음극 이온화 모드에서 전체 스캔 질량 스펙트럼을 획득합니다. 마지막으로, 함께 제공된 문서에 설명된 대로 단백질 추출, 분해 및 분석을 수행합니다. 애기장대 잎 조직 25mg을 수확, 분쇄 및 추출한 후 3개의 분석용 UPLC-MS 플랫폼에 적용했습니다.

극성 및 반극성 1차 및 2차 대사 산물은 역상 C-18 UPLC-MS에 의해 극성 위상에서 분석되었습니다. 상단 패널에 표시된 지질의 기본 피크 크로마토그램과 하단 패널에 표시된 반극성 대사 산물은 양이온 모드에서 분석되었습니다. 각 크로마토그램의 오른쪽 상단 모서리에 있는 파이 차트는 서로 다른 화학 등급에 할당된 식별된 지질 및 대사 산물의 수를 보여줍니다.

예를 들어, 58개의 서로 다른 지질이 트리아실글리세리드 그룹에 할당되었으며, 이는 위 차트에서 TAG로 표시되었습니다. 역상 물질에서 우수한 머무름을 나타내지 않는 당 및 극성 아미노산과 같은 이 분획에서 더 많은 친수성 대사 산물은 GCMS 또는 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피와 같은 다른 분석 방법으로 분석할 수 있습니다. 추출에서 검색된 단백질은 용액에서 분해되고 샷건 LCMS를 사용하여 분석되었습니다.

오른쪽 상단 모서리에 표시된 파이 차트는 서로 다른 생물학적 과정에 할당된 식별된 단백질의 수를 나타냅니다. 예를 들어, 268개의 단백질이 국소화 범주에 할당되었습니다. 요약하면, 200개 이상의 지질 종, 50개의 주석이 달린 반극성 대사 산물 및 수천 개의 단백질을 이 예에 사용된 것과 같은 샘플에서 일상적으로 식별할 수 있습니다.

또한 이 방법은 다양한 조직, 기관 및 세포 배양 물질을 사용하여 광범위하게 적용할 수 있음을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 샘플에서 가장 중요한 화합물을 추출하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 샘플을 냉동 상태로 유지하고, 재료를 적절하게 분쇄하고, 분석 등급의 용매 및 화학 물질을 사용하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 모든 분석 방법을 사용하여 추출된 샘플의 분자 조성을 결정할 수 있습니다.