Name: 성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 성인 쥐 심장에서 심근세포, 내피세포 및 섬유아세포를 동시에 격리하는 최적화된 프로토콜을 Langendorff 관류 시스템을 사용하여. 이 방법은 심혈관 연구 비용을 절감하고 실험 동물 수를 줄이는 데 도움이 됩니다.

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L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas 및 A. Weber의 기술 지원은 감사하게 생각합니다. 저자는 광범위한 증거 교정과 원고의 언어 편집을 위해 Dr. E. Martinson에게 감사드립니다. 이 연구는 Giessen Anschubsfinanzierung 대학의 M. Aslam과 D. Gündüz 연구원의 지원을 받았다.

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<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+ATP+and+adenosine+on+barrier+function+of+rat+coronary+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature.</a> J Mol.Cell Cardiol. , (2012).</li>
</ol>

저자는 선언 할 것이 없습니다.

이 기사에서는 심장 근세포, 내피 세포 및 섬유 아세포의 분리 및 배양에 대한 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 단지 하나의 세포 유형에 반대 cardiomyocytes, 내피 세포, 그리고 섬유 아 세포와 같은 심장 조직의 주요 세포 유형의 동시 고품질 분리를 설명합니다. 격리 절차의 중요한 단계는 심장 조직의 적절한 소화입니다. 소화가 불완전하다면 많은 양의 근육 세포가 여전히 얻어 질 수 있지만 품질은 매우 좋지 않으며 대다수는과 농축되어 둥글며 ( 그림 2B ) 실험에서는 아무런 가치가 없습니다. 또한, 내피 세포 및 섬유 아세포의 수율 또한 감소 될 것이다. 이 문제는 소화 시간을 조절하여 해결할 수 있습니다. 관류 시스템에서 심장을 제거하기 전에, 포셉과 손가락의 도움으로 심장의 부드러움을 확인할 수 있습니다. 조직이 아직 눈에 띄지 않으면심장은 추가 5-10 분 동안 관류 될 수 있습니다. 건강한 cardiomyocyte 격리의 두 번째 중요한 단...

설치류 모델은 오랫동안 건강과 질병에서 심혈 관계 생리학에 대한 우리의 이해를 넓히는 도구로 사용되어 왔습니다. 1 이 동물 모델은 기관 수준에서 질병의 병리 생리학을 이해하고 심혈관 질환 치료에 사용되는 다양한 약리학 적 약물의 약물 동력학 및 약력학을 분석하고 심혈관 질환 발병의 분자 메커니즘 및 특정 세포 유형은 시험 관내 세포 배양 모델의 사용을 필요로한다. 이 목적을 위해 심혈관 시스템으로부터의 상이한 불멸화 된 세포주가 개발되었다. 2 , 3 그러나 새로 분리 된 1 차 세포는 생리 학적으로 기능적으로 살아있는 조직과 유기체와 관련이 있습니다. 심장은 심장 혈관의 모든 주요 유형의 세포를 포함하는 다용도 장기입니다.ystem, 쥐 심장은 여전히 ​​심혈관 생리학의 이해를 위해 일반적으로 사용되는 모델입니다. 지난 수십 년 동안 심장 조직으로부터 개별 세포 유형을 분리하기위한 여러 가지 방법이 설명되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7 그러나 이러한 방법은 특정 세포 유형의 분리에만 초점을 맞추어 더 이상 세포 유형을 잃어 버려 세포 분석에 더 이상 사용할 수 없습니다. 여기에는 심장 조직, 즉 심근 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포의 주요 세포 유형을 동시에 고품질로 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이러한 모든 세포 유형은 다른 실험 설정 8 , 9 , 10 및 동일한 동물의 세포 - 세포 상호 작용 분석에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>안티 vWF</td><td>산타 크루즈 생명 공학.</td><td>SC-14014</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>머크</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>카르니틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II형</td><td>워딩턴</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>머크</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>딜-AC-LDL</td><td>써모 사이언티픽</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 용액 (0.2 M)</td><td>Biochrome AG</td><td>L2113</td><td></td></tr><tr><td>Embeding solution</td><td>Citiflour</td><td>AF1-25</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell medium MV2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Foetal calf serum (FCS)</td><td>Biochrome AG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Serva Chemicals</td><td>47991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>TU 061219</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Roche/Sigma</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium (Powder)</td><td>Biochrome AG</td><td>T061</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD31 항체 (TLD-3A12)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-81051</td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution (0.9%), Sterile</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td>30820080</tr><tr><td>팬 마우스 IgG 비드 (Dynabeads)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA) 4% 용액</td><td>Santa Cruz Biotech.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) 1x&nbsp;</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 소모품</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Merck</td><td>4933</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소 칼</td>륨 <td>Merck</td><td>7873</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액(2 N)</td><td>Merck</td><td>109136</td><td></td></tr><tr><td>멸균 여과 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>5660020</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Water, Sterile</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

성인 쥐 심장에서 고품질 cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

쥐는 심장 혈관 연구에 사용되는 중요한 동물 모델이며, 랫트 심장 세포는 심근 비대, 섬유증 및 죽상 동맥 경화증과 같은 심혈관 질환 진행의 분자 메커니즘에 대한 생체 외 분석을 위해 일상적으로 사용됩니다. 이러한 세포 메커니즘을 이해하기 위해 심혈관 시스템에서 불후의 세포주를 개발하기 위해 다양한 성공을 거둔 여러 시도가 있었지만, 일차 세포는 이러한 연구를 위해보다 자연스럽고 가까운 생체 내 환경을 제공합니다. 따라서 특정 세포 유형에 종사하는 여러 실험실에서는 관심있는 쥐 심장 세포의 개별 유형을 분리하는 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 하나 이상의 셀 유형을 격리 할 수있는 프로토콜이 없습니다. 여기에는 하나의 준비에서 고품질의 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial 세포 및 fibroblasts)의 격리를 허용하고 최적화 된 프로토콜을 설명합니다세포 분석에 사용. 이를 통해 사용 가능한 리소스를 가장 효율적으로 사용할 수 있으므로 시간을 절약하고 연구 비용을 줄일 수 있습니다.

<html> 분리 절차는 계획된 실험에 사용될 수있는 70-80 % 생존 가능하고 막대 모양의 줄무늬 심근 세포 ( 그림 2A 및 2C )의 수율을 초래합니다. 우리의 실험실에서 cardiomyocytes는 일상적으로 칼슘 2 + 신호 분석에 사용됩니다. 그림 5A 는 Fura - AM (5 μm의)와로드 된 cardiomyocytes의 허혈 / reperfusion에 대한 응답으로 세포 내 칼슘 [칼슘 2 + ] 진동을 보여줍니다. 그림 5B 는 ATP (100 μm의)의 추가 후 내피 세포와 섬유 아 세포의 [칼슘 2 + ] i의 변화를 보여줍니다. 다른 심장 세포 유형에서 [Ca 2+ ] i 의 변...

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

본 절차의 전반적인 목적은 개별적인 인비트로(in vitro) 분석을 위해 쥐 심장에서 생존 가능한 심근세포, 내피세포 및 섬유아세포를 동시에 분리하는 것입니다. 이 방법은 심비대, 허혈 재관류 손상, 내피 기능 및 심장 섬유화에 관여하는 신호 전달 메커니즘에 관한 심혈관계 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 주요 심장 세포를 동시에 분리할 수 있어, 관련 연구 비용과 실험 동물 수를 잠재적으로 줄일 수 있다는 점입니다.증류수와 50 mL의 Powell 배지로 각각 한 번씩 세척한 후, 배지를 80 mL의 신선한 Powell 배지로 교체하고, 유리 실린더의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배지에 carbogen을 지속적으로 통과시킵니다. 다음으로, 두 쌍의 얇은 곡선 핀셋을 사용하여 갓 적출한 쥐의 심장을 대동맥을 통해 Langendorff 관류 시스템에 장착하고, 관류 시스템 캐뉼라의 끝을 첫 번째 대동맥 분지부와 대동맥판막 사이에 위치시킵니다. 악어 클램프로 대동맥을 고정합니다.캐뉼라의 밸브를 열고 외과용 봉합사로 심장을 고정합니다. 관류액 35 milliliters를 심장에 한 방울씩 통과시켜 잔류 혈액을 모두 제거합니다. 심장 아래에 수집 깔때기를 배치하고, 연동 펌프를 작동시켜 수집 깔때기에서 저장조로 관류액이 재순환되도록 합니다.관류액에 콜라게나제 용액을 첨가하고, 재순환되는 콜라게나제 용액으로 30분 동안 심장을 관류합니다. 소화 과정이 끝나면 가위를 사용하여 Langendorff 시스템에서 심장을 분리해 유리 페트리 접시에 옮깁니다. 이제 양측 심방과 심장에 남아 있는 모든 지방 조직을 제거합니다.상피 세포 오염을 방지하기 위해, 두 개의 핀셋을 사용하여 심낭을 조심스럽게 벗겨냅니다. 심장을 중앙에서 절단하고, 절단된 절반의 조각들을 조직 절단기(tissue chopper)에 넣습니다. 심장을 2~3회 잘게 다진 후, 조직 조각들을 Langendorff 관류 시 사용한 소화 완충액 12 mL가 들어 있는 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다.조직 조각들을 항온 수조에서 5분에서 10분 동안 소화시키며, 이때 5 mL 일회용 플라스틱 피펫으로 가끔씩 혼합해 줍니다. 그 다음 세포 현탁액을 10 µm 체로 걸러 50 mL 원추형 튜브에 담습니다. 관류 시스템을 최소 1 L의 증류수로 세척한 후 0.1 N 수산화나트륨 10 mL로 30분 동안 세척하고, 다시 2~3 L의 증류수로 시스템을 세척한 다음 플러싱 공기로 장치를 건조합니다.원심분리를 통해 여과된 세포를 수집하고, 일회용 피펫을 사용하여 혈관내피세포와 섬유아세포가 포함된 상층액을 새로운 50 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 펠릿을 6 milliliter의 calcium solution one에 재현탁합니다. 1분 후, 두 번째 원심분리를 통해 세포를 수집하고 펠릿을 6 milliliter의 calcium solution two에 재현탁합니다.1분 후, 칼슘 용액 3(calcium solution three) 12 milliliters를 첨가하여 세포 현탁액을 희석하고, 부드럽게 기울여 잘 섞습니다. 다시 한번 원심분리를 수행한 후, 펠렛을 미리 데워둔 CCT 배지 20 milliliters에 재현탁합니다. 그런 다음, 라미닌이 미리 코팅된 멸균된 35 millimeter 세포 배양 접시 20개에 세포를 각각 1 milliliter씩 분주하고, 이산화탄소가 없는 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후, 죽은 세포를 제거하기 위해 배지를 신선한 CCT 배지 2 milliliters로 교체합니다.이제 혈관내피세포와 섬유아세포가 포함된 상층액을 원심분리하고, 침전물을 1.5밀리리터의 혈관내피세포 분리 완충액에 다시 부유시킵니다. 세포를 2밀리터 샘플 튜브로 옮기고, mouse anti-rat CD31 항체를 세포에 첨가하여 4도에서 30분 동안 회전 혼합하며 배양합니다. 배양이 끝나면 Pan anti-mouse IGG 비즈를 첨가하여 4도에서 20분 동안 회전 혼합하며 배양합니다.비드 배양(incubation)이 끝나면, 세포를 마그네틱 랙에 2분 동안 두고 1 mL 피펫을 사용하여 대부분 섬유아세포가 포함된 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 10 mL의 섬유아세포 배양 배지가 들어 있는 10 cm 배양 접시에 섬유아세포를 넣고, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 다음으로, 혈관내피세포가 든 튜브에 1 mL의 세척 완충액을 넣고 튜브 캡을 닫습니다.비드를 다시 현탁시키기 위해 세포를 4~5회 가볍게 흔들어 줍니다. 그 다음 튜브를 다시 자석에 놓고 1분 후 세척 완충액을 제거합니다. 마지막 세척 후, 세척 완충액을 1 mL의 MV2 혈관 내피 세포 배양 배지로 교체하고, 혈관 내피 세포를 12-well 플레이트의 단일 well에 분주하여 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.섬유아세포 배양이 끝나면, 미리 데워둔 PBS를 적절한 부피로 사용하여 부착된 세포를 2~3회 세척합니다. 그 다음, 미리 데운 신선한 섬유아세포 배양액을 세포에 첨가하고 섬유아세포를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 다음 날 아침, 혈관내피세포 배양액의 상층액을 신선한 혈관내피세포 배양액으로 교체하고 세포를 인큐베이터로 옮기며, 세포가 반합류(semi-confluency) 상태가 될 때까지 2~3일마다 배지를 교체합니다.그런 다음, 방금 시연한 것과 같이 신선하게 미리 데워진 PBS로 부착된 섬유아세포 배양물을 세척하고, 신선하게 미리 데워진 배지를 공급합니다. 심근세포 분리 절차를 통해 70에서 80%의 순도로 생존 가능한 막대 모양의 가로무늬 심근세포 집단을 얻을 수 있습니다. 이후 fura AM이 로딩된 분리된 심근세포를 이용하여 허혈 재관류에 반응하는 세포 내 칼슘 진동 분석을 수행할 수 있으며, ATP 첨가 후 자기 비드로 분리된 혈관내피세포 및 섬유아세포에서의 칼슘 신호 변화 분석 또한 수행할 수 있습니다.이 기술을 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 가장 중요한 점은 관류 시스템을 올바르게 설정하고, 준비가 완료되는 즉시 심장을 시스템 내에서 신속하게 고정하는 것입니다. 이 기술의 개발 이후, 심혈관 연구 분야의 연구자들은 다양한 심혈관 병태생리에 관여하는 신호 전달 체계를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청한 후, 귀하는 심장 세포 분리 및 배양의 기본 원리에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 수술 도구와 세포 배양 시약을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 도구의 주의 깊은 사용 및 장갑 착용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 논문에서 우리는 성인 쥐 심장 myocytes를 분리하고 문화에 전형 방법을 설명했다. Collagenase와 단백 분해 효소는 단일 myocytes을 소화하고 격리하는 데 사용됩니다. Myocytes는 대부분의 실험 요구 사항을 충족이 프로토콜을 따라 교양.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

우리는 소화 완충제에서 순차적 조직 소화를 통해 쥐 심혼에서 내심 과 관상 관상 내피 세포의 격리를 위한 프로토콜을 제시하고, 재발하는 원심분리기 주기에서 세포 수집 및 반대로 쥐 CD31 마이크로비드를 사용하여 세포 정화.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

배우세요 성인 쥐 심장에서 심근세포, 내피세포 및 섬유아세포를 동시에 격리하는 최적화된 프로토콜을 Langendorff 관류 시스템을 사용하여. 이 방법은 심혈관 연구 비용을 절감하고 실험 동물 수를 줄이는 데 도움이 됩니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

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