난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 난모세포의 미세주입에 의한 유전자 변형 마우스의 성공적인 생성에 필요한 절차를 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 마우스 발생 분야뿐만 아니라 유전자 표적화 분야와 관련된 연구자와 기술 인력에게 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 무작위 통합뿐만 아니라 유전자 표적화를 위해 마우스 난모세포를 직접 주입하여 6주 이내에 유전자 변형 마우스를 생성할 수 있다는 것입니다.

단일 가이드 RNA를 준비하기 위해, 원하는 두 개의 타겟 염기서열을 선택하고 텍스트 프로토콜에 따라 프라이머를 만든 후, PX330 플라스미드를 뉴클레아제가 없는 물에서 마이크로리터당 10나노그램으로 희석하여 선형 DNA 템플릿을 합성합니다. 마스터 믹스를 준비하고 마지막에 중합효소를 첨가하고 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 용액을 혼합하여 8개의 PCR 튜브로 분할합니다.

튜브당 1마이크로리터의 PXR330을 추가하고 다음 프로그램을 실행합니다. 다음으로, PCR 정제 키트, 매니폴드 및 진공 소스를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. PCR 샘플의 1 부피에 5 부피의 결합 완충액을 추가하고 혼합합니다.

매니폴드에 실리콘 멤브레인 스핀 컬럼을 놓습니다. DNA를 결합하려면 진공 상태에서 8개의 샘플을 모두 컬럼에 적용합니다. 샘플을 세척하려면 0.75ml의 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 진공 청소기로 청소합니다.

그런 다음 12, 000회 G에서 60초 동안 컬럼을 원심분리하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 컬럼을 넣은 다음 DNA를 용리화하기 위해 멤브레인 중앙에 30마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가합니다. 란을 1 분 동안 서 있게 하고 60 초 동안 12, 000 시간 G를 원심분리하십시오.

그런 다음 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. t7 RNA synthesis kit를 사용하여 in vitro transcription을 수행하려면 마스터 믹스를 준비하고 37°C의 thermo cycler에서 3시간 동안 반응을 배양합니다. 28마이크로리터의 뉴클레아제 자유수와 2마이크로리터의 DNAse 1을 첨가하고 15분 더 반응을 배양합니다.

RNA를 정제하려면 제공된 스핀 컬럼과 650마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 마이크로 주입 완충액에 포함된 분말을 용해합니다. 모든 기포를 조심스럽게 제거하고 튜브의 뚜껑을 씌우고 용액을 실온에서 5-15분 동안 수화합니다. 하단의 파란색 캡을 제거하고 컬럼을 2밀리리터 튜브에 넣습니다.

그런 다음 실온에서 750배 G로 튜브를 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 컬럼을 새 1.5ml 튜브에 넣고 컬럼 벽을 건드리지 않고 중앙에 50마이크로리터의 RNA 용액을 떨어뜨립니다. 그런 다음 2분 동안 G를 750배로 열을 회전합니다.

RNA 농도를 측정하고 텍스트 프로토콜에 따라 RNA의 품질을 평가합니다. nuclease free 마이크로 주입 완충액을 사용하여 유전자 녹아웃 실험을 위해 케이스 9 mRNA를 마이크로리터당 50 나노그램으로, sgRNA를 마이크로리터당 12.5 나노그램으로 희석합니다. 상동성 직접 복구를 기반으로 한 게놈 편집을 위해 마이크로리터당 200나노그램의 농도로 기증자 템플릿을 추가하고 얼음에 보관합니다.

흡인기 마우스 피스를 사용하여 카제인 아미노산 4방울로 난모세포를 세척합니다. 그리고 미네랄 오일로 덮인 casome eight medium의 마지막 방울로 옮깁니다. 무작위 통합을 위한 프로 핵 주입을 수행하려면 실체 현미경 아래에서 흡인기 마우스 피스를 사용하여 약 50개의 난자를 주입 챔버로 사용될 미네랄 오일로 덮인 m2 배지 한 방울로 변환합니다.

주입 챔버를 도립 현미경으로 옮기고 수정된 난모세포에 주입 혼합물의 몇 피코리터를 주입합니다. 주사가 성공하면 전핵이 부풀어 오를 것입니다. 유전자 표적화를 위한 세포질 주입을 수행하고, 마우스피스를 사용하여 약 50개의 난자를 시토칼라신 B 밀리리터당 5마이크로그램을 함유한 카솜 A 한 방울로 옮기고 섭씨 37도에서 5분 동안 5% 이산화탄소를 배양합니다.

난자를 주입 챔버로 옮긴 다음 매우 낮은 압력으로 주입 혼합물의 몇 피코리터를 세포질에 주입합니다. 가능한 경우 자동 마이크로인젝터의 보상 압력을 사용합니다. 주사 후 마우스피스를 사용하여 난모세포를 카소메아미노산 한 방울로 다시 이동합니다.

유사 임산부의 난관에 재이식하기 위해 적재될 때까지 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 유지하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 막힌 암컷 마우스를 마취한 후 멸균 상태에서 재이식을 수행하려면 등쪽 정중선과 평행한 1cm 길이의 절개 부위에 메스를 사용하여 생식관을 노출시킵니다. 그런 다음 가위로 근육을 자르고 집게를 사용하여 지방 패드를 잡습니다.

부착된 난관과 자궁이 명확하게 보일 때까지 난소를 부드럽게 당겨 빼냅니다. 그런 다음 용기 클램프를 사용하여 뚱뚱한 패드를 고정합니다. 실체 현미경 아래에서 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 앰풀라에서 몇 밀리미터 상류에 있는 난관 벽을 절개합니다.

또한 실체 현미경으로 마우스피스에 연결된 유리 모세관에 25개의 마이크로 주입된 난자를 로드합니다. 그런 다음 유리 모세관을 난관에 삽입하고 앰풀 내부에 기포가 보일 때까지 난자를 배출합니다. 재삽입이 성공적으로 이루어졌는지 확인하려면 앰풀라에 기포가 있는지 확인해야 하며, 이를 통해 모든 난자가 올바른 위치에서 배출되고 유리 모세혈관에 난자가 남아 있지 않은지 확인해야 합니다.

유리 모세혈관을 부드럽게 제거하고 생식관을 복부에 다시 놓습니다. 그런 다음 3개의 흡수되지 않는 수술용 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합한 다음 상처 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 저체온증을 피하기 위해 마우스를 따뜻한 매트 위에 놓고 진통제를 피하에 주사합니다.

완전히 복구될 때까지 마우스를 모니터링합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 게놈 유형 분석 및 염기서열 분석을 수행합니다. 이 그림은 유전자 변형 마우스를 성공적으로 생성하는 데 중요한 transgene 정제 및 sgRNA 합성의 품질을 보여주는 분석 gel을 보여줍니다.

여기에 표시된 것은 무작위 통합을 위한 마이크로 주입 세션의 일반적인 판독입니다. 유전형 분석 프라이머는 전이유전자에 위치해야 하며 200 - 800 염기쌍의 단편을 생성하도록 설계되어야 합니다. 유전자 표적화를 위한 이 판독에서, 지역 외부의 게놈 DNA와 교잡하기 위해 선택된 프라이머는 결국 두 사람에 의해 절제되었습니다.

이 전략을 사용하면 이형접합 및 동형접합 녹아웃 설립자를 직접 식별할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 프로토콜의 각 단계가 최적화되면 무작위 통합의 경우 형질전환 강아지의 비율이 10%에서 25%에 도달해야 하며, 이는 마우스 게놈을 편집하는 CRISPR 구성 요소의 능력에 비해 다소 낮습니다. 유전자 표적화를 위해 CRISPR을 사용하면 설립자 수가 일반적으로 25%에서 100%에 이르기까지 더 높으며, CRISPR을 사용하여 편집할 때 성공적으로 동형접합적인 전체 자손을 얻는 것은 드문 일이 아닙니다.

개발 후 이 기술을 통해 신경 과학 또는 암과 같은 분야의 연구자들은 새로운 마스크 모델을 사용하여 병리학적 메커니즘을 발견하고 궁극적으로 이를 치료 전략으로 변환할 수 있습니다.