격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

이 절차의 전반적인 목표는 고립된 심근세포에서 근형성 망상 칼슘 예비력 및 세포 내 이완기 칼슘 제거 기능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 당뇨병 및 심부전과 같은 일부 병태생리학적 조건에서 세포 내 칼슘 처리 메커니즘에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 편리함이며 기술과 장비의 제약이 적다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 Langendorff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템에 NT 용액을 채우고 온도를 섭씨 36.5도로 설정하고 튜브의 기포를 제거합니다. 다음으로, xiphoid process에서 복강을 열고 xiphoid process를 들어 올린 다음 가위로 가슴을 엽

그런 다음 심낭을 제거하고 구부러진 겸자로 심장을 약간 들어 올리고 대동맥궁을 확인하고 대동맥 뿌리에서 심장을 잘라냅니다. 그 후 심장을 60mm 접시에 옮기고 NT 용액으로 씻으십시오. 두 개의 마이크로 절개 겸자로 대동맥을 잡고 Langendorff 관류 캐뉼라에 장착합니다.

그런 다음 외과적 봉합사를 사용하여 대동맥을 캐뉼라에 단단히 접합합니다. 그런 다음 관상 동맥의 순환을 회복하기 위해 30ml의 NT 용액을 심장에 관류합니다. 그런 다음 관류액을 칼슘이 없는 티로드 용액 30ml로 전환하여 심장 박동을 멈춥니다.

그 후, 효소 분해를 위해 퍼퓨세이트를 콜라겐분해효소 A 분리 용액으로 전환하십시오. 20-25분 동안 소화한 후 관류 용액을 칼슘이 없는 티로드 용액으로 빠르게 변경하여 더 이상의 소화를 중지하십시오. 그런 다음 집게로 심장을 잡고 캐뉼라에서 잘라낸 다음 KB 용액이 들어 있는 35mm 접시에 심장을 놓습니다.

그런 다음 좌심실 부위를 찾습니다. 심방, 우심실 및 방실 접합 부위를 절단합니다. 그런 다음 좌심실을 KB 용액이 담긴 새 35mm 접시에 옮기고 조직을 작은 조각으로 다집니다.

여과된 플라스틱 스포이드로 조각을 부드럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 150미크론 구경의 스테인리스강 필터로 셀을 여과하고 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그 후, 샘플을 150 회 g에서 30 초 동안 원심 분리하고 상층액을 버립니다.

10ml의 KB 용액에 근세포를 재현탁시키고 6분 동안 가라앉힙니다. 그 후, 상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 KB 용액에 20분 동안 재현탁합니다. KB 용액에 20분 동안 침전시킨 후 상층액을 버리고 칼슘 재도입 용액 A로 근세포를 재현탁합니다.칼슘 도입 용액으로 위의 절차를 반복한 다음 B.그런 다음 NT 용액으로 위의 절차를 반복하여 사용 가능한 근세포를 정제합니다.

분리된 LV 근세포를 이 용액에 보관하고 4-6시간 이내에 연구합니다. 그런 다음 NT 용액과 10 밀리 몰 카페인 용액을 연필의 각 열에 넣으십시오. 공기 막힘을 방지하기 위해 튜브의 기포를 배출하십시오.

이제 챔버 관류를 위해 유입 튜브를 NT 용액에 연결합니다. 표적 근세포의 바늘 관류를 위해 다중 배럴 매니폴드 팁을 밸브 제어 관류 시스템에 연결합니다. 그런 다음 연필의 미크론 끝에서 물방울 수를 10초 동안 세고 유량 조절기를 수동으로 조정하여 유량 속도를 10초당 3번의 대략적인 속도로 유지합니다.

이 절차에서 fura-2-acetoxymethyl 스톡을 1ml의 근세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도를 2마이크로몰로 만듭니다. 실온에서 20분 동안 어두운 곳에 보관하십시오. 그 후, 상층액을 버리고 NT 용액으로 심근세포를 2회 재현탁합니다.

그런 다음 조명을 끄고 셀을 어두운 곳에 두십시오. NT 용액으로 관류하기 전에 관류 챔버에 근세포를 15분 동안 놓습니다. 자극기를 사용하여 5분 동안 1헤르츠의 자기장 자극으로 근세포의 페이스를 조절합니다.

이제 10X 현미경 대물렌즈 아래에서 모양이 좋고 안정적인 자극된 경련을 가진 근세포를 선택합니다. 파일 새 파일을 클릭하여 새 녹음 파일을 만듭니다. 그런 다음 현미경 배율을 40X로 변경하고 CCD 카메라 방향을 회전하여 근세포를 수평 위치로 유지합니다.

그런 다음 cell framing adapter를 조정하여 단일 myocyte를 구성하고 배경이 깨끗한지 확인합니다. 그런 다음 340 또는 380 나노미터 파장의 여기 필터가 있는 제논 램프에서 방출되는 빛에 근세포를 노출시키고 40X 대물렌즈를 통해 근세포를 이미지화합니다. 510나노미터에서 형광 신호를 감지합니다.

시작 버튼을 클릭하면 Dual Excitation Fluorescence Photomultiplier System을 사용하여 형광 및 sarcomere 길이를 동시에 기록할 수 있습니다. 근세포의 sarcomere 길이 변화를 기록하고 동시에 soft edge 모듈을 사용하여 기록합니다. 이 절차에서는 BNC 케이블로 자극기의 aux out 포트를 밸브 제어 시스템의 아날로그 가져오기와 연결합니다.

그런 다음 밸브 제어 소프트웨어에서 매개변수를 미리 설정하고 다운로드 버튼을 클릭하여 프로그램에 로드된 시퀀스를 다운로드하고 트리거 버튼을 클릭하여 트리거 기능을 활성화합니다. 그런 다음 자극기를 시퀀스 모드로 사전 설정하고 매개변수를 설정합니다. 그 후, 자극기를 S1 단계로 설정하여 좌심낭 근세포를 1헤르츠로 페이스를 조절합니다.

NT 용액으로 분당 1.5밀리리터의 속도로 바늘 관류를 시작합니다. 저전력 현미경 보기에서 대상 근세포를 선택하고 연필의 마이크로팁으로 도달할 수 있는지 확인합니다. 그런 다음 현미경 배율을 400X로 변경합니다.

CCD 카메라 방향을 회전하여 근세포를 수평 위치로 유지합니다. 그런 다음 세포 프레이밍 어댑터 아래의 직사각형 조리개를 근세포로 채워지는 적절한 창으로 조정합니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터에 고정된 연필의 위치를 조정하고 시야 반경에서 대상 근세포까지의 거리에 마이크로 팁을 조심스럽게 놓습니다.

그런 다음 표적 근세포를 대부분 덮도록 바늘 흐름 범위를 조정하고 근세포가 바늘 흐름에 의해 휩쓸려 가지 않도록 합니다. 60초 기본 페이싱 후 자극기 커서를 D2 단계로 굴립니다. 프로토콜의 나머지 부분은 자극기와 밸브 커맨더에 의해 자동으로 실행됩니다.

일시 중지 버튼을 클릭하여 파일 녹음을 일시 중지하고 현미경 보기를 근처의 빈 공간으로 이동합니다. 그런 다음 녹음 버튼을 클릭하여 초 동안 녹음을 다시 시작하고 배경 보정을 위해 숫자 340 및 380 나노미터 강도 값을 기록합니다. 그런 다음 Operation Constant 대화 상자를 열고 배경 양식에 값을 채웁니다.

소프트웨어는 배경을 빼서 fura-2 비율 값을 수정할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 관류 밸브와 페이싱 시스템을 자동으로 전환하기 위한 프로토콜의 그림입니다. 이 그림은 당뇨병 환자와 Sprague Dawley 그룹에서 1헤르츠 자극 경련에 대한 sarcoplasmic reticulum calcium reserve 및 fractional calcium release의 통계 값을 보여줍니다.

당뇨병 그룹은 Sprague Dawley 그룹보다 SR 칼슘 보유량과 SR 분획 칼슘 방출이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 여기에서 소프트웨어 패널은 카페인 유도 칼슘 펄스의 감쇠 시간 상수에 대한 수동 모노 지수 곡선 피팅을 보여줍니다. 이 막대 그래프는 당뇨병 환자와 Sprague Dawley 그룹 간의 Tau-caffeine과 Tau-1Hz/Tau-caffeine을 비교합니다.

당뇨병 그룹은 Sprague Dawley 그룹보다 타우-카페인과 타우-1Hz/타우-카페인 수치가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 이 절차는 심장 기능 장애의 세포 내 칼슘 처리 메커니즘을 탐구할 수 있는 실현 가능하고 편리한 도구를 제공합니다. 이 절차를 시도하는 동안 근세포가 접시에 안정적으로 부착되고, 채널 스위치를 감싸고, 바늘 관류의 유속을 제어하고, 바늘 끝과 표적 근세포 사이의 적절한 거리를 제어하는 등 주목해야 할 몇 가지 핵심 사항이 있습니다.