E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

이 프로토콜의 주요 목표는 E.coli O157:H7과 같은 박테리아 오염 물질을 검출할 수 있는 이중 모드 나노 센서를 설계하고 합성하는 것입니다. 자기 형광 나노 센서는 2단계 절차를 통해 산화철 나노 입자를 기능화하여 합성됩니다. 첫째, 표적 항체가 나노 입자의 표면에 접합됩니다.

그런 다음 형광 염료가 코딩에 로드됩니다. 이러한 양식의 페어링을 통해 저농도 용액과 고농도 용액 모두에서 박테리아 오염 물질을 빠르고 민감하게 검출할 수 있습니다. 소량의 박테리아가 있는 경우, 나노 센서는 공액 항체의 표적으로 하기 때문에 박테리아 주위를 맴돌 것입니다.

이 떼는 나노 센서 자기 코어와 주변 물 양성자의 상호 작용을 변경하여 자기 이완 값의 변화를 민감하게 감지할 수 있습니다. 용액 내 박테리아 오염 물질의 농도가 증가함에 따라 스벌링(swarming)이 감소하고 자기 양식(magnetic modality)의 오염 정량화 능력이 감소합니다. 그러나 박테리아 농도가 증가함에 따라 바이오 나노 센서의 형광 제출도 증가합니다.

이러한 이유로 자기 양식과 형광 양식의 쌍이 중요합니다. 이 조합을 통해 몇 분 내에 E.coli O157:H7의 집락 형성 단위를 하나만 검출할 수 있었습니다. 자기 형광 나노 센서 시스템의 첫 번째 단계는 철 염화물 및 염화 제2철로 구성된 철염 용액을 준비하는 것입니다.

다리미는 나노 센서에 자기 코어를 제공하여 자기 이완 플랫폼에 적응할 수 있도록 합니다. 필요한 추가 솔루션은 폴리아크릴산과 수산화암모늄입니다. 염산은 철염 용액에 도입 된 다음 와류하면서 수산화 암모늄 용액에 첨가됩니다.

마지막으로 폴리 아크릴산 용액을 첨가하고, 반응이 계속되는 동안 생성 된 혼합물을 추가로 한 시간 동안 와류로 분출합니다. 생성된 용액은 더 큰 분자를 침전시키고 100나노미터 크기의 나노 입자를 분리하기 위해 원심분리됩니다. 그런 다음 용액을 밤새 투석하여 정제합니다.

다음 단계는 새로 합성된 철산 나노입자의 폴리아크릴산 코딩에 표적 항체를 접합하는 것입니다. 필요한 재료에는 MES 완충액, EDC, NHS 및 선택한 항체가 포함됩니다. EDC는 먼저 나노 입자 용액에 첨가된 후 NHS와 마지막으로 항체에 첨가됩니다.

그런 다음 반응이 계속되는 동안 혼합물을 탁상용 믹서에 3시간 동안 놓습니다. 용액은 마그네틱 컬럼을 사용하여 정제됩니다. 자화된 컬럼은 나노 입자를 포착하여 자유 부동 항체만 빠져나갈 수 있도록 합니다.

그 후 컬럼을 PBS 버퍼로 세척하고 공액 나노센서를 수집합니다. 그런 다음 나노 입자는 형광 염료를 첨가할 준비가 되어 검출에 사용되는 두 번째 핵심 양식을 제공합니다. 나노 센서의 가장 중요한 특징 중 하나는 자기 및 형광 양식의 조합이며, 이는 여러 가지 이유로 중요합니다.

첫째, 양식의 조합을 통해 각 양식이 다른 양식에 대해 일종의 교차 검사를 할 수 있으므로 오늘날 사용되는 다양한 진단 플랫폼이 직면한 가장 큰 장애물 중 하나인 거짓 긍정 및 거짓 부정의 위험을 크게 줄일 수 있습니다. 둘째, 이러한 방식의 조합은 박테리아 오염을 감지할 수 있을 뿐만 아니라 정량화할 수 있는 범위를 크게 넓혀줍니다. 나노 센서 준비의 마지막 단계는 나노 입자의 암호화에서 형광 염료를 캡슐화하는 것입니다.

이것은 와류를 일으키는 동안 용액에 염료를 첨가한 다음 염료가 나노 센서의 코딩으로 확산될 수 있는 추가 시간을 허용함으로써 간단히 달성됩니다. 그런 다음 완전히 기능화된 나노 센서를 정제를 위해 마지막으로 한 번 투석합니다. 나노 센서를 특성화하기 위해 크기와 형광 제출은 zetasizer와 형광 플레이트 리더를 사용하여 기록됩니다.

나노 센서의 작은 샘플을 큐벳 물 용액에 첨가하고 크기 기록을 위해 제타사이저에 넣습니다. 형광 분석을 위해 나노 센서 샘플을 96웰 플레이트에 놓고 형광 플레이트 리더에 삽입합니다. 이상적으로 나노 센서의 직경은 약 70나노미터이고 575나노미터의 형광 투입구를 갖습니다.

나노 센서의 합성 외에도 실험실에서 박테리아 표적을 제공하기 위해 박테리아 배양이 필요합니다. 박테리아의 글리세롤 스톡은 영양 육수에서 배양액을 준비하는 데 사용됩니다. 그런 다음 이 솔루션을 배양할 수 있습니다.

초기 배양 기간 이후에는 광범위한 박테리아 농도를 달성하기 위해 연속 희석이 수행됩니다. 각 농도의 100 마이크로 리터를 영양 오거 플레이트에 도금 한 다음 24 시간 동안 배양합니다. 이 배양 후 각 플레이트의 콜로니는 콜로니 형성 단위 또는 각 희석된 스톡의 mil당 CFU 수를 결정하기 위해 계산됩니다.

이제 박테리아 원액이 준비되었으므로 준비된 나노 센서와 함께 사용할 수 있습니다. 그리고 이 박테리아를 다른 혈청형과 구별하는 이 특정 혈청형의 한 가지 중요한 측면은 다른 혈청형에 감염되면 감염되기 위해 많은 군집 형성 단위가 필요하다고 가정하는 것과 같습니다. 그러나 이 특정 대장균의 경우 10-100 CFU 또는 집락 형성 단위는 감염을 일으키기에 충분합니다.

우리의 기술은 단 하나의 식민지 박테리아 오염도 놓치지 않는 방식으로 확립되어 있습니다. 마그네틱 릴렉스미터에서 판독을 위한 용액을 준비하기 위해 먼저 300 마이크로리터의 PBS를 Eppendorf 튜브에 피펫으로 주입합니다. 그런 다음 박테리아 스톡의 샘플을 추가하고 나노 센서를 추가합니다.

그런 다음 용액을 유리관으로 옮기고 증발을 방지하기 위해 파라필름 조각을 위에 놓습니다. 그런 다음 유리관을 더 큰 NMR 튜브 내부에 넣고 자기 이완계에 삽입합니다. 박테리아가 없고 나노 센서와 PBS만 포함된 기준선 용액을 사용하여 그림과 같이 기준선 T2 판독값을 얻습니다.

그런 다음 다양한 농도의 박테리아를 포함하는 용액을 분석을 위해 자기 이완계에 삽입하고 T2 값의 변화는 나노 센서와 박테리아 간의 결합에 의해 발생합니다. 보시다시피, 이 양식을 사용하여 몇 분 이내에 박테리아 CFU의 존재를 감지할 수 있습니다. 그러나 박테리아 농도가 증가함에 따라 MR 판독값을 정량화할 수 없기 때문에 형광 소탐 데이터의 사용은 정확한 박테리아 정량화와 같습니다.

형광 데이터를 수집하기 전에 먼저 샘플을 원심분리해야 합니다. 용액은 glass tube에서 Eppendorf tube로 옮겨진 후 원심분리됩니다. 이것은 박테리아와 박테리아에 결합된 나노 센서를 용액 내의 자유 부동 나노 센서와 분리합니다.

상층액은 폐기되고 박테리아 펠릿은 PBS에 재현탁됩니다. 마지막으로, 샘플은 형광 제출을 통해 분석될 수 있습니다. 방출의 강도는 용액에 남아 있는 나노 센서의 양과 그에 따라 존재하는 박테리아의 양에 상대적입니다.

보시다시피, 박테리아 농도가 증가함에 따라 형광 투여가 강화되고 더 민감해집니다. 이것이 바로 자기 및 형광 양식의 쌍을 통해 초기 및 후기 발달 단계 모두에서 박테리아 오염을 감지하고 정량화할 수 있는 이유입니다. PBS와 같은 간단한 용액에서 박테리아를 검출하는 것 외에도 이 나노 센서는 호수물이나 우유와 같은 더 복잡한 매체에서 작동할 수 있는 기능도 갖추고 있습니다.

또한, 이러한 나노 센서는 비표적 박테리아 및 열 비활성화 표적 박테리아의 존재 하에서 특이성에 대해 테스트되었습니다. 보시다시피 자기 형광 나노센서는 접합 항체의 특이성으로 인해 비표적 또는 무생물 박테리아와 거의 또는 전혀 반응하지 않습니다. 이것은 다른 종의 존재 하에서 특정 박테리아를 검출하는 데 효과적임을 보여줍니다.

마지막으로, 이러한 나노 센서는 다른 병원체도 감지하기 위해 쉽게 맞춤화될 수 있다는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 우리 실험실에서 했던 이 나노센서를 지금 한 달 안에 합성하거나 공식화할 수 있습니다. 한 달 이내에 할 수 있으며 한 달의 제품으로 10 년 동안 사용할 수 있습니다.