Name: 격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 격리된 심실 심근세포에서 sarcoplasmic reticulum 칼슘 저장량과 확장기 칼슘 제거 기능을 평가하는 방법을. Langendorff 관류 시스템과 칼슘 영상 기법을 활용하여 당뇨병과 심부전 등 병리 상태에서 세포내 칼슘 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (No. 81100159, Dongwu 라이, 81401147, Juhong 장), 의료 및 건강 과학 프로그램의 강성 (No. 201646246, Dongwu 라이), 건강 과학 및 항저우 시 (No. 2013A28, 딩 린)의 기술 계획.

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.
 1. 솔루션 준비 <ol><li>표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비.</li></ol>
 2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes 참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스템을 사용 하 여 앞에서 설명한 7 , 8 , , 9 10 , 11.
<li><ol>Langendroff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템 표준 Tyrode (NT) 솔루션, 36.5 ° C에서 온도 설정를 튜브에서 모든 기포를 제거.</li>
	<li>그리고 무게 chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주사 (ip)에 의해 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 5 분 후 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 응답을 평가 하 여 마 취 상태 확인</li>
	<li>수술 시저와 칼 프로세스 아래 복 부 구멍을 열고, 칼 프로세스 들어올린는 시저와 가슴을 열고. 심 낭을 제거, 약간 리프트 심장 곡선된 겸 자와, 대동맥 아치, 식별 및 대동맥의 루트에서가 위, 심장 차단.</li>
	<li>60 mm 접시에는 마음을 전송 하 고 NT 솔루션으로 그것을 씻어. 대동맥 두 마이크로 해 부 집게와 고 Langendorff 관류 정에 마운트 누른 다음 단단히 대동맥 수술 봉합을 사용 하 여 정 맥에 선. 
	참고: 숙련 된 연산자 15이이 프로세스를 완료할 수 있다 s.</li>
	<li>심장 관상 동맥의 순환 회복을 30 mL NT 솔루션 perfuse. 그런 다음 Ca 2 + 30 mL는 perfusate 전환-무료 Tyrode 솔루션 (10 mM 황소자리, 1 mg/mL BSA)는 심장 박동을 중지. 다음, 효소 소화의 콜라 A 격리 솔루션 (0.6 mg/mL)는 perfusate 전환. 
	참고: 당뇨병 쥐 없이 당뇨병 쥐, 또는 콜라 II와 실험에 대 한 실험에 대 한 사용 콜라 A.</li>
	<li>소화 20-25 분, 후 신속 하 게 변경 관류 솔루션 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션 추가 소화 중지. 다음, 집게로 마음을 잡고, 정에서 그것을 잘라 고 KB 솔루션을 포함 하는 35 mm 접시에는 마음을 배치 (표 1 참조).</li>
	<li>LV 벽 집게와가 위를 해 부. 심 방, 우 심 실 및 것 접합 영역을 잘라. 나머지 조직이 이다 라스베가스; KB 솔루션과 새로운 35 mm 접시에 그것을 전송. 작은 조각으로 LV 조직 말하다.</li>
	<li>부드럽게 필터링 된 플라스틱 스 포 이트와 조각 플라스틱 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 중단.</li>
	<li>150 µ m 조리개 스테인레스 스틸 필터와 15 mL 원심 분리기 튜브에 셀 필터링. 30 s 및 삭제는 상쾌한 150 x g에서 원심. 다시 10 mL KB 솔루션, 무료 myocytes 정착 6 분에 대 한 일시 중단 상쾌한, 삭제 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 펠 릿을 중단. 
	참고: 모든 단계 솔루션 100% O 2 기름에 36 ° C에서 수행 했다.</li>
</ol> 3. 칼슘 Reintroduction <ol><li>KB 솔루션에서 20 분 동안 정착 후 상쾌한, 삭제 하 고 다시 칼슘 reintroduction 솔루션 A myocytes를 일시 중지 (0.3 m m 캘리포니아 2 +, 4.5 mL 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션, 1.5 mL NT 솔루션) 10 분에 대 한</li>
	<li>칼슘 reintroduction 솔루션 B 위의 절차를 반복 (0.3 m m 캘리포니아 2 +, 3 mL 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션, 3 mL NT 솔루션).</li>
	<li>NT 솔루션 (1.2 m m 캘리포니아 2 +) 가능한 myocytes 정화 위의 절차를 반복 합니다. 이 솔루션에서 격리 된 LV myocytes를 저장 하 고 4-6 헤 내 공부</li>
</ol> 4. 설정 최대의 관류 시스템 <ol><li>챔버 관류 ( 그림 1A)에 대 한 NT 솔루션 유입 튜브를 연결.</li>
	<li>대상 myocyte의 바늘 관류에 대 한 연결 (예를 들어, 관류 연필, 연필 이제부터 하 라고) 멀티 배럴 매니폴드 팁는 micromanipulator에 고정, 관류 시스템 제어 밸브에. 연필 ( 그림 1A)의 각 열에 NT 솔루션 및 10mm 카페인 솔루션 추가.</li>
	<li>어떤 공기 방울을 공기 막힘을 피하기 위해 튜브에 대피.</li>
	<li>물방울 개수 미크론 팁에서 10 연필 s, 수동으로 조정 흐름 레 귤 레이 터 3 물방울/10 미의 대략적인 속도에서 흐름의 속도 유지 하 고</li>
</ol> 5. 측정 세포내 캘리포니아 2 + 변이 및 Sarcomere 단축 7 , , 8 9 <ol><li>슬라이드에서 피 펫 10 µ L 세포 현 탁 액 현미경, 셀 카운터로 핸드폰 번호를 계산 하 고 밀도 계산. 50, 000 셀/mL의 대략 농도에 myocytes 희석.</li>
	<li>추가 Fura-2 acetoxymethyl (오전) 주식 (칼슘 민감한 염료) 2 µ M. 최종 농도가지고 myocytes의 1 mL 정지로 실 온에서 20 분 동안 어둠 속에서 유지.</li>
	<li>30 s, 그리고 다시 중단 NT 솔루션 cardiomyocytes 2 번에 대 한 150 g에서 원심 분리기.</li>
	<li>차례 빛와 어둠 속에서 셀을 계속. 15 분 동안 관류 챔버에 myocytes 장소. 그런 다음 NT 솔루션 챔버 관류 (1.5 mL/min)를 시작 합니다. 5 분에 대 한 자극 (파 기간 4.0 ms, 펄스 진폭 8.0 V)를 사용 하 여 1 Hz 필드 자극에 myocytes 속도</li>
	<li>좋은 모양 myocyte 선택 (막대 모양, 가장자리, 샤 프와 크로스 강선 취소) 및 현미경 대물 렌즈 10x에서 안정적인 자극된 경련 (자발적 수축). 다음, 40 x, 현미경 배율 변경 하 고 수평 위치에 있는 myocyte를 유지 수 있는 CCD 카메라 방향 회전.</li>
	<li>셀 프레임 어댑터를 조정 하 여 단일 myocyte 프레임. 배경 지우기 확인.</li>
	<li>340 또는 380 nm 파장 여기 필터와 크 세 논 램프에서 방출 되는 빛에 myocytes 고 40 x 목표를 통해 myocytes 이미지. 510에서 형광 신호를 감지 nm. 한편,는 myocytes의 sarcomere 길이 변화 및 소프트에 지 모듈을 사용 하 여 동시에 녹화.</li>
	듀얼-여기 형광 광 전 증폭 관 시스템의 기록 <li>형광 칼슘 이미징 시스템의 녹음 프로그램 실행, 클릭 합니다 &#34; 파일/새 파일 &#34; 새로운 기록 파일을 만들고 클릭 하는 &#34; 시작 &#34;를 동기적으로 형광 및 sarcomere 버튼.</li>
</ol> 6. SR 캘리포니아 2 + 예약 및 확장기 캘리포니아 2 + 제거 기능 7 , , 8 9 평가 <ol><li>Interlink는 &#34; 보조 아웃 &#34;에 포트 와 자극 기는 &#34; 아날로그에 &#34; 밸브 제어 시스템에 포트 (예를 들어, 밸브 사령관, 재료의 표 참조) BNC 케이블 (TTL 신호를 동기화)을 여.</li>
	<li>미리 관류 밸브를 자동으로 앞에서 설명한 8 , 9; 전환 프로그램 작업에 대 한 자세한 내용은 다음과 같습니다.
	<ol><li>프리셋 밸브에서 매개 변수 표 2에 의하여 소프트웨어를 제어 하 고 클릭에 &#34; 다운로드 &#34; 다운로드 순서 단추를 프로그램에 로드 된. 클릭은 &#34; Trigg어 &#34; 트리거 기능을 사용 하도록 단추. 
		참고: 밸브 제어 시스템 TTL 신호를 받은 후 시퀀스를 실행할 수 있습니다.</li>
		<li>미리 시퀀스 모드를 자극 하 고 표 3에 의하여 매개 변수 설정.</li>
	</ol></li> <li>설정에서 자극 기 &#34; s 1 단계 &#34; LV 페이스를 myocytes에서 1 Hz. NT 솔루션 1.5 mL/min의 속도로 바늘 관류 시작. 
	참고: 챔버 관류 보다 바늘 스트림의 속도 이므로 바늘 스트림의 빛 굴절은 다릅니다 챔버 관류의 빛 굴절. 빛 굴절의 차이 대상 myocyte를 포위 하는 효과적인 바늘 관류의 범위를 나타냅니다.</li>
	<li>(순서로 다운스트림 업스트림 하의), 낮은 전력 미세한 보기 아래 대상 myocyte를 선택 하 고 있는지 확인 하십시오 그것은 연필의 마이크로 팁에 의해 도달 될 수 있다. 400 x 현미경 배율을 변경 합니다. CCD 카메라 방향을 수평 위치에 있는 myocyte를 계속 회전 합니다. 셀 프레임 어댑터는 myocytes 채웁니다 적당 한 창 아래 사각형 조리개를 조정 합니다. 최소한의 배경; 인지 확인 다른 myocytes 또는이 창에서 죽은 세포 파편을 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>Micromanipulator에 고정 하는 연필의 위치를 조정 하 고 신중 하 게 마이크로 팁 현미경 배율 x 400 미만 대상 myocyte 비전 필드의 반지름의 거리에서 장소.</li>
	<li>주로 대상 myocyte를 커버 하는 myocyte 수 없습니다 휩 쓸 바늘 흐름 확인을 바늘 스트림 범위 조정.</li>
	<li>후 60 s 기본 자극 커서를 롤, 속도 &#34; d 2 단계 &#34;. 
	참고: 프로토콜의 나머지 자극 기 밸브 제어 시스템에 의해 자동으로 실행 될 것입니다. 위의 설정에 따라 프로토콜 수 자동으로 실행 될 그림 2A, 1 Hz 60 NT 솔루션으로 서 기본에서 s. 성 고 2 지연 일시 중지 s, 10mm 카페인 관류 15로 빠르게 전환 s (기능 SR에서 캘리포니아 2 + 스토리지 출시), 다음 NT 솔루션으로 다시 전환 하는 고.</li>
	<li>개별 myocytes의 배경 형광 검출 기록의 끝에. 클릭은 &#34; 일시 중지 &#34; 근처 빈 영역에 미세한 보기 이동 파일 녹음, 일시 정지 버튼. 클릭은 &#34; 기록 &#34; 초, 녹화 재개 버튼 및 숫자 340 및 380 nm 강도 값 배경 보정에 대 한 기록.</li>
	<li>오픈는 &#34; 작업/정 &#34;에 값을 입력 하 고 대화 상자는 &#34; 배경 &#34; 형성, 각각, 소프트웨어 백그라운드를 빼서 Fura 2 비율 값을 수정할 수 있습니다.</li>
</ol> 7. 데이터 분석 9 <ol><li>칼슘 과도 및 기본 서 성 단계에서 단축 sarcomere의 측정, 평균 트 위치 펄스, 고 칼슘 과도의 시간 상수 같은 동적 매개 변수 분석 칼슘 과도 감퇴 (타우 1 Hz) 자동으로 소프트웨어를 사용 하 여. 
	참고: 소프트웨어 부패 세그먼트에 잘 맞지 않는, 수동 모노 지 수 곡선 맞춤에 대 한 감소 추적 내보냅니다.</li>
	<li>카페인 유발 칼슘 펄스에 대 한 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 파도 펄스를 선택. 신호 방해, 비정상적인 펄스, 또는 멀리 미드웨이 흘러 그 셀 제외.</li>
	<li>카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인, 미술관 2 + 예비에의 인덱스)의 진폭을 측정.</li>
	<li>모노 지 수 곡선 피팅 (10 s 내구) 수동으로 소프트웨어 ( 그림 2C)에서 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 붕괴 시간 상수 얻을.</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
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<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아2 + 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아2 + 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca2 + SR에서 발표 반영 SR Ca2 + 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca2 + 예약에 따라 SR 캘리포니아2 + 재흡수, SR의 캘리포니아2 + 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장12,,1314동안. 우리의 실험에서 10 mM 카페인의 신속한 응용 프로그램 총 캘리포니아2 + 출시와 RyR 채널을 개방 하 여 SR에 캘리포니아2 + 재흡수를 방지 유도 목적 이다. 따라서, 카페인 유발 Ca<s...

세포내 칼슘 ([캘리포니아2 +]나) 재활용 cardiomyocytes1에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca2 + 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아2 + 2 + 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아2 + myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아2 +를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아2 + -ATPase 2 (SERCA2)와 나+-캘리포니아2 + 교환기 (NCX)2를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.
심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포니아2 + , 수축에 대 한 저수지 역할을 하 고 reabsorbs 세포내 캘리포니아2 + 휴식 중. SR 캘리포니아2 + 예약 비트 사용할 수 심장 수축에 대 한 결정 이다. 한편, 세포내 캘리포니아2 + 의 제거가 심장 심장에 대 한 중요 합니다. 일부 병 태 생리 조건 등 당뇨병과 심장 마비, 장애인된 캘리포니아2 + 클리어런스 우울 SR 캘리포니아2 + cardiomyocytes에 저장소 관련 되어있을 수 있습니다 심장 부전2,3 과정 ,4.
SR 캘리포니아2 + 릴리스 및 cardiomyocytes에 확장기 Ca2 + 제거 측정, 널리 사용 되는 방법은 두 가지: 패치 클램프5,6, 카페인 유발 Ca 기반으로 NCX 전류의 무결성 2 + 캘리포니아2 + 형광 이미징7,,89에 따라 펄스. 전 접근 그는 캘리포니아2 + SR에서 발표는 크게 셀에서에 의해 펌핑 NCX 사실에 따라 달라 집니다. 그러나,이 접근의 고급 장비와 숙련 된 작업의 요구에 의해 제한 됩니다. 현재 연구에서 우리가 SR 캘리포니아2 + 예비 그리고 캘리포니아2 + 제거 myocytes에서 카페인 유발 Ca2 + 펄스는 캘리포니아2 + 형광 이미징 시스템에 따라 측정 하 여 평가 하는 편리한 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 세포내 캘리포니아2 + 형광 Fura-2로 표시 됩니다. Interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템, 선물이 관류를 전환 하 고 시스템을 자동으로 속도 위한 프로그램. 10mm 카페인 빠르게는 미스터에 총 캘리포니아2 + 출시를 유도 하기 위해 고용 되었다 지 수 감퇴 시간 상수 (타우) 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 확장기 캘리포니아2 + 제거 SERCA NCX의 기여를 적절 하 게 반영 하는 피팅, 모노 지 수 곡선에서 얻은 했다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>알파 Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>알파 Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>알파 Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>알파 Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>알파 Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>알파 Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>알파 Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>카페인</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올</td><td>림푸스 올림푸스 IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff 시스템</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 링크</td><td></td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>밸브 제어 중력 관류 시스템</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>밸브 커맨더 소프트웨어</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>정밀 유량 조절기</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold 관류 연필</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>미크론 탈착식 팁</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um id.</td><td></td></tr><tr><td>형광 측정 및 세포 치수 측정 시스템</td><td>IonOptix</td><td>하이퍼스위치</td><td></td></tr><tr><td>기록 소프트웨어</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>자극기</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-dawley 쥐</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

격리 된 심 실 cardiomyocytes에 sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca2 + 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아2 + 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca2 + 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아2 + 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca2 + 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관2 + 예약 및 확장기 Ca2 + 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아2 + 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아2 + 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아2 +-ATPase (SERCA) 및 Na+-캘리포니아2 + 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 &#62; 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 70-80%입니다. 막대 모양, 명확한 강선 및 안정적인 수축만 myocytes 기록 (그림 1B)에 대 한 선정 됐다. 그림 1A에서 같이, 우리 챔버 관류와 바늘 관류 myocytes에 대 한 설정 합니다. 관류 밸브 및 시스템 속도 자...

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

이 절차의 전반적인 목적은 분리된 심근세포에서 근소포체 칼슘 저장량과 세포 내 이완기 칼슘 제거 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병 및 심부전과 같은 일부 병태생리학적 조건 하에서 세포 내 칼슘 처리 기전에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편의성이 높으며 기술 및 장비의 제약이 적다는 점입니다.본 절차를 시작하려면 Langendorff 관류 시스템을 설정하십시오. 관류 시스템을 NT 용액으로 채우고 온도를 36.5 °C로 설정한 후, 튜브 내의 기포를 모두 제거하십시오. 다음으로, 검상돌기 아래의 복강을 열고 검상돌기를 들어 올린 뒤 가위로 흉강을 절개하십시오.그 다음 심낭을 제거하고, 곡선 핀셋으로 심장을 살짝 들어 올려 대동맥궁을 확인한 후 대동맥 뿌리 부분에서 심장을 절단합니다. 그 후 심장을 60 millimeter 접시로 옮기고 NT 용액으로 세척합니다. 두 개의 미세 해부 핀셋으로 대동맥을 잡고 Langendorff 관류 캐뉼라에 장착합니다.그 다음 외과용 봉합사를 사용하여 대동맥을 캐뉼라에 단단히 결찰합니다. 이어서 30 milliliters의 NT solution으로 심장을 관류하여 관상동맥의 혈액 순환을 회복시킵니다. 그런 다음 관류액을 30 milliliters의 칼슘 제거 Tyrode solution으로 교체하여 심장 박동을 중단시킵니다.그 후, 효소 소화를 위해 관류액을 collagenase A 분리 용액으로 교체합니다. 20~25분 동안 소화시킨 후, 추가 소화를 중단하기 위해 관류 용액을 칼슘 제거 Tyrode 용액으로 빠르게 변경합니다. 그런 다음 포셉으로 심장을 잡고 캐뉼라에서 절단하여 KB 용액이 담긴 35 millimeter 디시에 심장을 넣습니다.그다음, 좌심실 부위를 찾습니다. 심방, 우심실 및 방실 접합 부위를 절제합니다. 그런 다음 좌심실을 KB 용액이 담긴 새로운 35 millimeter 디쉬로 옮기고 조직을 작은 조각으로 잘게 다집니다.필터가 달린 플라스틱 스포이드를 사용하여 조각들을 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 150 micron 공극의 스테인리스 스틸 필터로 세포를 여과한 후 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 후, 샘플을 150 ×g에서 30초 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.심근세포를 10 milliliters의 KB 용액에 재현탁하고 6분 동안 침전시킵니다. 그 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 10 milliliters의 KB 용액에 넣어 20분 동안 재현탁합니다. KB 용액에서 20분 동안 침전시킨 후, 상층액을 제거하고 심근세포를 칼슘 재도입 용액 A로 재현탁합니다. 칼슘 도입 용액 B를 사용하여 위의 과정을 반복합니다. 그 다음, 가용한 심근세포를 정제하기 위해 NT 용액으로 위의 과정을 다시 반복합니다.분리된 LV 심근세포를 이 용액에 보관하고 4~6시간 이내에 연구를 수행하십시오. 그 다음, 펜슬의 각 컬럼에 NT 용액과 10 millimolar 카페인 용액을 추가합니다. 공기 차단으로 인한 문제를 방지하기 위해 튜브 내의 기포를 모두 제거하십시오.이제 챔버 관류를 위해 유입 튜브를 NT 용액과 연결하십시오. 표적 심근세포의 니들 관류를 위해, 멀티 배럴 매니폴드 팁을 밸브 제어 관류 시스템에 연결하십시오. 그 다음, 10초 동안 펜슬의 마이크론 팁에서 떨어지는 방울 수를 세고, 유속이 10초당 약 3방울의 속도로 유지되도록 유량 조절기를 수동으로 조정하십시오.이 절차에서는, fura-2-acetoxymethyl 스톡을 1 mL의 심근세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 2 µM이 되도록 합니다. 이를 실온의 암소에서 20분 동안 유지합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 NT 용액으로 심근세포를 두 번 재현탁합니다.다음으로, 조명을 끄고 세포를 암소에 보관하십시오. NT 용액으로 관류하기 전, 근세포를 관류 챔버에 15분 동안 둡니다. 자극기를 사용하여 1Hz 전기장 자극으로 5분 동안 근세포를 페이싱합니다.이제 10배 현미경 대물렌즈 하에서 모양이 좋고 자극 시 수축이 안정적인 근세포를 선택하십시오. 'File'의 'New File'을 클릭하여 새로운 기록 파일을 생성합니다. 다음으로, 현미경 배율을 40배로 변경하고 CCD 카메라의 방향을 회전시켜 근세포가 수평 상태를 유지하도록 합니다.그 다음, 세포 프레이밍 어댑터를 조정하여 단일 심근세포를 프레임에 맞추고 배경이 깨끗한지 확인합니다. 이어서 340 또는 380 nanometer 파장의 여기 필터가 장착된 Xenon 램프에서 방출되는 빛에 심근세포를 노출시키고, 40X 대물렌즈를 통해 심근세포를 촬영합니다. 510 nanometer에서 형광 신호를 검출합니다.이중 여기 형광 광증배관 시스템을 사용하여 형광과 근절 길이를 동기적으로 기록하려면 시작 버튼을 누르십시오. 근세포의 근절 길이 변화를 관찰하고 소프트 엣지 모듈을 사용하여 동시에 기록하십시오. 이 과정에서 자극기의 aux out 포트와 밸브 제어 시스템의 아날로그 입력단을 BNC 케이블로 연결하십시오.다음으로, 밸브 제어 소프트웨어에서 파라미터를 사전 설정하고, 다운로드 버튼을 클릭하여 프로그램에 로드된 시퀀스를 다운로드한 후, 트리거 버튼을 클릭하여 트리거 기능을 활성화합니다. 그런 다음 자극기를 시퀀스 모드로 사전 설정하고 파라미터를 설정합니다. 이후, 자극기를 S1 단계로 설정하여 LV 심근세포를 1 Hz로 페이싱합니다.NT 용액을 사용하여 분당 1.5 milliliters의 속도로 니들 관류를 시작합니다. 저배율 현미경 시야에서 표적 심근세포를 선택하고, 펜슬의 마이크로팁이 해당 세포에 도달할 수 있는지 확인합니다. 그 후, 현미경 배율을 400X로 변경합니다.심근세포가 수평 위치에 유지되도록 CCD 카메라의 방향을 회전시킵니다. 그런 다음 셀 프레이밍 어댑터 아래의 직사각형 조리개를 조절하여 심근세포가 가득 차는 적절한 창을 설정합니다. 다음으로 마이크로 매니퓰레이터에 고정된 펜슬의 위치를 조절하고, 마이크로팁을 대상 심근세포로부터 시야 반경 거리만큼 조심스럽게 배치합니다.그 후 니들 스트림 범위를 조정하여 표적 심근세포를 대부분 포함하도록 하고, 심근세포가 니들 흐름에 의해 휩쓸려 내려가지 않는지 확인합니다. 60초간의 기본 페이싱 후, 스티뮬레이터 커서를 D2 단계로 이동시킵니다. 이후의 프로토콜은 스티뮬레이터와 밸브 커맨더에 의해 자동으로 실행됩니다.일시정지 버튼을 클릭하여 파일 기록을 중단하고 현미경 시야를 인근의 빈 영역으로 이동하십시오. 그런 다음 기록 버튼을 클릭하여 수 초 동안 다시 기록을 시작하고, 배경 보정을 위해 340 및 380 nm의 수치 강도 값을 기록하십시오. 그 후, Operation Constant 대화 상자를 열고 배경 양식에 해당 값들을 입력하십시오.해당 소프트웨어는 배경값을 차감하여 fura-2 비율 값을 보정할 수 있습니다. 여기에는 관류 밸브와 페이싱 시스템을 자동으로 전환하는 프로토콜의 예시가 나와 있습니다. 이 그림은 당뇨병 군과 Sprague Dawley 군의 1Hz 자극 수축 시 근소포체 칼슘 저장량과 분획 칼슘 방출량의 통계값을 보여줍니다.당뇨 그룹은 Sprague Dawley 그룹보다 SR 칼슘 저장량과 SR 분획 칼슘 방출량이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다. 여기서 소프트웨어 패널은 카페인 유도 칼슘 펄스의 감쇠 시간 상수에 대해 수동으로 단일 지수 곡선 피팅을 수행한 모습을 보여줍니다. 이 막대 그래프들은 당뇨 그룹과 Sprague Dawley 그룹 간의 Tau-caffeine 및 Tau-1Hz/Tau-caffeine 값을 비교합니다.당뇨군은 Sprague Dawley 군에 비해 Tau-caffeine 및 Tau-1Hz/Tau-caffeine 값이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 본 절차는 심장 기능 장애의 세포 내 칼슘 조절 메커니즘을 탐구할 수 있는 실행 가능하고 편리한 도구를 제공합니다. 이 절차를 수행할 때, 디쉬에 대한 심근세포의 안정적인 부착, 채널 스위치의 밀폐, 니들 관류의 유속 조절, 그리고 니들 팁과 표적 심근세포 사이의 적절한 거리 유지와 같은 몇 가지 핵심 사항에 유의해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

이 논문은 쥐의 심장에서 분리된 심장 근세포에서 수축하는 동안 myofilament Ca2+ 감도의 변화를 평가하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장 전기생리학, 수축기/이완기 세포질 Ca2+ 수치 및 수축/이완과 함께 이 측정은 건강한 심장과 질병이 있는 심장에서 심장 흥분-수축 결합을 매개하는 메커니즘을 뒷받침하는 데 필수적입니다.

Myofilament 칼슘의 평가<sup&gt; 2 +</sup&gt; 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(Ca 2+) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석

이 프로토콜은 수축하는 림프관에서 세포질, 유리 칼슘[Ca2+]i 및 혈관 직경을 동시에 측정한 다음 절대 Ca2+ 농도와 수축성/리듬 매개변수를 계산하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 조건에서 Ca2+ 및 수축 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ 및 해당 수축성의 실시간 평가

학습하세요 격리된 심실 심근세포에서 sarcoplasmic reticulum 칼슘 저장량과 확장기 칼슘 제거 기능을 평가하는 방법을. Langendorff 관류 시스템과 칼슘 영상 기법을 활용하여 당뇨병과 심부전 등 병리 상태에서 세포내 칼슘 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

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