디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

이 절차의 전반적인 목표는 디자이너 꼬리 뉴클레아제 또는 발톱의 도움으로 유전자가 결핍된 마우스를 빠르게 생성하는 것입니다. 이는 먼저 특정 탈론 쌍을 인코딩하는 DNA 구조를 설계하고 조립하여 수행되며, 이는 Talon mRNA를 생성하기 위한 체외 전사를 위한 템플릿 역할을 합니다. 절차의 다음 단계는 수정된 마우스 세포를 분리한 다음 T를 마이크로 주입하는 것입니다.마지막 단계는 주입된 세포를 유사 임신 위탁모에게 외과적으로 이식

그 결과로 생성된 F zero 자손은 종종 표적 유전자 기능의 상실로 이어지는 게놈 염기서열의 부위 특이적 결실을 자주 보여줍니다. 여기에 제시된 방법은 쥐의 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기본 접근 방식은 쥐 및 물고기와 같은 다른 모델 유기체에도 적용할 수 있습니다. 먼저 사이트의 TAL effector nucleotide targeter 웹사이트에 접속합니다.

TN targeter 프로그램을 선택하고 타겟 유전자의 염기서열을 붙여넣습니다. 이 프로토콜의 경우. 광고 유전자에서 사용할 수 있는 P-C-A-G-T 7가지 TALEN 발현 구조와 Golden Gate Talen 및 T effector 키트를 사용합니다.

Talen 조립품에 다른 구성 또는 조립품 키트를 사용하는 경우 최적의 스페이서 길이 및 테일 RV 수에 따라 설정이 다를 수 있으므로 사전 설정된 아키텍처 사용 설정에서 Miller Etal 2011 옵션을 선택합니다. 그런 다음 G 대체 탭에서 NN을 선택합니다. 이 프로그램은 이 목록에서 생성된 잠재적 대상 사이트가 포함된 텍스트 파일을 생성합니다.

필요한 Talen 쌍을 선택하고 Golden gate 어셈블리를 진행합니다. 이 프로토콜은 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬 5단위의 복강 내 주사를 사용하여 생후 4주에 C 57 BL 6 J 및 BDF 1개의 슈퍼 배란 10명의 기증자 암컷을 포함하여 가장 일반적으로 사용되는 실험실 마우스 균주에 작동합니다. 48 시간 후에 인간 융모성 성선 자극 호르몬 주입 메이트 직후 복강 내 주사에 의해 암컷에게 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 5 단위를 또한, 같은 날에 번식 연령 남성과 일대일로 암컷은 의사 임신 수양모를 준비합니다. 다른.

다음 날 아침, 암컷을 제물로 바치고 ucts를 해부하여 수정된 난모세포를 회수합니다. 그런 다음 난모 세포 클러치를 M 2 배지 밀리리터가 들어있는 장기 배양 접시에 풀어 놓습니다. M 2 배지에 cyte clutches가 들어있는 접시에 0.1 % 소 hyaluronidase 용액 10 마이크로 리터를 추가하여 모든 적운 세포를 제거합니다.

그런 다음 구강 피펫을 사용하여 M 2 배지를 2 회 또는 3 회 변경하여 배아를 세척하여 히알루로니다아제를 제거합니다. 아직 적운 세포에서 해리되지 않은 배아에 대해 히알루로니다아제 치료를 계속합니다. 분리된 배아는 마이크로 주입될 때까지 섭씨 37도의 M 16, 중간 온도와 5%의 이산화탄소에 보관할 수 있습니다.

각 꼬리의 마이크로리터당 10나노그램을 포함하는 100마이크로리터의 주입 용액을 준비합니다. 뉴클레아제, mRNA, 쌍 및 원심분리기를 30분, 000G에서 펠릿으로 만듭니다. 주사 바늘을 막을 수 있는 모든 입자.

그런 다음 믹스를 얼음 위에 보관하십시오. 이른 오후에 전핵 단계에서 난모세포를 주입할 계획을 세웁니다. 약 100개의 배아를 M 2 배지에 미네랄 오일 층 아래에 담그고 화성 DIC 광학 장치가 없는 도립 현미경에서 작업합니다.

20배 확대 아래에서 뚜렷한 전핵을 가진 cyte를 선택합니다. 난모세포의 분류는 빈 주입 모세관 부하를 사용하여 수행할 수 있으며, 주입 모세관은 1-2마이크로리터의 주입 용액과 함께 사용됩니다. 그런 다음 마이크로 주입 헤드에 부착합니다.

그런 다음 홀딩 모세관이 있는 선택한 cyte를 흡인하고 nuclease mRNA를 세포질에 얕게 주입합니다. 전핵과의 접촉을 피하십시오. 주입량은 낮게 유지되어야 합니다.

세포질 팽창의 첫 징후가 나타나면 바늘을 빼냅니다. 일반적으로 배아의 약 80-90%는 즉각적으로 생존하지 않고 생존해야 합니다. 주입되는 mRNA의 양을 늘리려면 사용 가능한 cyte의 미량 주입 후 용액을 더 농축하십시오.

구강 피펫을 사용하여 M 16 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 한 시간 동안 배아를 배양합니다. 그런 다음 살아남은 아이들을 가짜 임신 위탁모로 옮깁니다.

미세주입 전날, 3개월에서 6개월 된 CD 한 마리의 암컷 쥐를 VAs, 섹터화된 수컷과 짝짓기하여 가짜 임신을 유도합니다. 다음날 아침, 배아 수혜자로 사용할 투명한 마개가 있는 암컷을 선택합니다. 사용하지 않은 암컷은 3주 후에 가성 임신 상태로 돌아가며 나중에 다시 사용할 수 있습니다.

마취된 수양 어미 암컷을 복부의 따뜻한 표면 위에 놓습니다. 그런 다음 절개 부위에 70% 에탄올을 뿌려 소독합니다. 계획된 절개 부위에서 젖은 모발을 빗어냅니다.

이제 가위로 복막강을 자르고 자궁 뿔을 외부화합니다. 이 작업을 수행합니다. 난소에 부착된 지방 패드를 당기고 불독 클램프로 생식 기관을 고정시킵니다.

또한 0.9% 데운 염화나트륨 용액으로 장기를 촉촉하게 유지하십시오. 이 시점에서 12-20개의 생존 가능한 배아를 분류하고 얇은 유리 모세관에 넣습니다. 구강 피펫을 사용하여 먼저 작은 기포를 흡인한 다음 미세한 집게를 사용하여 배아를 흡

앰프 바로 상류에 있는 UCT를 부드럽게 잡고 30게이지 바늘을 사용하여 UCT 벽에 작은 구멍을 만듭니다. 로드된 모세관을 구멍에 삽입하고 기포가 모세관에서 변위된 것을 볼 때까지 배아를 앰프로 부드럽게 불어냅니다. 그런 다음 모세관을 제거합니다.

즉시 생식 기관을 체강 안으로 다시 교체하고 단일 봉합사로 복막강을 닫습니다. 그런 다음 하나 또는 두 개의 9mm 상처 클립을 사용하여 피부를 닫습니다. 동물을 집 우리로 되돌리고 마취가 사라질 때까지 감독합니다.

그런 다음 암컷을 2-3마리의 생쥐로 구성된 안정적인 사회 그룹에 수용하여 수술 후 첫 3일 동안 스트레스를 최소화하고, 디자이너 뉴클레아제로 표적으로 하는 마우스 게놈의 모든 메뚜기에 대해 식수에 DEF Falcon과 같은 진통제를 제공해야 합니다. PCR 기반 분석은 원하는 돌연변이 대립유전자를 보유한 창립 동물을 식별하도록 설계되었습니다. 첫 번째 예에서, 설립자는 꼬리 뉴클레아제 쌍의 미세주입에서 유래했습니다.

마우스 프리온 단백질 유전자의 코팅 영역을 표적으로 하여 PCR 산물의 T 7 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하였다. T seven Endonuclease digestion assay는 돌연변이된 대립유전자와 야생형 대립유전자에서 생성된 PCR 산물의 DNA 가닥 사이의 hetero duplexes 형성에 의존합니다. 단일 창시자의 표적 게놈 영역 내에서 Talon에 의해 유도된 돌연변이 유발은 전장 PCR 산물 외에도 250 및 110 염기 쌍의 긴 소화 산물의 출현으로 밝혀졌습니다.

대안적으로, 적절한 진단 제한 부위가 디자이너 뉴클레아제 쌍의 스페이서 영역 내에 위치하는 경우 PCR 산물은 제한 소화를 받을 수 있습니다. 두 번째 예에서 ZFN은 마우스 Rosa 26 유전자좌 중 하나인 인트로 내에 위치한 XPO 1 제한 사이트를 대상으로 합니다. 여기서 소화되지 않은 띠는 돌연변이의 존재를 나타냅니다.

별표는 소화된 산물이 없다는 것을 의미하며, 이는 설립자가 표적 유전자의 두 대립유전자에 돌연변이를 가지고 있음을 강력하게 암시합니다. 이러한 소화되지 않은 PCR 산물의 클로닝 및 염기서열분석은 founder 마우스가 표적 대립유전자의 두 개 이상의 뚜렷한 변형을 보유할 수 있음을 보여줍니다. 야생형 염기서열이 없다는 것은 표적 유전자의 완전한 절제를 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 꼬리 뉴클레아제 설계, 꼬리 조립, 뉴클레아제 구조 및 이를 사용하여 직접 미세주입으로 돌연변이 마우스를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 아연, 손가락 핵 또는 CAS nine crispr와 같은 다른 종류의 디자이너 뉴클레아제와 함께 작동하도록 조정할 수 있습니다. 또한 뉴클레아제와 적절한 유전자 표적 주형의 동시 co 주입을 통해 상동 재조합에 의한 게놈 변형을 촉진할 수 있습니다.