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원하는 세포주를 부착 2D 단층으로 성장시킵니다. 배양 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세척합니다. 그런 다음 트립신을 추가하고 세포가 플라스크 표면에서 분리되어 둥근 모양이 되는 동안 배양합니다. 트립신을 중화하고 세포를 현탁시키기 위해 새로운 배지를 추가합니다. 혼합물을 원뿔형 튜브로 옮기고 원심 분리기를 사용하여 세포를 펠릿화합니다.
상층액을 새 배지로 교체하고 세포의 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 작업 농도를 계산합니다. 그런 다음 적당량의 세포 혼합물을 둥근 바닥의 초저 접착 웰 플레이트로 옮기고 배양합니다. 세포는 바닥에 가라앉고 응집됩니다. 이들은 궁극적으로 서로 부착되어 소형 3D 세포 어셈블리인 스페로이드를 형성합니다.
예제 프로토콜에서는 대장암 세포주에서 3D 스페로이드를 생성하는 방법과 라이브 이미징을 적용하여 형성을 추적하는 방법을 알아봅니다. 먼저 PBS 5ml로 관심 대장암 세포주를 세척하고 섭씨 37도에서 5분 동안 0.5ml의 트립신으로 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다. 현미경으로 박리를 확인한 후 10ml의 완전 배지로 세포 해리 효소를 중화하고 원심분리로 세포를 채취합니다. 계수를 위해 펠릿을 5 밀리리터의 새로운 완전 배지에 다시 현탁시키고, 1.5 곱하기 10에서 밀리리터 농도당 세 번째 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 20마이크로리터의 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 파딩하고 플레이트를 5% CO2 및 95% 습도의 섭씨 37도 인큐베이터 내부의 자동 이미징 장치에 넣습니다. 장치의 획득 소프트웨어에 로그인하고 Schedule to Acquire(획득 일정), Launch Add Vessel(선박 시작), Scan on Schedule(일정에 따라 스캔) 및 Create Vessel(선박 생성, New)을 선택합니다. 그런 다음 Scan Type, Spheroid를 선택하고 관심 있는 적절한 Brightfield 및 Fluorescence 채널을 선택합니다. 배율을 10배로 설정하고 플레이트 모델과 이미징 장치 서랍 내의 위치를 선택합니다. 이미징할 웰의 위치를 선택하고 이름, 세포 유형 및 세포 수를 포함한 실험 설명을 입력합니다.
분석 설정의 경우 나중까지 분석 연기를 선택하고, 타임라인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 선택한 스캔 그룹 간격 설정을 선택하고, 스캔 추가를 4시간으로, 총 24시간으로 설정합니다. 그런 다음 시작 시간을 자동 이미징 장치에서 배양 후 최소 1시간으로 설정합니다. 스페로이드 성장 진행 상황을 확인하려면 이틀에 한 번씩 이미징 소프트웨어에 로그인하고 최근 스캔 보기를 선택합니다. 관심 있는 실험을 두 번 클릭하고 이미지 채널 패널에서 명시야를 선택합니다. 그런 다음 Measure Image Features 도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정합니다. 발현 효과의 모든 매체를 제한하기 위해 4일째에 우물당 50마이크로리터의 완전한 배지를 추가합니다.
