성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

이 절차의 전반적인 목표는 개별 체외 분석을 위해 쥐의 심장에서 생존 가능한 심근세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 동시에 분리하는 것입니다. 이 방법은 심장 비대, 허혈, 재관류 손상, 내피 기능 및 심장 섬유증과 관련된 신호 전달 메커니즘에 대한 심혈관 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 주요 심장 세포를 동시에 분리할 수 있어 관련 연구 비용과 실험 동물 수를 줄일 수 있다는 것입니다.

증류수 1 개와 50 밀리리터 파월 매체 1 회 플러시 후, 매체를 80 밀리리터의 새로운 파월 매체로 교체하고 유리 실린더의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 발탄원으로 지속적으로 관류합니다. 다음으로, 두 쌍의 얇은 곡선 겸자를 사용하여 대동맥을 통해 갓 채취한 쥐 심장을 Langendorff 관류 시스템에 장착하고 관류 시스템 캐뉼라의 끝을 첫 번째 대동맥 분지와 대동맥 판막 사이에 놓습니다. 악어 클램프로 대동맥을 고정하십시오.

캐뉼라의 판막을 열고 외과 봉합사로 심장을 고정합니다. 35ml의 관류 배지가 심장 방울을 현명하게 통과하도록 하여 잔여 혈액을 제거합니다. 수집 깔때기를 심장 아래에 놓고 연동 펌프를 시작하여 수집 깔때기에서 저장소로 관류 매체를 재순환시킵니다.

관류 배지에 콜라겐분해효소 용액을 첨가하고 재순환 콜라겐분해효소 용액으로 심장을 30분 동안 관류합니다. 소화가 끝나면 가위를 사용하여 Langendorff 시스템에서 심장을 제거하고 유리 페트리 접시에 넣습니다. 이제 심장에서 심방과 남은 지방 조직을 모두 제거합니다.

상피 세포 오염을 방지하려면 두 개의 집게를 사용하여 심낭을 조심스럽게 벗겨냅니다. 심장을 가운데로 자르고 반쪽을 조직 헬기에 넣습니다. 심장을 두세 번 다진 다음 조직 조각을 Langendorff 관류에서 12ml의 소화 완충액이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

조직 조각을 수조에서 5-10분 동안 소화하고 때때로 5ml 일회용 플라스틱 피펫과 혼합합니다. 그런 다음 100마이크로미터 체를 통해 세포 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 여과합니다. 최소 1리터의 증류수로 관류 시스템을 세척한 다음 100ml의 0.1 일반 수산화나트륨으로 30분 동안 세척한 다음 또 다른 2-3리터의 증류수로 시스템을 세척하고 세척된 공기로 장치를 건조시킵니다.

여과된 세포를 원심분리로 채취한 후 일회용 피펫을 사용하여 상층액이 함유된 내피 세포와 섬유아세포를 새 50ml 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 펠릿을 6 밀리리터의 칼슘 용액 1에 재현탁시킵니다. 1분 후, 두 번째 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 6밀리리터의 칼슘 용액 2에 재현탁합니다.

1 분 후에, 칼슘 해결책 3의 12 밀리리터의 추가로 세포 현탁액을 묽게 하고, 온화한 경사기에 의하여 잘 섞으십시오. 또 다른 원심 분리 후, 펠릿을 예열 된 CCT 배지 20 밀리리터에 재현탁시킵니다. 그런 다음 라미닌이 사전 코팅된 20개의 멸균 35mm 세포 배양 접시 각각에 1ml의 세포를 분취하고 세포를 무이산화탄소 배양 배양기에 넣고 배지를 2ml의 새로운 CCT 배지로 교체하여 2시간 후에 죽은 세포를 제거합니다.

이제 상층액을 함유한 내피 세포와 섬유아세포를 원심분리하고 펠릿을 1.5ml의 내피 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 세포를 2mL 샘플 튜브에 옮기고 마우스 항쥐 CD31 항체를 세포에 첨가하여 섭씨 4도에서 종단 간 회전으로 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 Pan anti-mouse IGG beads를 섭씨 4도에서 20도 동안 배양하고 종단 간 회전으로 추가합니다.

비드 배양이 끝나면 세포를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 1ml 피펫을 사용하여 대부분 섬유아세포가 포함된 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 10ml의 섬유아세포 배양 배지가 들어 있는 10cm 배양 접시에서 섬유아세포를 관찰하고 세포를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소의 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다. 다음으로, 내피 세포관에 세척 완충액 1ml를 추가하고 튜브를 덮습니다.

세포를 4-5회 부드럽게 흔들어 비드를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 튜브를 자석에 다시 넣고 1분 후에 세척 버퍼를 제거합니다. 마지막 세척 후 세척 버퍼를 1ml의 MV2 내피 세포 배양 배지로 교체하고 내피 세포를 12웰 플레이트의 단일 웰에 파종하여 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

섬유아세포 배양이 끝나면 부착된 세포를 예열된 PBS를 적당량으로 2-3회 세척합니다. 그런 다음 예열된 신선한 섬유아세포 배양 배지를 세포에 추가하고 섬유아세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음날 아침, 내피 세포 배양의 상층액을 새로운 내피 세포 배양 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 반 융합 될 때까지 2-3 일마다 배지를 교체하십시오.

그런 다음 방금 시연된 바와 같이 부착된 섬유아세포 배양액을 예열된 신선한 PBS로 세척하고 세포에 예열된 신선한 배지를 공급합니다. 심근세포 분리 절차는 70-80%의 순수하고 생존 가능한 막대 모양의 줄무늬 심장 세포 집단을 산출합니다. 그런 다음 심근세포의 허혈 재확산에 대한 반응으로 fura AM이 로드된 고립된 심근세포의 세포 내 칼슘 진동 분석을 수행할 수 있으며, ATP 첨가 후 자기 비드 격리 내피 세포 및 섬유아세포에서 칼슘 신호의 변화를 분석할 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 관류 시스템을 올바르게 설정하고 준비가 되는 즉시 시스템에 심장을 고정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 심혈관 연구 분야의 연구자들이 다양한 심혈관 병태생리학과 관련된 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 심장 세포 분리 및 배양의 기본 원리를 잘 이해하게 될 것입니다. 수술 기구 및 세포 배양 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 기구의 신중한 사용 및 장갑 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.