3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

내레이터 이 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 기반 분석에 사용할 수 있도록 세포 응집을 통해 견고한 세포 구형체(spheroid)를 대량으로 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 응집 및 구형체 형성을 위해 비단백질성 수용성 매트릭스를 사용한다는 점이며, 이를 통해 구형체를 쉽고 빠르게 분리할 수 있습니다. 이 방법은 3차원 미세환경에서 세포-세포 및 세포/매트릭스 상호작용이 조직 성장에 미치는 영향에 대해 세포 생물학의 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

해설자 응집체를 준비하기 전, 초순수 50 milliliters를 80 °C로 가열하고 메틸셀룰로오스 분말 10 grams를 추가합니다. 입자가 균일하게 분산될 때까지 현탁액을 교반하십시오. 그런 다음, 최종 부피가 100 milliliters가 되도록 차가운 초순수를 추가하고, 용액이 가시적인 고형물 없이 투명한 짚색이 될 때까지 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

용액을 0.45 micrometer 필터로 여과하여 녹지 않은 파편을 제거하고, 여과된 용액을 적절한 배양 배지에 1:5 milligrams per milliliter 비율로 희석합니다. 그 후 methylcellulose가 첨가된 배지를 0.22 micrometer 스트레이너로 여과합니다. 다음으로 생물 안전 작업대(bio safety cabinet) 내에서 70% confluence 상태의 계대 배양 세포를 PBS로 세척하고, 세포 배양 인큐베이터에서 3 milliliters의 Trypsin-EDTA 결합 버퍼를 사용하여 세포를 처리합니다.

몇 분 후, 광학 현미경의 10배 배율로 세포를 관찰하십시오. 세포가 플레이트에서 떨어져 나오면, 혈청이 첨가된 배양액 7 mL를 가하여 반응을 중화시킵니다. 세포 용액을 새로운 15 mL 튜브로 옮긴 후, 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집하십시오.

오염 입자를 제외하고 스페로이드 형성에 실패하는 가장 일반적인 원인은 특정 세포주의 응집 및 성장에 최적화되지 않은 메틸셀룰로오스나 혈청 농도를 사용하는 것입니다. 내레이터-필터 팁이 장착된 P1000 마이크로피펫을 사용하여, 스페로이드 형성 배지 1 mL로 펠렛을 3~5회 트라이튜레이션(triturate)합니다. 이때 피펫 팁을 튜브 바닥에 약간 비스듬히 대고, 펠렛을 전단(shear)하기 위해 팁 내부의 내용물을 완전히 배출하지 않으면서 천천히 피펫팅합니다. 세포 수를 센 후, 세포 현탁액을 1×10⁴ cells/mL 농도로 희석하고, 멸균된 멀티채널 피펫 리저버를 여과된 초순수로 헹구어 먼지와 섬유를 제거합니다.

세포를 리저버에 분주하고 필터 팁을 사용하여 96-웰 U-bottom 세포 repellent 플레이트의 각 웰에 세포 100 µL씩 옮깁니다. 이때 세포가 리저버 바닥에 가라앉는 것을 방지하기 위해 세포 현탁액을 주기적으로 섞어줍니다. 모든 세포를 분주한 후, 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 넣고 매일 웰을 관찰하며 스페로이드 형성 여부를 확인합니다. 세포는 6시간 이내에 각 웰의 바닥에 가라앉으며, 일반적으로 24~48시간 이내에 응집하여 스페로이드를 형성합니다.

성공적인 스페로이드 형성을 확인하려면, 광학 현미경 하에서 P10 팁을 사용하여 스페로이드 위로 배지를 조심스럽게 피펫팅하십시오. 적절하게 형성된 스페로이드는 플레이트에서 떨어져 굴러가며, 이를 통해 3차원 구조가 형성되었음을 확인할 수 있습니다. 콜라겐에 스페로이드를 임베딩하려면, 역피펫팅 기법을 사용하여 8-웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰 바닥에 웰당 최소 50 µL의 중화된 콜라겐을 고르게 도포하십시오.

모든 웰을 덮은 후, 챔버 슬라이드를 초순수로 채운 35mm 조직 배양 접시에 넣고, 이를 다시 10cm 조직 배양 접시에 담아 37°C에서 약 1시간 동안 배양합니다. 콜라겐이 중합되면 P1000 필터 팁을 사용하여 미리 형성된 스페로이드를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 스페로이드나 배지를 추가할 때 콜라겐이 흐트러지는 것을 방지하기 위해, 콜라겐 기저층이 완전히 중합될 때까지 배양하는 것이 매우 중요합니다.

나레이터 수확한 스페로이드를 탁상용 미세 원심분리기에 모으고, P200 피펫을 사용하여 상층액을 제거하며, 필요한 경우 깨끗한 종이 타월 위에 튜브를 뒤집어 남은 상층액을 닦아냅니다. 와이드 보어 P200 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 50 µL의 중화된 콜라겐에 즉시 재부유시키고, 스페로이드-콜라겐 혼합물을 8-웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰에 조심스럽게 옮깁니다. 콜라겐이 중합될 때까지 슬라이드를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

약 1시간 후, 추가 배양을 위해 적절한 처리제가 포함된 가온된 배양액을 각 웰에 최소 100 µL씩 천천히 첨가합니다. 그 다음, 형광 현미경을 사용하여 침습된 스페로이드의 광학 이미지 단면을 획득합니다. 이 프로토콜을 통해 다양한 세포주로부터 스페로이드를 생성할 수 있습니다.

적절한 메틸셀룰로오스 및 혈청 처리 조건 하에서, 개별 세포들은 웰 중앙으로 가라앉아 서로 부착되며, 웰 바닥에는 최소한으로만 부착된 상태로 스페로이드를 형성합니다. 일부 세포주는 메틸셀룰로오스가 없거나 농도가 낮을 때 세포 반발 플레이트에 부착될 수 있으며, 이로 인해 세포 단층으로 둘러싸인 스페로이드가 형성됩니다. 일반적으로 메틸셀룰로오스의 농도가 높을수록 세포가 웰에 부착되는 것을 방지합니다.

하지만 메틸셀룰로오스 농도가 너무 높으면 세포 간 접착력이 감소하여 세포가 웰 바닥에 가라앉는 것을 방해하며, 그 결과 느슨한 응집체와 수많은 위성 구형체가 형성됩니다. 콜라겐에 내장된 구형체는 화학 유인 물질로 처리하여 개별 세포가 구형체에서 주변 매트릭스로 외부 방향으로 침습하도록 유도할 수 있습니다. 고정된 콜라겐 내장 구형체는 명시야 현미경으로 촬영하여 침습한 세포의 거리와 수를 정량화하거나, 면역형광 현미경으로 촬영하여 이동하는 세포에 의해 형성된 침습 구조를 시각화할 수 있습니다.

세포가 구조적으로 안정적인 스페로이드로 응집될 수 있도록 충분한 시간을 주는 것이 중요합니다. 그래야 분쇄되지 않고 조작이 가능하며, 후속 분석에 사용하기 위해 쉽게 수집할 수 있는 견고한 상태가 됩니다. 본 세포 성장 프로토콜은 다양한 세포 생물학 분석에 맞춰 추가로 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 고농도의 methylcellulose가 첨가된 배지에 세포를 안착시켜 세포의 침강 저항성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 응집법을 통해 3차원 세포 스페로이드를 생성하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이는 다양한 세포 생물학 응용 분야에서 유용한 도구가 될 것입니다.