단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

이 방법의 전반적인 목표는 단순한 분획 메틸-트리부틸 에테르(methyl-tributyl ether) 추출을 통해 단일 시료로부터 극성 및 준극성 대사체, 지질, 단백질을 포함한 모든 주요 분자 개체를 회수하고 분석하는 것입니다. 일반적으로 연구자들은 단일 시료에서 여러 화합물 군을 분석하는 데 어려움을 겪습니다. 본 연구에서 소개하는 MTBE 추출법을 사용하면 단일 시료에서 지질, 대사체, 단백질과 같은 여러 화합물 군을 추출하여 분석할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 적은 양의 단일 시료 분취액에서 모든 분자 화합물 클래스를 견고하게 추출할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 단백질체학, 지질체학 및 대사체학 분석에 사용할 수 있는 분획을 제공함으로써 멀티오믹스 분석의 실험적 기초를 제공하며, 이를 통해 시스템 생물학의 근본적인 질문들에 답하는 데 도움을 줍니다. 다음 프로토콜은 Arabidopsis 잎 조직을 사용하여 시연되었습니다.

Arabidopsis는 Brassicaceae과에 속하는 작은 꽃식물이며 양배추와 친척 관계에 있습니다. 액체 질소에서 조직 균질기 튜브 홀더를 최소 10분 동안 사전 냉각하여 이 절차를 시작하십시오. 액체 질소에서 샘플을 꺼내 튜브 홀더에 넣으십시오.

그런 다음 액체 질소에서 튜브 홀더를 꺼냅니다. 튜브 홀더를 조직 균질기에 빠르게 넣고, 생물학적 시료가 미세하고 균일한 분말이 되도록 균질기를 설정합니다. 잎의 경우, 20 hertz로 1분간 처리합니다.

균질화 시간과 속도는 조직에 따라 달라질 수 있습니다. 결과 샘플이 매우 고운 가루가 될 때까지 균질화하십시오. 또한 균질화의 모든 단계에서 샘플은 냉동 상태로 유지되어야 합니다.

샘플을 균질화한 후, 튜브 홀더에서 생물학적 샘플을 꺼냅니다. 즉시 사용하지 않을 경우, 추가 추출 시까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 4개의 2 mL 라운드 바텀 세이프락(safe-lock) 마이크로원심분리 튜브에 샘플 번호를 표시합니다.

튜브와 스패튤라 몇 개를 액체 질소에 담가 미리 냉각합니다. 튜브와 스패튤라가 냉각되면, 튜브 하나를 분석 저울 위에 올리고 스패튤라를 사용하여 조직 분말 25 milligrams를 마이크로원심분리 튜브에 분주합니다. 각 샘플의 정확한 무게를 기록한 후, 분주된 샘플을 즉시 액체 질소에 넣습니다.

식물 시료가 해동되는 것을 방지하기 위해 이 단계를 신속하게 수행하십시오. 분주한 샘플은 추가 추출 전까지 -80 °C에서 보관하십시오. 추출을 준비하기 위해, 동반 문서에 설명된 대로 준비한 methyl tert-butyl ether 또는 MTBE methanol 추출 혼합물을 -20 °C 냉동고에서 미리 냉각하십시오.

분주된 샘플들을 꺼낸 다음, 각 샘플 튜브에 미리 냉각시킨 추출 혼합물 1 mL를 첨가합니다. 이 단계는 신속하게 수행하십시오. MTBE는 점도가 낮아 피펫 팁에서 흘러내릴 수 있습니다.

조직이 추출 혼합물 내에서 잘 균질화될 때까지 각 샘플을 즉시 볼텍스 믹서로 혼합하십시오. 모든 샘플의 추출이 완료될 때까지 튜브를 벤치의 랙에 보관하십시오. 이 단계는 매우 중요합니다.

여기서는 단백질을 침전시키고 효소 활성을 불활성화합니다. 모든 샘플을 오비탈 셰이커에서 4°C로 100 RPM으로 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 초음파 세척기에서 샘플을 15분 동안 초음파 처리합니다.

다음으로, 상 분리를 통해 분획하기 위해 물과 메탄올을 3:1 비율로 섞은 용액 650 µL를 각 시료 튜브에 첨가합니다. 그다음 보텍싱으로 1분 동안 혼합합니다. 시료를 4 °C에서 20,000 ×g의 속도로 5분 동안 원심분리합니다.

이 단계 이후에는 두 액상 층이 섞이거나 침전된 펠렛이 흐트러지지 않도록 튜브를 주의해서 다루십시오. 이 단계에서는 튜브 바닥에 고체 펠렛이 있고, 그 위에 두 개의 허용 가능한 액상 층이 형성되어 있습니다. 비극성 상층에는 지질이 포함되어 있습니다.

하층 수용액 상에는 극성 및 반극성 대사물이 포함되어 있습니다. 펠릿에는 단백질, 전분 및 세포벽이 포함되어 있습니다. 상층 지질 포함 상에서 용매 500 µL를 취해 라벨이 부착된 1.5 mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 200 µL 피펫을 사용하여 남아 있는 지질층을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 이어서, 하층의 용매 400 µL를 라벨이 부착된 1.5 mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 가스 크로마토그래피 기반의 대사체 분석과 같은 추가 분석을 수행하기 위해 200 µL의 분취액을 미세원심분리 튜브에 추가로 옮깁니다.

피펫으로 과잉 부피를 제거하여 나머지 수성층을 버립니다. 그다음, 얻어진 단백질-전분-세포벽 펠렛을 세척하기 위해 methanol 500 microliters를 첨가하고 1분 동안 볼텍싱합니다. 샘플을 4 °C에서 10,000 ×g의 속도로 5분 동안 원심분리합니다.

지질의 산화적 변형을 방지하기 위해 질소 흐름 증발기를 사용하여 지질 시료에서 용매를 증발시킵니다. 이렇게 얻은 건조 시료는 즉시 분석해야 합니다. 수성 시료의 용매는 가열 없이 진공 농축기에서 밤새 증발시킵니다.

건조된 수성 시료는 분석 전 -80 °C에서 수주 동안 보관할 수 있습니다. 건조된 지질 분획을 acetonitrile과 2-propanol이 7:3으로 혼합된 용액 400 µL에 다시 현탁하십시오. 충분한 양의 액체를 유리 바이알에 옮기고 캡을 단단히 닫으십시오.

그 다음, 유리 바이알을 4 °C로 냉각된 오토샘플러에 넣습니다. 샘플당 2 µL를 주입하고, 400 µL/min의 유속으로 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 60 °C로 유지되는 역상 C8 컬럼에서 지질을 분리합니다. 크로마토그래피 분리를 위해서는 동봉된 문서의 표 1에 기재된 이동상을 사용하십시오.

150에서 1500 사이의 질량 대 전하 비 범위를 지원하는 적절한 MS 장비를 사용하여 양이온 및 음이온 이온화 모드에서 질량 스펙트럼을 획득합니다. 극성상을 UPLC 등급의 메탄올과 물을 1:1로 혼합한 용액 200 µL에 다시 현탁합니다. 충분한 양의 액체를 유리 바이알에 옮기고 캡을 단단히 닫습니다.

그런 다음, 유리 바이알을 4 °C로 냉각된 오토샘플러에 넣습니다. 각 시료에서 2 µL를 주입하고, 40 °C로 유지되는 RP C-18 컬럼과 400 µL/min의 유속으로 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 대사물을 분리합니다. 크로마토그래피 분리를 위한 이동상은 동봉된 문서의 표 2에 제시된 파라미터를 사용하십시오.

적절한 질량 분석기를 사용하여 질량 대 전하비(m/z) 50에서 1500 사이의 질량 범위를 포함하는 양이온 및 음이온 이온화 모드에서 전체 스캔 질량 스펙트럼을 획득하십시오. 마지막으로, 동봉된 문서에 기재된 대로 단백질 추출, 소화 및 분석을 수행하십시오. 25mg의 Arabidopsis 잎 조직을 수확하고 분쇄 및 추출한 후, 세 가지 분석용 UPLC-MS 플랫폼을 통해 분석하였습니다.

극성 및 반극성 1차 및 2차 대사산물은 역상 C-18 UPLC-MS를 이용하여 극성 상에서 분석되었습니다. 상단 패널에 표시된 지질의 베이스 피크 크로마토그램과 하단 패널에 표시된 반극성 대사산물은 양이온화 모드에서 분석되었습니다. 각 크로마토그램의 우측 상단에 있는 파이 차트는 서로 다른 화학적 분류로 할당된 지질 및 대사산물의 동정 수를 나타냅니다.

예를 들어, 58종의 서로 다른 지질이 트리아실글리세라이드 그룹으로 분류되었으며, 이는 상단 차트에 TAG로 표시되어 있습니다. 역상 물질에서 유지 시간이 짧은 당류 및 극성 아미노산과 같이 이 분획 내의 더 친수성인 대사산물들은 GCMS 또는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피와 같은 다른 분석 방법으로 분석할 수 있습니다. 추출을 통해 회수된 단백질은 용액 상태에서 소화시킨 후 샷건 LCMS를 사용하여 분석하였습니다.

우측 상단에 표시된 파이 차트는 서로 다른 생물학적 과정에 할당된 식별 단백질의 수를 나타냅니다. 예를 들어, 268개의 단백질이 localization 범주에 할당되었습니다. 요약하자면, 본 예제에서 사용된 것과 같은 시료로부터 200종 이상의 지질, 50종의 주석 처리된 반극성 대사체, 그리고 수천 개의 단백질을 일상적으로 식별할 수 있습니다.

또한, 이 방법은 서로 다른 조직, 장기 및 세포 배양 물질을 사용하여 폭넓은 적용 가능성을 보여주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 샘플에서 가장 필수적인 화합물들을 추출하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 샘플을 냉동 상태로 유지하고, 물질을 적절하게 분쇄하며, 분석 등급의 용매와 화학 물질을 사용하는 것이 중요합니다.

본 절차를 마친 후, 추출된 시료의 분자 조성을 결정하기 위해 모든 분석 방법을 사용할 수 있습니다.