Name: 3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 학습하세요 메틸셀룰로스 기반 3D 세포 타원체 생성 방법으로 세포 이동, 침윤 및 세포-매트릭스 상호작용 연구에 활용하세요. 이 기법은 비단백질성 매트릭스를 사용하여 타원체를 신속하게 분리할 수 있어 다양한 세포 생물학 실험에 적합합니다.

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저자는 Queen's University Biomedical Imaging Centre의 M. Gordon에게 도움을 준 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 암 연구 협회(19439) 및 캐나다 보건 연구소(MOP-142303)(LMM)의 운영 보조금, 온타리오 대학원 장학금 및 Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research(SMM, EYL)의 장학금 및 학생, Craig Jury Summer Studentship(SMM)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
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<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
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</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

우리는 저렴하고 광범위하게 이용할 시약을 이용하여 생체 조직의 구조를 모델링하는 3 차원 셀 구 상체를 제조하기위한 신속하고 융통성있는 방법을 제시한다. 우리 프로토콜 MC (8, 9)의 비 독성 및 접착 촉진 성질 세포 응집을 매개 세포 단층의 형성을 최소화하기를 이용한다. 동물 소스로부터 단리 된 단백질 - 기초 매트릭스는 달리, MC는 불활성에는 성장 인자를 포함하지 않고, 쉽게 잔류 매트릭스의 존재없이 다양한 애플리케이션에 사용하기위한 회전 타원체의 절연 수 세척에 의해 제거된다. 우리의 프로토콜은 다양한 실험 조건 하에서 성장 타원체의 직접적인 비교를 허용 균일 크기의 타원체를 생성 일치 셀 수의 신속한 응집을 이용한다. 이 방법은 (다중 종양 - 관련 세포 유형의 고정 된 숫자를 조합하여 생체 내 종양 성장의 모델로 혼합 배양에 적합 할 수있다예를 들어, 섬유 아세...

종양 세포의 생물학적 행위 관련 사정이 적절히 생체 내에서 발견되는 세포 미세 환경을 반영하지 않기 때문에, 부분적으로는 기존의 2 차원 세포 배양 방법을 사용하여 도전하고있다. 배양 (예, 보이든 챔버 분석법)에 세포 외 기질 성분을 통합하는 대안 적 방법은 생체 조직 환경 이상의 생리 대표. 그러나, 개별 셀 동작의 평가에 한정 될 수 있으며, 조직 또는 종양 성장을 1, 2, 3에 기여하는 세포 기질 및 세포 - 세포 상호 작용의 생체 조합 복소 요점을 되풀이하지 않는다. 다세포 타원체의 사용은,보다 정확하게 생체 내 세포 성장 (1)의 콤팩트 한 구조를 재생하는 방법이다 최근4. 구 상체는 정상 세포의 세포 - 기질 상호 작용을 조사하기 위하여 사용될 수 있으며,뿐만 아니라, 전이성 성장 또는 약물 내성 4와 같은 종양 진행의 특성을 모델링하기 위해, 종양 유사체로서 작용할 수있다. 타원체가 매트릭스 5 또는 더 빠르게 내장 단일 세포의 증식에 의해 형성 될 수 있고, 다수의 세포의 응집을 촉진함으로써 단일 셀 클러스터 (예를 들어, 걸려 강하를 원심 분리 방법) (6, 7)을 형성한다. 기존의 세포 응집 기술은 비용이 많이 드는 재료 또는 특수 장비가 필요할 수 있습니다. 또한, 이러한 회전 타원체는 크기 및 모폴로지의 넓은 범위가 성장 조건이나 곤란 치료 간의 비교를, 대량 생산하기가 어려울 수있다. 마지막으로, 이러한 방법에 의해 생성 된 타원체는 단백질 extracel에서 분리하기가 어려울 수 있습니다적인 다공질 행렬을하는 그들은 다른 응용 프로그램에서 사용하기 위해 포함됩니다. 여기에서는 시판 U 바닥 셀 반발 판 불활성 접착 촉진 행렬 메틸 셀룰로오스를 이용하여 지속적으로 크기가 셀 타원체의 신속한 형성을위한 견고하고 용이하게 수정 세포 응집 방법을 설명한다. 형성 후에,이 다세포 타원체 용이하게 다양한 애플리케이션에서 사용하기 위해 분리된다. 프로토콜은 쉽게 다른 세포 프로세스를 평가하기 위해 사용될 수있다 세포 증식을 통해 구 상체를 생성하도록 구성된다. 여기, 우리는이 두 개의 서로 다른 회전 타원체 형성 프로토콜의 예 응용 프로그램과 같은 면역 형광 염색법에 의해 정량화 셀 침공 분석, 및 anoikis 분석은 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered Saline</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>PBS+ 세척 버퍼에 사용됩니다. 염화칼슘 추가 시 PBS+ 세척 버퍼를 고압멸균하지 마십시오</td></tr>. 염화<tr><td>마그네슘 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>PBS+ 세척 완충액에 사용됩니다. 염화마그네슘</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Spheroid Formation</td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate Greiner Bio-One을 첨가하여 PBS<s>up>+<<td></td><td></td><td></td>strong</tr><tr><td>를</td><td></td> 고압멸멸균하지 마십시오.<td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 세포주 배양용</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>TT 세포주 배양용</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>미립자 오염 물질 제거를 위한 사용 전 필터</td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>100 mg/mL까지 수중에서 준비</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>HCT-116, BxPC-3 세포주 배양용</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>해리 완충액</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3.1 mg/mL; 사용 중에는 얼음 위에 유지하십시오</td></tr><tr><td>DMEM 페놀 레드 프리 로우 글루코스&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>페놀 레드 보충 배지</td></tr><tr><td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>면역형광 현미경용</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>절제 스페로이드 장착용</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>1:200에서 액틴을 염색하는 데 사용</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>BSA 차단 완충액에 사용</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>시그마-알드리치</td><td>290734</td><td>안티페이</td></tr>드 <tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>MOWIOL 장착 매체</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>프리웨어에 사용, NIH</td><td>-</td><td>이미지 분석에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>소비된 스페로이드 장착용</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>MOWIOL 장착 매체</td></tr><tr><td>파라포름알데히드에 사용됩니다&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>고정 완충액에 사용</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>투과화 완충액에 사용</td></tr></tbody></table>

3d 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

단층 세포 배양 충분히 복잡한 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함한다 조직의 생체 내 행동을 모델링하지 않습니다. 3 차원 (3D) 세포 배양 기술을 접착 세포 배양의 단점을 해결하기 위해 개발 된 최근의 기술 혁신이다. 시험관 내에서 조직 유사체를 생성하기위한 몇 가지 기술이 개발되었지만,이 방법은 비용이 확립 자주 복잡 특수 장비를 필요로하고, 일반적으로 특정 유형의 세포와의 호환성에 의해 제한된다. 여기서는 종양 정상적인 다양한 세포주의 성장과 호환 일관된 크기 다세포 차원 타원체로 세포 응집을위한 신속하고 유연한 프로토콜을 설명한다. 우리 앵커리지 독립적 타원체 생성을 촉진하고, 높은 재현성으로 세포 단층의 형성을 방지하기 위해 혈청 및 메틸 셀룰로오스 (MC)의 다양한 농도를 사용한다. 개인 라지을위한 최적의 조건idual 세포주 회전 타원체 형성 매체 MC 또는 혈청 농도를 조정함으로써 달성 될 수있다. 생성 된 3D 타원체 셀 시그널링 또는 유전자 발현 연구 후보 약물 스크리닝, 또는 종양 세포의 침윤 및 이동과 같은 세포 과정의 연구 등의 다양한 애플리케이션에 사용하기 위해 수집 될 수있다. 프로토콜은 또한 용이하게 단일 세포 클론 타원체를 생성하도록 구성되고, 앵커리지 - 독립된 성장 anoikis 저항을 평가하도록 구성 될 수있다. 전체적으로, 우리는 프로토콜을 생성하고, 정상 및 종양 세포의 생체 내 성장을 조직의 3 차원 미세 요점을 되풀이하고 모델링하기 위해 3 차원 셀 타원체를 이용하는 쉽게 수정 방법을 제공한다.

우리는 세포 반발 판과 MC로 보충 회전 타원체 형성 미디어를 사용하여 개별 회전 타원체를 생성하는 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. MC 혈청의 적절한 조건 하에서, 각각의 세포가 정착 웰 바닥에 최소한으로 부착 구 상체를 형성하는 웰의 중심에 함께 부착. 이 프로토콜을 이용하여, 구 상체는 다양한 세포주 (도 2b)에서 발생 하였다. MC 혈청 농도 적정은 단일 타원체가 단편화없이 조작 할 수 있도록 충분히 튼튼하다 형성되는 최적의 조건을 식별하는 각각의 세포주에 대해 요구된다. 최적의 구 상체는 직경이 200 내지 500 ㎛의 사이이었으며, 최소 세포 파편 단단히 부착 세포로 구성되었다. 타원체들을 수집 및 분석을 광범위하게 사용될 수 있도록, 손상없이 부드러운 핸들링 살아 남았다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 타원체 형성은...

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

내레이터 이 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 기반 분석에 사용할 수 있도록 세포 응집을 통해 견고한 세포 구형체(spheroid)를 대량으로 효율적으로 생성하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 응집 및 구형체 형성을 위해 비단백질성 수용성 매트릭스를 사용한다는 점이며, 이를 통해 구형체를 쉽고 빠르게 분리할 수 있습니다. 이 방법은 3차원 미세환경에서 세포-세포 및 세포/매트릭스 상호작용이 조직 성장에 미치는 영향에 대해 세포 생물학의 새로운 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.해설자 응집체를 준비하기 전, 초순수 50 milliliters를 80 °C로 가열하고 메틸셀룰로오스 분말 10 grams를 추가합니다. 입자가 균일하게 분산될 때까지 현탁액을 교반하십시오. 그런 다음, 최종 부피가 100 milliliters가 되도록 차가운 초순수를 추가하고, 용액이 가시적인 고형물 없이 투명한 짚색이 될 때까지 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.용액을 0.45 micrometer 필터로 여과하여 녹지 않은 파편을 제거하고, 여과된 용액을 적절한 배양 배지에 1:5 milligrams per milliliter 비율로 희석합니다. 그 후 methylcellulose가 첨가된 배지를 0.22 micrometer 스트레이너로 여과합니다. 다음으로 생물 안전 작업대(bio safety cabinet) 내에서 70% confluence 상태의 계대 배양 세포를 PBS로 세척하고, 세포 배양 인큐베이터에서 3 milliliters의 Trypsin-EDTA 결합 버퍼를 사용하여 세포를 처리합니다.몇 분 후, 광학 현미경의 10배 배율로 세포를 관찰하십시오. 세포가 플레이트에서 떨어져 나오면, 혈청이 첨가된 배양액 7 mL를 가하여 반응을 중화시킵니다. 세포 용액을 새로운 15 mL 튜브로 옮긴 후, 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집하십시오.오염 입자를 제외하고 스페로이드 형성에 실패하는 가장 일반적인 원인은 특정 세포주의 응집 및 성장에 최적화되지 않은 메틸셀룰로오스나 혈청 농도를 사용하는 것입니다. 내레이터-필터 팁이 장착된 P1000 마이크로피펫을 사용하여, 스페로이드 형성 배지 1 mL로 펠렛을 3~5회 트라이튜레이션(triturate)합니다. 이때 피펫 팁을 튜브 바닥에 약간 비스듬히 대고, 펠렛을 전단(shear)하기 위해 팁 내부의 내용물을 완전히 배출하지 않으면서 천천히 피펫팅합니다. 세포 수를

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

여기에서는 세포 현탁액을 시드하기 위해 자동화 된 피펫팅 시스템을 사용하여 지방 유래 기질 / 줄기 세포 (ASC) 구상체의 대규모 생산을 설명하므로 스페로이드 크기와 모양의 균질성을 보장합니다. 이 ASC 구상체는 3D 바이오 프린팅 접근법의 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

세포 스페로이드는 생물학적 응용 분야에서 하나의 잠재적 모델로 간주되어 왔습니다. 이 기사에서는 균일한 세포 스페로이드를 견고하고 신속하게 제조할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 세포 스페로이드를 확장 가능하게 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

세포 스페로이드의 대량 생산을 위한 3차원 음향 조립 장치

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

학습하세요 메틸셀룰로스 기반 3D 세포 타원체 생성 방법으로 세포 이동, 침윤 및 세포-매트릭스 상호작용 연구에 활용하세요. 이 기법은 비단백질성 매트릭스를 사용하여 타원체를 신속하게 분리할 수 있어 다양한 세포 생물학 실험에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

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