Name: 디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 학습하세요 TALEN을 이용한 마우스 유전자 결핍 모델 생성 방법을 마우스 수정란에 미세주사하여 유전자 기능 연구에 활용합니다. 이 기술은 정밀 유전자 편집과 생물학적 메커니즘 규명에 필수적입니다.

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우리는 우수한 기술 지원을 모니카 Tarnowska, 코르넬리아 알브레히트, 그리고 에바 Skoczylas에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 SNF Sinergia 부여 CRSI33-125073 PP에 의해 투자되었다.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

디자이너 클레아 제 중심의 게놈 편집 방법은 크게 각각의 게놈 (10, 12)의 목표 수정에 순종하는 종의 범위를 확장했다. 생쥐에서 유전자 표적으로 ES 세포에서 두 년 이상을위한 표준 기술이다; 쥐의 ES 세포의 일부가 최근 성공 하였지만 그러나, 마우스 이외의 종에서 ES 세포에 적응하기 어려운 입증되었다. 심지어 EUCOMM, KOMP, 또는 ZFN 및 TALEN는 높은 정밀도와이 될 수 있습니다 수정의 스펙트럼에 대한 유연성을 제공하여 NorCOMM 3 게놈 편집과 같은 컨소시엄에 의해 제공 &quot;기성&quot;유전자 타겟 마우스 ES 세포 클론의 가용성 마우스 게놈에 도입했다. 클레아 제 - 매개 변이를 들고 설립자 동물은 항상 ES 세포의 배반포 주사에서 발생하는 키메라의 경우에는 해당되지 않습니다 높은 세균 줄 능력 4-6,20,21 될 것으로 보인다. 따라서, DES의 특정 경우의 미세 주입에igner의 클레아는 ​​표적으로 한 게놈 수정을 새로운 마우스 선 훨씬 빠르게 생성 될 수 있습니다. ZFN 및 TALEN의 주사로 녹아웃 마우스의 성공적인 세대는 주입 된 핵산 분해 효소 쌍의 활동에 따라 크게 좌우됩니다. TALENs 유기체의 수의 유전자의 넓은 범위를 대상으로 높은 성공률을 보여왔다; 그러나, 최근의 연구는 TALEN 바인딩 시토신 메틸화 (30, 31)에 민감한 것이 좋습니다. 따라서, 새로 생성 된 핵산 분해 효소 쌍, 예를 들어 TALENs이 pCAG-T7 벡터에 클로닝 등 NIH-3T3 또는 신경과 같은 마우스 세포주에 일시적으로 형질 전환 할 수 있습니다 다소 마우스 배아의 염색질 상태를 모방-2A. 여기서, 뉴 클레아 제 활성은 종래의 mRNA 합성과 마이크로 인젝션에 제 5 절에 설명 된 T7 효소 분석 또는 PCR 생성물의 제한 다이제스트를 사용하여 추정 될 수있다. 우리는 점에서 관심의 게놈 영역의 염기 서열을 추천합니다세포주 및 마이크로 인젝션 실험에 사용 된 마우스 균주를 필자. 마우스의 수정란에서 다른 TALEN 또는 ZFN 쌍은 서로 다른 mRNA의 농도에서 최적으로 작동하기 때문에 미세 주입 핵산 분해 효소의 mRNA의 최적의 작업 농도는 실험적으로 결정해야 할 수 있습니다. 너무 높은이 배아 치사 될 수있는 반면 뉴 클레아 쌍에 따라, 너무 낮은 농도는없는 분열을 초래할 것입니다. 클레아 쌍에 따라, 우리는 2 NG / μL, 200 ㎍ / UL의 높은 최저 총 mRNA의 농도를 사용하여 성공을 거두었습니다. 이러한 효과는 세포 배양 및 배아의 생존과 목표 궤적의 변형 속도가 모두 경험적으로 결정해야합니다에 대한 핵산 분해 효소의 농도 최적의 실험에서 예측하기 어렵다. 고 활성 ZFN 또는 TALEN는 미세 주입 배아의 한 세포 단계를 넘어 자신의 표적 서열을 절단하기 때문에 돌연변이 유발의 복잡한 패턴을 일으킬 수 있습니다설립자의 D 모자이. 우리와 다른 사람 (4)는 하나의 창시자 (그림 5C)에 세 개 이상의 서로 다른 돌연변이 대립 유전자를 관찰했다. 이 시조에서 새로운 마우스 라인을 설정할 때 따라서, 자식은 신중하게 소화 분석은 정의되지 않은 돌연변이가 존재하는 경우에만 있다는 증거를 제공하기 때문에 유리한 돌연변이의 존재에 대한 염기 서열 검사를해야한다. 비판 중 하나는 자주 ZFN 및 TALEN 시스템에 대해 표명이 클레아도 대상 사이트와 유사하다 게놈에 다른 곳에서 현재 시퀀스를 쪼개기의 할 수있는 가능성이있다. 이러한 오프 대상 효과는 homodimeric의 FokI 도메인을 사용하여 초기 세대 시약으로 관찰되었으며, 이종 구조는 오프 대상 효과 25을 완화하도록 설계되었습니다. 잠재적 오프 - 타겟 위치는 (32, 33)에 실리 다소 예측과 PCR 및 시퀀싱에 의해 스크리닝 할 수있다. 분명한 장점 O오히려 F 세포주보다 마우스를 생성하고 ZFNs TALENs를 사용하여 선택 야생형 균주 몇개 backcrosses를 수행하여 원하는 게놈 수식에 링크 해제 대상 돌연변이를 제거 할 가능성이있다. 창시자 마우스의 다수 클레아 타겟 궤적 생성 및 실리코 오프 - 타겟 예측 PCR 제품의 차세대 깊은 시퀀싱 분석 유전자좌는 PCR 생성물의 분해 분석에 대안 정량적 판독을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명하는 보조 생식 기술은 이러한 C57BL/6J 또는 B6D2F1 같은 미세 주입 실험에 사용되는 표준 마우스 종자에 최적화되어 있습니다. 이러한 이계 교배 균주 등 다양한 기원의 마우스는 원칙적으로 게놈 편집 방법에 사용할 수있는 특정 연구 질문에 대한 더 적합한 유전 배경을 제공 할 수 있습니다. 이러한 과배란 같은 보조 생식 기술의 성능은 predi이 될 수 있습니다변종 34-36의 번호를 cted하지만 클레아 미세 주입을위한 배아의 충분한 수를 얻기 위해 비표준 변종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. ZFN 및 TALEN 게다가, 이러한 RNA 유도 CRISPR/Cas9 시스템 9,37,38 새로운 디자이너 클레아 지금 게놈 편집 응용 프로그램에 도입되었습니다. 미세 주입하고 여기에 설명 설립자 동물의 분석을위한 모든 방법은 CRISPR/Cas9 게놈 편집의 미래 모드에 적용 할 수있다.

마우스는 유전자 변형 동물 모델을 생성하기위한 지금까지 가장 인기있는 플랫폼이다. 마우스 배아 1-3의 유전 공학에 대한 다양한 도구 상자는 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)와 같은 디자이너 클레아 제에 따라 게놈 편집 방법에 의해 4-6, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN)를 7,8 확장되었습니다 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 9. ZFN하고, 각각 FokI 효소 10-12에 결합된다 (각각 징크 핑거 단백질의 배열과 반복 변수를 디 - 잔기 (RVDS))이 맞춤 설계 단백질 기반의 DNA-결합 도메인 쌍으로서 TALEN 기능. 반대로, Cas9 매개 DNA 절단의 특이성은 (또한 하나의 키메라 RNA 분자라고 가이드 RNA에 결합 할 수 있습니다 crRNA 및 tracrRNA) CRISPR RNA를을 transactivating에서 제공하는 복잡 한 행동 (11)CRISPR 단백질. RVDS의 정의 된 순서와 TALENs 빠르게 13-17 선택할 수있는 조립 전략 다수의 개별 실험자에 의해 구성 될 수있다. CRISPR/Cas9 그러나 가이드 RNA-DNA의 특이성은 아직 완전히 18, 19가 해결되지 바인딩, 디자이너 클레아의 더 적은 노동 집약적 인 발전을 약속합니다. 사용자 정의 ZFNs의 생성은 지금까지 전문 대학 실험실과 같은 Sangamo Biosciences에와 시그마 CompoZr 서비스로 상용 공급 업체로 제한하고있다. 일반적으로 디자이너 클레아와 편집 게놈 이후에 합류 동종 끝 (NHEJ) 또는 상동 재조합 (HR) DNA 수리 기계 (10, 12)을 유치 정의 게놈 유전자 좌에서, 이중 가닥 휴식 (DSB)를 소개하는 것을 목표로하고있다. DSB의 NHEJ - 중재 수리는 종종 수리의 사이트에 근접 삽입과 삭제의 도입 발생합니다. 따라서 NHEJ 수리 C는 유전자의 단백질 - 코딩 서열 4,7,9 내에 프레임 쉬프트 돌연변이를 도입함으로써 표적 유전자의 기능을 노크 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 또는 추가로 정의 된 유전 정보의 보충은 가방 클레아 함께 DNA 공여체를 제공함으로써 달성 될 수있다. DNA 기증자 따라서 HR에 의해 DSB 복구를위한 템플릿으로 봉사 대상 궤적 상 동성 지역으로 측면에 조사 설계 DNA 서열을 포함한다. 플라스미드 5,6,20 및 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드 8,9,21 모두 성공적으로 기증자로 사용되었습니다. NHEJ-또는 이용 HR-매개 게놈 편집 둘다 전체적인 유전자 구조를 방해하지 않고, 염기 배열에서의 작은 변화를 생성하기위한 이러한 전략이 특히 적합하게 마우스 배아의 게놈에 선별 마커의 도입을 필요로한다. 이 프로토콜에서 우리의 게놈 편집을위한 모든 필수 절차에 대해 설명합니다TALENs를 사용하여 마우스 배아. 이들은 TALEN 대상 사이트 22의 1) 식별을 포함, 골든 게이트 복제 (13)에 의해 TALENs 2) 건설, TALEN의 mRNA, 수정 된 마우스 난자, 배아 전송을 위해 5) 수술 절차에 TALEN의 mRNA 4) 미세 주입 3) 체외 합성 , 6) 설립자 동물 TALEN 유발 돌연변이의 분석. 우리는 TALEN mRNA의 미세 주입 및 NHEJ에 의한 삽입 / 삭제에 설립자의 심사에 초점을 맞 춥니 다. 이 목적을 위해 우리는 플라스미드로 마우스 배아에 미세 주입을위한 TALEN의 mRNA의 생체 합성에 형질 때 포유 동물 세포 모두에서 발현을 허용 관능 TALEN 구조를 생성 한. 이러한 구조는 이종이 FokI 융합 잘린 이야기 백본 (23)는 포유 동물 세포에서 최적의 게놈 편집 (24, 25)를 도메인을 포함한다. 이 프로토콜은 다른 디자이너 클레아의 미세 주입 또는 디자이너 클레아의 결합 주사를 채택 할 수있다기증자 구조 (DNA 기증자의 디자인 Wefers 등. (26, 27)에 의해 우수한 기술 문서에 기술되어있다). 윤리 정책 모든 동물 실험은 광저우 취리히 주립 동물 병원의 지침과 규정에 따라 수행되었다.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S 또는 L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S 또는 L</td><td></td></tr><tr><td>spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 안전 뉴클레아제</td><td>진원지</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 울트라 키트</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway 스핀 컬럼</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>시그마</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 포름알다이드 로드 염료</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA 밀레니엄 마커</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 엔도뉴클레아제</td><td>NEB</td><td>M0302S 또는 L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector 시스템 I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I 핵산 젤 염색</td>제 <td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>임산부&#039; s 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬 (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 배아 배양 배지</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 배아 배양 배지</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일, 배아 테스트 Sigma</td><td></td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">장비/도구</td></tr><tr><td>Nomarski DIC 광학 장치가 있는 도립 현미경(예: Nikon Eclipse TE200)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator 장치(예: Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배아 보유 모세관</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>배아 주입 모세관</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>모세관 풀러(예: Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge(예: Narishige MF-900)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton 스킨 가위</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>수술용 프로브</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>반사 상처 클립 시스템(9mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>반사성 상처 클립(9mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 미세 집게 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria 곡선 집게</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Moria 미세 집게</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>디트리히 불독 클램프</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Labs</td><td>스트레인 코드 000664</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 마우스</td><td>Charles River</td><td>스트레인 코드 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

사이트 별 게놈 수정 (녹아웃, 노크에있는)를 운반하는 형질 전환 마우스는 복잡한 생물학적 시스템을 해부뿐만 아니라 인간의 질병을 모델링 및 치료 전략을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 대한 CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 사이트로 디자이너 클레아의 사용에서 최근의 진보 특정 게놈 공학은 배아 줄기 (ES) 세포 기술에 의존 할 필요없이 거의 모든 실험 종 급속한 표적 유전자 변형을 수행 할 수있는 가능성을 연다. 게놈 편집 실험은 일반적으로 조사 정의 게놈 현장에 핵산 분해 효소의 활동을 직접 지정 DNA 결합 도메인의 구성에 따라 관심의 유전자 내에서 디자이너 클레아 대상 사이트의 식별로 시작합니다. 가방 클레아 플라스미드 체외에 &lt;/ EM&gt; 수정 된 마우스 난자의 미세 주입에의 mRNA를 생성하는 전사. 여기, 우리는 수정 된 마우스의 난자에 TALEN mRNA를 직접 분사 대상이 게놈 수정을 달성하기위한 프로토콜을 제공합니다.

우리는 포유 동물 세포에서 TALENs의 표현뿐만 아니라 T7 파지 프로모터 (그림 1C)에서 체외 mRNA의 합성을 허용 Cermak 등. (13)에 의해 발표 된 골든 GateTALEN 어셈블리와 호환 대상 플라스미드를 건설했다. 이 플라스미드 FokI 동종이 량체에 대해 오프 대상 영향을 줄이기 위해 FokI는 25,29를 이종 첫 번째 세대에 비해 분열 활동을 강화하는 것으로 나타났다 이종이 FokI 도메인 (ELD 또는 KKR 돌연변이)를 수행한다. 골든 게이트 조립 반응 # 1과 # 2는 일반적으로 매우 효율적이며, 모든 흰색 식민지, 식민지 PCR로 분석 할 때, 복제 RVDS (그림 1B와 1D)의 특정 번호에 대한 예상 패턴을 보여줍니다. 체외 합성의 mRNA의 젤 분석 (그림 2) 분석의 모든 샘플에 대한 거의 또는 전혀 얼룩으로 하나의 구별 밴드를 공개한다. 성공적인 폴리아 데 닐화를 나타내는 샘플 L1/R1 및 L2/R2, L3/R3, 사이에 명확한 크기의 변화가 있어야합니다. 설립자 동물은 효소를 사용하여 하나 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화에 이어 유전자형 PCR (도 3) 또는 제한 다이제스트를 사용 NHEJ 유도 돌연변이 대립 유전자에 대해 스크리닝 할 수 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 클리브 야생형 서열 (도 4)이. T7 엔도 뉴 클레아 제 분석은 상관없이 주입 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 특정 게놈 서열의 돌연변이 모든 종류에 적용될 수있다; 그러나 heteroduplex PCR 제품에서 DNA 가닥 사이에만 불일치를 검출한다. 따라서, 설립자가 동일한 두 변이 대립 유전자를 운반하는 드문 경우에, PCR 제품은 T7 소화 패턴을 보여주지 않을 것입니다. 특정 제한 부위가 NHEJ 의해 제거 될 클레아 스페이서 영역 내에 위치 할 때 그러한 구별은 항상 그러나 가능삽입 / 삭제 (그림 5) 유도. 여기에, 소화되지 않은 밴드는 돌연변이의 존재를 표시하고 모든 소화 제품의 부재는 강하게 (그림 (b)에 별표로 표시) 대상 유전자의 두 대립 유전자의 돌연변이를 운반하는 창업자을 제안합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> 그림 1. pFUS 벡터에 RVD 배열의 이종이 pCAG-T7-대상 벡터에 TALEN RVDS의 골든 게이트 복제.) 조립. 다음 예는 각각의 이야기 배열은 각각 15 RVDS 17 RVDS를 포함와 TALEN 쌍에 대해 표시됩니다 (이상 21 RVDS보다 이야기 배열에 세 pFUS-RVDS 어셈블리가 표시되지 요구된다). 화살표는 pFUS 특정 식민지 PCR 반응. B) PCR 제품에 대한 프라이머를 나타냅니다올바른 pFUS의 어셈블리에서 증폭 일반적으로) 밴드가 복제 된 모든 RVDS (10 RVDS 용 등 약 1.1 KB) 및 적법 RVD 배열의 반복 특성으로 작은 덜 눈에 띄는 밴드의 &quot;사다리&quot;. C의 결합 길이에 대응 보여 최종 조립 pFUS-RVD 배열과 각각 FokIELD 및 FokIKKR 변형과 이종이 TALEN 발현 벡터에 마지막 반복 (PLR)를 포함하는 플라스미드. (N과 C로 주석) TALEN 백본 T7 파지 프로모터에 허용하는 동안 CAG (CMV 초기 증강 요소 / 닭 베타 - 액틴) 프로모터가 형질 전환 된 포유류 세포에서 높은 발현 수준을 보장 밀러 등. (23)에 의해 발표 된 아키텍처와 유사 체외 mRNA의 합성 (클레아 제 STOP 코돈의 하류 벡터의 선형화를위한 SacI에 사용). D) C에서 화살표로 표시된 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR)가 제대로 조립 TALENs을 식별 할 수 있습니다. 전체 lengt에&quot;사다리 효과&quot;성공적으로 어셈블리의 강력한 지표를 나타낸다 H PCR 제품은 종종 덜 눈에 띄는입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> 그림 2. . 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 시험 관내 합성 핵산 분해 효소의 mRNA의 품질 관리가 ZFN의의 mRNA는 예로 표시됩니다 (L, ZFN을 왼쪽, R, 우측 ZFN). 샘플 전에 폴리아 데 닐화에 mRNA를 보여 L1/R1, mRNA와 L3/R3 폴리아 데 닐화 샘플 L2/R2 쇼 정제 폴리아 데 닐화의 mRNA를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img<html> 콘텐츠 폭 FO = &quot;6 인치&quot;: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot;폭 = &quot;600&quot;FO 고도는 = &quot;그림 3&quot; /&gt; 그림 3. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이를 들고 설립자 동물의 식별에 사용 T7 효소 분석의 예. A) TALEN 쌍이 마우스 프리온 단백질 유전자 (PRNP의 코딩 영역 내에서 절단하도록 설계되었다 TALEN 표적 서열)은 요청에 따라 제공 될 수있다. PCR 생성물을 PCR 생성물이 연속적으로 형성 및 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화를 heteroduplex 행 하였다 상류 110 BP 위치한 정방향 프라이머 (F) 및 역방향 프라이머 (R) TALEN 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 이용하여 생성된다. C) 하나의 설립자의 대상으로 게놈 영역 내에서 TALEN에 의한 돌연변이 유발은 소화 (250)의 제품 및 110 bps의 전체 길이 PCR 제품의 존재에 의해 드러났습니다.50930/50930fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> 그림 4. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이 마우스 Rosa26 궤적 29 대상 인트론 (1)의 내부를 XbaI 제한 사이트. ZFN의 특정을 들고 설립자 동물의 식별에 사용되는 PCR 제품의 제한 다이제스트의 예.) 설립자는 사용하여 PCR 유전형에 의해 상영되었다 앞으로 프라이머 (F)는 500 상류 BP와 역방향 프라이머 (R) 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 XbaI과 PCR 제품의 소화가 별표로 표시 양방향 대립 유전자 돌연변이 생쥐 ()를 나타내는 소화 패턴을 보여, 모노 위치 - 대립 유전자의 돌연변이 (소화 소화되지 않은 밴드, 예를 들어 동물 2)잠재적 인 양 대립 유전자 변형 생쥐의 중량 및 마우스 (완전 소화, 예를 들어 동물 21). C) 연속 3 (동물 24) 별개의 삽입 / 삭제에 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 프라이머의 이름 </td><td> &#39;3&#39;시퀀스 5 </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> 표 1. 골든 게이트 TALEN 어셈블리 내에서 식민지의 PCR 및 시퀀싱에 사용되는 프라이머 시퀀스프로토콜입니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 플라스미드 / 컬렉션 </td><td> 기부자 </td><td> Addgene ID </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 골든 게이트 TALEN 및 TAL 이펙터 키트 2.0 </td><td> Voytas 실험실 </td><td> 1000000024 </td><td> 골든 게이트 TALEN의 조립에 필요한 모든 플라스미드를 포함 </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD 대상 벡터 </td><td> Pelczar 실험실 </td><td> 40131, 40132 </td><td> 부가 기능에 대한 포유 동물 세포의 체외 mRNA의 합성 TALEN 식에 대한 플라스미드 </td></tr></tbody></table> 표 2. 골든 게이트 TALEN 조립에 필요한 플라스미드 플라스미드 컬렉션 Addgene (에서 얻을 수 있습니다 <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 온라인으로자원 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> TALEN의 디자인; TALEN 오프 대상 예측 </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> TALEN, OPEN ZFN, 코다 ZFN, CRISPR/Cas9의 디자인 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> TALEN, CRISPR/Cas9의 디자인; CRISPR/Cas9 오프 대상 예측 </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> TALEN의 조립 순서의 결과를 확인하는 시퀀스 </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> 모듈 조립 ZFN 설계 </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> 모듈 조립 ZFN 설계 </td></tr></tbody></table> 표 3. ZFN, TALEN 및 CRISPR/Cas9 설계를위한 온라인 리소스. </strong&gt;

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

이 절차의 전반적인 목표는 디자이너 꼬리 뉴클레아제 또는 발톱의 도움으로 유전자가 결핍된 마우스를 빠르게 생성하는 것입니다. 이는 먼저 특정 탈론 쌍을 인코딩하는 DNA 구조를 설계하고 조립하여 수행되며, 이는 Talon mRNA를 생성하기 위한 체외 전사를 위한 템플릿 역할을 합니다. 절차의 다음 단계는 수정된 마우스 세포를 분리한 다음 T를 마이크로 주입하는 것입니다.마지막 단계는 주입된 세포를 유사 임신 위탁모에게 외과적으로 이식하는 것입니다.그 결과로 생성된 F zero 자손은 종종 표적 유전자 기능의 상실로 이어지는 게놈 염기서열의 부위 특이적 결실을 자주 보여줍니다. 여기에 제시된 방법은 쥐의 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기본 접근 방식은 쥐 및 물고기와 같은 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 먼저 사이트의 TAL effector nucleotide targeter 웹사이트에 접속합니다.TN targeter 프로그램을 선택하고 타겟 유전자의 염기서열을 붙여넣습니다. 이 프로토콜의 경우. 광고 유전자에서 사용할 수 있는 P-C-A-G-T 7가지 TALEN 발현 구조와 Golden Gate Talen 및 T effector 키트를 사용합니다.Talen 조립품에 다른 구성 또는 조립품 키트를 사용하는 경우 최적의 스페이서 길이 및 테일 RV 수에 따라 설정이 다를 수 있으므로 사전 설정된 아키텍처 사용 설정에서 Miller Etal 2011 옵션을 선택합니다. 그런 다음 G 대체 탭에서 NN을 선택합니다. 이 프로그램은 이 목록에서 생성된 잠재적 대상 사이트가 포함된 텍스트 파일을 생성합니다.필요한 Talen 쌍을 선택하고 Golden gate 어셈블리를 진행합니다. 이 프로토콜은 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬 5단위의 복강 내 주사를 사용하여 생후 4주에 C 57 BL 6 J 및 BDF 1개의 슈퍼 배란 10명의 기증자 암컷을 포함하여 가장 일반적으로 사용되는 실험실 마우스 균주에 작동합니다. 48 시간 후에 인간 융모성 성선 자극 호르몬 주입 메이트 직후 복강 내 주사에 의해 암컷에게 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 5 단위를 또한, 같은 날에 번식 연령 남성과 일대일로 암컷은 의사 임신 수양모를 준비합니다. 다른.다음 날 아침, 암컷을 제물로 바치고 ucts를 해부하여 수정된 난모세포를 회수합니다. 그런 다음 난모 세포 클러치를 M 2 배지 밀리리터가 들어있는 장기 배양 접시에 풀어 놓습니다. M 2 배지에 cyte clutches가 들어있는 접시에 0.1 % 소 hyaluronidase 용액 10 마이크로 리터를 추가하여 모든 적운 세포를 제거합니다.그런 다음 구강 피펫을 사용하여 M 2 배지를 2 회 또는 3 회 변경하여 배아를 세척하여 히알루로니다아제를 제거합니다. 아직 적운 세포에서 해리되지 않은 배아에 대해 히알루로니다아제 치료를 계속합니다. 분리된 배아는 마이크로 주입될 때까지 섭씨 37도의 M 16, 중간 온도와 5%의 이산화탄소에 보관할 수 있습니다.각 꼬리의 마이크로리터당 10나노그램을 포함하는 100마이크로리터의 주입 용액을 준비합니다. 뉴클레아제, mRNA, 쌍 및 원심분리기를 30분, 000G에서 펠릿으로 만듭니다. 주사 바늘을 막을 수 있는 모든 입자.그런 다음 믹스를 얼음 위에 보관하십시오. 이른 오후에 전핵 단계에서 난모세포를 주입할 계획을 세웁니다. 약 100개의 배아를 M 2 배지에 미네랄 오일 층 아래에 담그고 화성 DIC 광학 장치가 없는 도립 현미경에서 작업합니다.20배 확대 아래에서 뚜렷한 전핵을 가진 cyte를 선택합니다. 난모세포의 분류는 빈 주입 모세관 부하를 사용하여 수행할 수 있으며, 주입 모세관은 1-2마이크로리터의 주입 용액과 함께 사용됩니다. 그런 다음 마이크로 주입 헤드에 부착합니다.그런 다음 홀딩 모세관이 있는 선택한 cyte를 흡인하고 nuclease mRNA를 세포질에 얕게 주입합니다. 전핵과의 접촉을 피하십시오. 주입량은 낮게 유지되어야 합니다.세포질 팽창의 첫 징후가 나타나면 바늘을 빼냅니다. 일반적으로 배아의 약 80-90%는 즉각적으로 생존하지 않고 생존해야 합니다. 주입되는 mRNA의 양을 늘리려면 사용 가능한 cyte의 미량 주입 후 용액을 더 농축하십시오.구강 피펫을 사용하여 M 16 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 한 시간 동안 배아를 배양합니다. 그런 다음 살아남은 아이들을 가짜 임신 위탁모로 옮깁니다.미세주입 전날, 3개월에서 6개월 된 CD 한 마리의 암컷 쥐를 VAs, 섹터화된 수컷과 짝짓기하여 가짜 임신을 유도합니다. 다음날 아침, 배아 수혜자로 사용할 투명한 마개가 있는 암컷을 선택합니다. 사용하지 않은 암컷은 3주 후에 가성 임신 상태로 돌아가며 나중에 다시 사용할 수 있습니다.마취된 수양 어미 암컷을 복부의 따뜻한 표면 위에 놓습니다. 그런 다음 절개 부위에 70% 에탄올을 뿌려 소독합니다. 계획된 절개 부위에서 젖은 모발을 빗어냅니다.이제 가위로 복막강을 자르고 자궁 뿔을 외부화합니다. 이 작업을 수행합니다. 난소에 부착된 지방 패드를 당기고 불독 클램프로 생식 기관을 고정시킵니다.또한 0.9% 데운 염화나트륨 용액으로 장기를 촉촉하게 유지하십시오. 이 시점에서 12-20개의 생존 가능한 배아를 분류하고 얇은 유리 모세관에 넣습니다. 구강 피펫을 사용하여 먼저 작은 기포를 흡인한 다음 미세한 집게를 사용하여 배아를 흡인합니다.앰프 바로 상류에 있는 UCT를 부드럽게 잡고 30게이지 바늘을 사용하여 UCT 벽에 작은 구멍을 만듭니다. 로드된 모세관을 구멍에 삽입하고 기포가 모세관에서 변위된 것을 볼 때까지 배아를 앰프로 부드럽게 불어냅니다. 그런 다음 모세관을 제거합니다.즉시 생식 기관을 체강 안으로 다시 교체하고 단일 봉합사로 복막강을 닫습니다. 그런 다음 하나 또는 두 개의 9mm 상처 클립을 사용하여 피부를 닫습니다. 동물을 집 우리로 되돌리고 마취가 사라질 때까지 감독합니다.그런 다음 암컷을 2-3마리의 생쥐로 구성된 안정적인 사회 그룹에 수용하여 수술 후 첫 3일 동안 스트레스를 최소화하고, 디자이너 뉴클레아제로 표적으로 하는 마우스 게놈의 모든 메뚜기에 대해 식수에 DEF Falcon과 같은 진통제를 제공해야 합니다. PCR 기반 분석은 원하는 돌연변이 대립유전자를 보유한 창립 동물을 식별하도록 설계되었습니다. 첫 번째 예에서, 설립자는 꼬리 뉴클레아제 쌍의 미세주입에서 유래했습니다.마우스 프리온 단백질 유전자의 코팅 영역을 표적으로 하여 PCR 산물의 T 7 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하였다. T seven Endonuclease digestion assay는 돌연변이된 대립유전자와 야생형 대립유전자에서 생성된 PCR 산물의 DNA 가닥 사이의 hetero duplexes 형성에 의존합니다. 단일 창시자의 표적 게놈 영역 내에서 Talon에 의해 유도된 돌연변이 유발은 전장 PCR 산물 외에도 250 및 110 염기 쌍의 긴 소화 산물의 출현으로 밝혀졌습니다.대안적으로, 적절한 진단 제한 부위가 디자이너 뉴클레아제 쌍의 스페이서 영역 내에 위치하는 경우 PCR 산물은 제한 소화를 받을 수 있습니다. 두 번째 예에서 ZFN은 마우스 Rosa 26 유전자좌 중 하나인 인트로 내에 위치한 XPO 1 제한 사이트를 대상으로 합니다. 여기서 소화되지 않은 띠는 돌연변이의 존재를 나타냅니다.별표는 소화된 산물이 없다는 것을 의미하며, 이는 설립자가 표적 유전자의 두 대립유전자에 돌연변이를 가지고 있음을 강력하게 암시합니다. 이러한 소화되지 않은 PCR 산물의 클로닝 및 염기서열분석은 founder 마우스가 표적 대립유전자의 두 개 이상의 뚜렷한 변형을 보유할 수 있음을 보여줍니다. 야생형 염기서열이 없다는 것은 표적 유전자의 완전한 절제를 나타냅니다.이 비디오를 시청한 후에는 꼬리 뉴클레아제 설계, 꼬리 조립, 뉴클레아제 구조 및 이를 사용하여 직접 미세주입으로 돌연변이 마우스를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 아연, 손가락 핵 또는 CAS nine crispr와 같은 다른 종류의 디자이너 뉴클레아제와 함께 작동하도록 조정할 수 있습니다. 또한 뉴클레아제와 적절한 유전자 표적 주형의 동시 co 주입을 통해 상동 재조합에 의한 게놈 변형을 촉진할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

CompoZr 정의 아연 핑거 Nuclease (ZFN) 서비스는 사용자가 정의한 모든 현장에서 모든 유기체 또는 세포 라인의 정밀 게놈 수정을 가능하게합니다. 이 문서 CompoZr 정의 ZFN 서비스의 설계, 제조, 검증 및 구현을위한 프로세스를 설명합니다.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

난관 핵산 전달 을 통한 개선된 게놈 편집(I-GONAD) 방법의 효율성은 기증자 여성으로부터 접합체 수집을 하고 가성 임신 여성에게 이식해야 하는 기존 미세 주사와 비슷합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 염색체 6의 ROSA26 유전자좌에 도입하여 그 효과를 입증합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

조직 공학 실험 접근법

학습하세요 TALEN을 이용한 마우스 유전자 결핍 모델 생성 방법을 마우스 수정란에 미세주사하여 유전자 기능 연구에 활용합니다. 이 기술은 정밀 유전자 편집과 생물학적 메커니즘 규명에 필수적입니다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

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