March 27th, 2017
여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.
내레이터: 이 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 기반 분석에 사용하기 위해 세포 응집을 통해 대량의 강력한 세포 스페로이드를 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 응집 및 스페로이드 형성을 위해 비단백질성 수용성 매트릭스를 사용하여 스페로이드를 쉽고 빠르게 분리할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 3차원 미세환경에서 조직 성장에 대한 세포-세포 및 세포/기질 상호 작용의 영향에 대한 세포 생물학의 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
내레이터: 응집체를 준비하기 전에 50ml의 초순수를 섭씨 80도까지 가열하고 메틸셀룰로오스 분말 10g을 첨가하십시오. 입자가 고르게 분산될 때까지 현탁액을 교반합니다. 그런 다음 최종 부피 100ml에 차가운 초순수를 첨가하고 용액이 투명해지고 눈에 보이는 고형물 없이 밀짚 색이 될 때까지 입자를 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.
용액을 0.45마이크로미터 필터에 통과시켜 용해되지 않은 단편을 제거하고 여과된 용액을 적절한 배양 배지에 1밀리리터당 1:5mg으로 희석합니다. 그런 다음 메틸셀룰로오스가 보충된 배지를 0.22마이크로미터 스트레이너를 통해 여과합니다. 다음으로, 바이오 안전 캐비닛에서 PBS로 70% confluent 하위배양을 세척하고 세포 배양 incubator에서 3ml의 Trypsin-EDTA association buffer로 세포를 부착합니다.
몇 분 후 광학 현미경으로 10배 배율로 세포를 검사합니다. 세포가 플레이트에서 들어 올려지면 7ml의 혈청 보충 배양 배지로 반응을 중화합니다. 세포 용액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음 원심분리로 유리된 세포를 수집합니다.
입자를 오염시키는 것 외에도 성공적인 스페로이드 형성의 가장 일반적인 원인은 특정 세포주의 응집 및 성장을 위해 최적이 아닌 농도의 메틸셀룰로오스 또는 혈청을 사용하는 것입니다. 내레이터-필터 팁이 있는 P1000 마이크로피펫을 사용하여 1ml의 스페로이드 형성 매체로 팔레트를 3-5회 분쇄하고, 파이펫 팁을 튜브 바닥에 약간 각도로 누르면서 팁 내용물 전체를 펠릿으로 배출하지 않고 천천히 피펫팅합니다. 계수 후, 세포 현탁액을 10의 1배로 희석하여 밀리리터당 4번째 세포 농도로 낮추고, 여과된 초순수로 멸균 멀티채널 피펫 저장소를 헹구어 먼지와 섬유를 제거합니다.
세포를 저장소로 분배하고 필터 팁을 사용하여 100마이크로리터의 세포를 96 웰 U-바닥 세포 발수판의 각 웰로 옮기고, 세포가 저장소 바닥에 침전되는 것을 방지하기 위해 주기적으로 세포 현탁액을 혼합합니다. 모든 세포가 장착되면 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 놓고 매일 웰에서 스페로이드 형성을 검사합니다. 세포는 6시간 이내에 각 웰의 바닥에 가라앉아야 하며, 일반적으로 24-48시간 이내에 스페로이드로 응집되어야 합니다.
성공적인 스페로이드의 형성을 확인하려면 광학 현미경으로 P10 팁을 사용하여 스페로이드 위에 배지를 부드럽게 피펫팅합니다. 적절하게 형성된 스페로이드는 플레이트와 롤에서 느슨해져서 3D 구조를 확인합니다. 콜라겐에 스페로이드를 삽입하려면 역 피펫팅을 사용하여 8웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰 바닥을 웰당 최소 50마이크로리터의 중화 콜라겐으로 균일하게 코팅합니다.
모든 웰이 덮이면 초순수를 채운 35mm 조직 배양 접시에 챔버 슬라이드를 넣고 10cm 조직 배양 접시를 섭씨 37도에서 약 1시간 동안 배양합니다. 콜라겐이 중합되면 P1000 필터 팁을 사용하여 미리 형성된 스페로이드를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 콜라겐 기저층은 스페로이드 또는 배지를 추가할 때 콜라겐을 방해하지 않도록 완전히 중합될 때까지 배양하는 것이 중요합니다.
내레이터: 수확된 스페로이드를 탁상용 마이크로 원심분리기에 모으고, P200 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고, 필요에 따라 깨끗한 종이 타월에 튜브 반전을 통해 과도한 상층액을 제거합니다. 넓은 구멍의 P200 피펫 팁을 사용하여 즉시 50마이크로리터의 중화 콜라겐에 스페로이드를 다시 현탁시키고 스페로이드 콜라겐 혼합물을 8웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰로 조심스럽게 옮깁니다. 콜라겐이 중합될 때까지 슬라이드를 인큐베이터로 되돌립니다.
약 1시간 후, 다른 배양을 위해 적절한 관심 처리를 포함하는 최소 100마이크로리터의 가온 배양 배지를 각 웰에 천천히 추가합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 침입하는 스페로이드를 통해 광학 이미징 단면을 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하면 다양한 세포주에서 스페로이드를 생성할 수 있습니다.
적절한 메틸셀룰로오스 및 혈청 처리 조건 하에서, 개별 세포는 웰 중앙에 침전하고 함께 부착되어 웰 바닥에 대한 접착력을 최소화하면서 스페로이드를 형성합니다. 일부 세포주는 메틸셀룰로오스가 없거나 낮은 농도에서 세포 발수판에 부착할 수 있으며, 그 결과 세포 단층으로 둘러싸인 스페로이드가 형성됩니다. 일반적으로 메틸셀룰로오스의 농도가 높으면 세포가 웰에 부착되는 것을 방지할 수 있습니다.
그러나 메틸셀룰로오스의 농도가 너무 높으면 세포 간 접착력이 저하되고 세포가 웰 바닥에 가라앉는 것을 방해하여 느슨한 응집체와 수많은 위성 스페로이드가 형성됩니다. 콜라겐 포매 스페로이드는 화학유인제로 처리하여 스페로이드에서 주변 기질로 바깥쪽으로 개별 세포의 침입을 유도할 수 있습니다. 고정 콜라겐 내장 스페로이드는 명시야 현미경으로 이미지화하여 침입 세포의 거리와 수를 정량화하거나 면역형광 현미경 검사로 이동하여 이동하는 세포에 의해 형성된 침습 구조를 시각화할 수 있습니다.
세포가 단편화되지 않고 조작할 수 있을 만큼 충분히 견고하고 후속 분석에서 사용하기 위해 쉽게 수집할 수 있는 구조적으로 건전한 스페로이드로 응집될 수 있도록 충분한 시간을 허용하는 것이 중요합니다. 당사의 세포 성장 프로토콜은 여러 세포 생물학 분석에 추가로 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 고농도의 메틸셀룰로오스가 보충된 배지에 세포를 안착시키는 것은 셀라노이쿠스 저항성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 응집을 통해 3차원 세포 스페로이드를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 많은 세포 생물학 응용 분야에 유용한 도구가 될 것입니다.
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본 논문은 세포 응집을 통해 3차원 세포 구상을 생성하는 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있으며, 세포 이동, 침투 및 세포-기질 상호 작용 관련 분석에 적용 가능합니다.
Robust 3D spheroid models are essential for bridging the gap between traditional 2D cell culture and the complex in vivo tumor microenvironment, enabling more predictive preclinical evaluation. This flexible aggregation protocol supports high-throughput, reproducible generation of spheroids from diverse cell lines, directly impacting early discovery, target validation, and translational research. Its adaptability and scalability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking and quantitative phenotypic screening in oncology and tissue biology pipelines.
This aggregation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic and phenotypic workflows.