난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

본 프로토콜의 전반적인 목적은 난자 미세주입법을 통해 유전자 변형 마우스를 성공적으로 제작하는 데 필요한 절차를 설명하는 것입니다. 본 프로토콜은 마우스 제작뿐만 아니라 유전자 타겟팅 분야에 종사하는 연구원 및 기술진에게 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무작위 삽입과 유전자 타겟팅 모두에 대해 마우스 난자에 직접 주입하는 방식에 의존하므로, 최소 6주 만에 유전자 변형 마우스를 제작할 수 있다는 점입니다.

단일 가이드 RNA를 준비하려면, 원하는 두 개의 표적 서열을 선택하고 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머를 제작한 후, PX330 플라스미드를 nuclease free water로 10 nanograms per microliter 농도로 희석하여 선형 DNA 템플릿을 합성합니다. 폴리머라제는 마지막에 첨가하여 마스터 믹스를 조제하고 얼음 위에 보관합니다. 그 다음, 용액을 혼합하여 8개의 PCR 튜브에 나누어 담습니다.

튜브당 1 µL의 PXR330을 첨가하고, 다음 프로그램을 실행합니다. 그 다음, PCR 정제 키트, 매니폴드 및 진공 장치를 사용하여 PCR 생성물을 정제합니다. PCR 샘플 1 부피당 5 부피의 결합 버퍼를 첨가하고 혼합합니다.

실리콘 막 스핀 컬럼을 매니폴드 위에 놓습니다. DNA를 결합시키려면 진공 상태에서 8개 샘플 모두를 컬럼에 분주합니다. 샘플을 세척하려면 세척 버퍼 0.75 milliliters를 컬럼에 넣고 진공 처리합니다.

그런 다음, 잔류 에탄올을 제거하기 위해 컬럼을 12,000 ×g에서 60초 동안 원심 분리합니다. 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 넣은 후, DNA를 용출시키기 위해 멤브레인 중앙에 nuclease free water 30 µL를 첨가합니다. 컬럼을 1분 동안 그대로 둔 후, 12,000 ×g에서 60초 동안 원심 분리합니다.

그 후 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. T7 RNA 합성 키트를 사용하여 인비트로(in vitro) 전사를 수행하려면, 마스터 믹스를 준비하고 써모 사이클러에서 37 °C로 3시간 동안 반응을 배양합니다. nuclease free water 28 µL와 DNAse one 2 µL를 추가하고, 15분 동안 더 배양합니다.

RNA를 정제하려면, 제공된 스핀 컬럼 내의 분말에 650 µL의 nuclease-free micro injection buffer를 넣어 녹입니다. 공기 방울을 모두 조심스럽게 제거한 후 튜브 캡을 닫고 상온에서 5~15분 동안 용액을 수화시킵니다. 하단의 파란색 캡을 제거하고 컬럼을 2 mL 튜브에 넣습니다.

그런 다음 튜브를 상온에서 750 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 이어서 컬럼을 새로운 1.5 mL 튜브에 넣고, 컬럼 벽면에 닿지 않도록 RNA 용액 50 µL를 중앙에 한 방울씩 가합니다. 그 후, 컬럼을 750 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 RNA 농도를 측정하고 RNA 품질을 평가합니다. 뉴클레아제 프리 마이크로 인젝션 버퍼를 사용하여, 유전자 넉아웃 실험을 위해 Cas9 mRNA는 50 ng/µL로, sgRNA는 12.5 ng/µL로 희석합니다. 상동 재조합 복구(HDR) 기반의 게놈 편집을 위해 공여체 템플릿을 200 ng/µL 농도로 첨가하고 얼음 위에 보관합니다.

흡입기 마우스피스를 사용하여 난모세포를 신선한 카제인 아미노산 네 방울로 세척하십시오. 그런 다음 미네랄 오일이 덮인 최종 카소메 8 배지 한 방울로 옮기십시오. 무작위 삽입을 위한 전핵 주입을 수행하려면, 실체 현미경 하에서 흡입기 마우스피스를 사용하여 약 50개의 난자를 주입 챔버로 사용할 미네랄 오일이 덮인 m2 배지 한 방울로 옮기십시오.

주입 챔버를 도립 현미경으로 옮기고, 수정란에 주입 혼합물 수 picoliters를 주입합니다. 주입이 성공적이면 전핵이 팽창합니다. 유전자 타겟팅을 위해 세포질 주입을 수행하며, 마우스피스를 사용하여 약 50개의 난자를 5 µg/mL의 cytochalasin B가 포함된 casome A 한 방울로 옮긴 후, 37 °C, 5% CO2 조건에서 5분 동안 배양합니다.

난자를 주입 챔버로 옮긴 후, 매우 낮은 압력에서 주입 혼합물 몇 picoliters를 세포질에 주입합니다. 가능한 경우 자동 미세 주입기의 보정 압력을 사용하십시오. 주입 후에는 마우스피스를 사용하여 난자를 casomeamino acids 방울로 다시 옮깁니다.

가성 임신된 암컷의 수란관에 재이식될 때까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 질전이 확인된 암컷 마우스를 마취한 후, 무균 상태에서 재이식을 수행하기 위해 메스를 사용하여 등 중앙선과 평행하게 1 cm 길이의 절개를 내어 생식관을 노출시킵니다. 그런 다음 가위로 근육을 절개하고 핀셋을 사용하여 지방 패드를 잡습니다.

난소와 연결된 수란관 및 자궁이 명확하게 보일 때까지 난소를 조심스럽게 끌어냅니다. 그런 다음 혈관 클램프를 사용하여 지방 패드를 고정합니다. 실체 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 팽대부에서 상류로 몇 밀리미터 떨어진 수란관 벽을 절개합니다.

또한, 실체 현미경 하에서 마우스피스에 연결된 유리 모세관에 미세 주입된 난자 25개를 로딩합니다. 그다음, 유리 모세관을 수란관에 삽입하고 팽대부 내부에 기포가 보일 때까지 난자를 배출합니다. 재이식이 성공적으로 이루어졌는지 확인하려면 팽대부 내에 기포가 존재하는지 확인해야 하며, 이는 모든 난자가 정확한 위치에 배출되었고 유리 모세관에 남은 난자가 없음을 보장합니다.

유리 모세관을 조심스럽게 제거하고 생식관을 다시 복강 내로 위치시킵니다. 그다음 3-0 비흡수성 외과용 봉합사로 절개 부위를 봉합하고, 상처 클립을 사용하여 피부를 폐쇄합니다. 저체온증을 방지하기 위해 마우스를 가온 패드 위에 올리고, 진통제를 피하 주사합니다.

마우스가 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 게놈 타이핑 및 시퀀싱을 수행합니다. 이 그림은 유전자 변형 마우스를 성공적으로 생성하는 데 필수적인 트랜스진 정제 및 sgRNA 합성의 품질을 보여주는 분석 젤을 나타냅니다.

여기에 무작위 통합을 위한 미세 주입 세션의 전형적인 판독 결과가 나와 있습니다. 유전자형 분석 프라이머는 외래 유전자에 위치해야 하며, 200에서 800 base pairs의 단편을 생성하도록 설계되어야 합니다. 유전자 타겟팅의 이번 판독 결과에서, 프라이머는 결과적으로 두 가이드에 의해 절단된 영역 외부의 게놈 DNA와 하이브리드화되도록 선택되었습니다.

이 전략을 통해 헤테로 접합 및 호모 접합 녹아웃 파운더를 직접 식별할 수 있습니다. 여기에 설명된 것처럼, 프로토콜의 각 단계가 최적화되었을 때 무작위 삽입의 경우 형질전환 새끼 쥐의 비율은 10%에서 25%에 도달하는데, 이는 마우스 게놈을 편집하는 CRISPR 구성 요소의 능력에 비해 다소 낮은 수치입니다. 유전자 타겟팅에 CRISPR를 사용하는 경우 파운더의 수는 일반적으로 더 높으며 25%에서 100% 범위에 이릅니다. CRISPR를 사용하여 편집했을 때 자손 전체가 성공적으로 호모 접합이 되는 경우도 드물지 않습니다.

이 기술이 개발됨에 따라, 예를 들어 신경과학이나 암과 같은 분야의 연구자들은 새로운 마스크 모델을 사용하여 병리적 기전을 발견하고, 궁극적으로 이를 치료 전략으로 전환할 수 있게 되었습니다.