접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

이 절차의 전반적인 목표는 생선이라고도 하는 C 2 혼성화에서 빠른 형광을 사용하여 살모넬라균 종의 전체 세포 분자 검출과 신선한 농산물의 접착 테이프 기반 샘플링을 결합하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 재료에 접착 테이프를 바르고 표면 결합 세포를 추출하여 수행됩니다. 셀 전하 테이프는 직접 분석하거나 고체 또는 액상 농축을 실시할 수 있습니다.

절차의 두 번째 단계는 육수에 암시되거나 농축된 세포에 대한 에탄올 계열의 테이프, 자체 고정 및 탈수입니다. 두 번째 단계는 현탁액에 세포를 고정한 다음 저장 완충액에 세포를 Resus 현탁액으로 고정하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 살모넬라 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 칵테일을 사용하여 신속한 온 테이프 혼성화 단계를 수행한 후, 팩스를 통해 분석된 샘플에 대한 세척 버퍼 헹굼으로 과도한 프로브를 제거하고, 피쉬 단계는 현탁액으로 수행하고, 초과 프로브는 분석 전에 간단한 희석 단계를 사용하여 제거할 수 있습니다.

절차의 마지막 단계는 DPI로 하이브리드화된 테이프 결합 세포를 대조염색하고 형광 현미경을 사용하여 검사하는 것입니다. 사실에 근거한 분석의 경우 카운터 염색이 필요하지 않습니다. 궁극적으로 이 방법은 샘플링된 신선 농산물에 존재할 수 있는 살모넬라 종의 시각적 또는 세포 측정 검출 수단을 제공합니다.

이 방법에 대한 아이디어는 로마의 에어로 스톤 유물에서 박테리아 군집을 조사하기 위해 유사한 접근 방식을 사용하는 이탈리아 그룹에 대해 읽었을 때 처음 떠올랐습니다. 그러나 r과 나는 내가 식품 미생물학의 신속한 방법에 대해 가르치고 있던 수업에서 이 연구에 대한 토론을 이끌었다. 몇 주 후, 신선한 농산물에서 비롯된 살모넬라균 발병이 43개 주에서 거의 1,500명의 사람들을 병들게 하기 시작했습니다.

당사의 실험적 접근 방식은 신선 농산물에서 특정 박테리아 유형을 검출할 수 있는 시기적절하고 실용적인 방법을 제공할 뿐만 아니라 현장 또는 식품 생산 환경에서 테스트할 수 있을 만큼 휴대가 간편합니다. 샘플링에 사용할 테이프를 선택하여 시작합니다. 일부 옵션에는 시중에서 판매되는 곰팡이 테이프 또는 접촉이 포함되며, 이는 멸균 상태이며 사용하기 쉽도록 포장

영구 마커를 사용하여 멸균 알루미늄 템플릿을 사용하여 10cm 접착 테이프 조각의 아프지 않은 면에 1cm 정사각형을 그립니다. 이것은 테이프의 어느 부분이 식품 또는 환경 표면이 샘플링 할 표면을 향하고있는 끈적 끈적한 면이 샘플링 할 표면을 향하는 CS 모양의 테이프 루프를 형성하는 데 사용되었는지 기록하기위한 시각적 가이드 역할을합니다. 이렇게하려면 엄지와 중지로 끈적 끈적한 끝을 잡고 검지 손가락을 테이프 뒷면에 그려진 사각형에 놓습니다.

샘플링할 표면에 테이프를 놓고 테이프의 가장자리를 풀지 않고 표시된 부분을 표면에 부드럽게 누릅니다. 검지 손가락을 사용하여 테이프의 끈적한 면이 샘플 표면과 완전히 접촉하도록 합니다. 균일한 동작을 사용하여 거품을 피합니다.

샘플에서 테이프를 천천히 당겨 빼냅니다. 물리적으로 표면 결합 미생물을 추출하면 세포 전하가 고정됩니다. 끈적한 면이 유리 현미경 슬라이드에 위로 향하게 테이프를 붙입니다 일반 투명 사무용 테이프를 사용하여 테이프의 적절한 장력과 늘어남을 확인하여 주름이 없는 평평한 표면이 생성되도록 합니다.

이렇게 하면 테이프의 변형 또는 말림 문제를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 후속 가열 중에. 혼성화 동안, 샘플된 세포가 농업 표면과 직접 접촉하여 농업 표면에서 테이프를 쉽게 제거할 수 있도록 크실로스 슬라이싱 tertile 4 또는 XLT 4 농업 플레이트에 테이프를 뒤집어 놓습니다.

농축 후, 테이프의 템플릿화된 샘플 접촉 부분을 농업 표면과 같은 높이로 배치하고 테이프의 한쪽 끝을 느슨하게 접착합니다. 페트리 접시 플레이트의 측벽은 결로를 방지하기 위해 반전되고 섭씨 35도에서 배양됩니다. 살모넬라 종의 충분한 성장을 허용하기 위해 검출 가능한 수준까지 세포를 농축하는 데 필요한 잠복 기간의 길이는 초기 살모넬라 오염 수준에 따라 달라집니다.

원하는 농축 기간이 끝나면 한천 플레이트를 열면 배양 중에 테이프가 끈적끈적함을 유지합니다. 형성된 마이크로 콜로니의 최대 복구를 보장하기 위해 검지 손가락을 사용하여 한천에 테이프를 부드럽게 누릅니다 테이프 한천 인터페이스에서 페트리 접시 벽에 부착된 가장자리에서 테이프를 잡고 느리고 균일한 동작으로 제거합니다. 일반 투명 사무용 테이프를 사용하여 셀 충전 테이프의 끈적한 면이 위로 향하게 하여 주름이 없는 평평하고 주름지지 않은 표면을 만듭니다.

섭씨 25도에서 30분 동안 샘플 접촉 영역을 500마이크로리터의 10% 중성 완충 포르민으로 덮어 테이프 셀 고정을 수행합니다. 자극적이거나 독성이 있는 증기에 대한 노출을 최소화하기 위해 화학 후드 아래의 밀봉 가능한 용기에 고정제를 버리고, 테이프 표면에 PBS를 부드럽게 주입하여 샘플을 탈수하여 1 x 인산염 완충 식염수 또는 PBS에서 테이프를 한 번 세척합니다. 프로그레시브 에탄올 시리즈를 사용하여 포인트 22 마이크로미터 주사기를 사용하여 상용 분자 생물학 등급 용액 필터를 사용하여 사전 혼성화 혼성화 및 세척 버퍼를 준비하고 혼성화 및 세척 버퍼를 섭씨 55도까지 예열합니다.

예열된 혼성화 완충액에 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가하여 마이크로리터당 5나노그램의 최종 프로브 농도를 얻고, 직접 접촉 인큐베이터를 위해 섭씨 55도로 설정된 습윤 밀봉된 배양 챔버에서 프로브 칵테일 및 혼성화된 테이프 결합 세포를 포함하는 300마이크로리터의 혼성화 완충액으로 테이프의 템플릿화된 샘플 접촉 영역을 오버레이합니다. 15 분 동안 하이브리드화 된 슬라이드 모드 기기와 같은. 혼성화 후에는 슬라이드가 제거되고 혼성화 버퍼 오버레이가 포함된 프로브가 폐기됩니다. 피펫팅으로 예열된 세척 버퍼로 짧고 부드럽게 헹굽니다.

기울어진 슬라이드 위에 있는 소량의 완충액은 형광 현미경을 통해 살모넬라균 종을 onap으로 검출하기 위해 슬라이드를 자연 건조할 수 있도록 합니다. 슬라이드에 약 10마이크로리터의 vector shield H 1200을 오버레이하고 dpi를 포함하는 장착 매체를 사용하면 핵 카운터 염색이 10분 동안 어둠 속에서 배양됩니다. 커버에 이멀젼 오일을 놓고 고배율 오일 대물렌즈를 사용하여 샘플을 밀어 넣고 검사합니다.

DPI 필터는 샘플에 초점을 맞추는 데 사용됩니다. 그런 다음 현미경을 적절한 필터로 전환하고 프로브를 라벨링하는 데 사용되는 염료에 따라 녹색 또는 빨간색 형광에 따라 살모넬라 세포의 점수를 시각적으로 평가합니다. Fore cytric detection은 PBS 부유 샘플을 5 밀리리터 원형 바닥 샘플링 튜브로 전송하고 647 나노 미터에서 여기가있는 유세포 분석기를 사용하여 검사합니다.

FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 인위적으로 오염된 토마토 표면에서 채취한 terica serovar, Ty Murium의 접착 테이프 샘플링은 현미경 검사 또는 유세포 분석 세포 전하를 통해 물고기 직후 분석을 용이하게 합니다. 테이프는 살모넬라 특이적 DNA 프로브의 조합을 사용하여 C 2 혼성화에서 빠른 형광을 위해 처리되고 테이프 상의 살모넬라 세포의 초기 국소 농도에 따라 Texas Red로 라벨링되었습니다.

고체상 농축은 고립된 마이크로 콜로니(micro colonies)에서 융합 성장(confluent growth)에 이르는 결과를 산출했습니다. 테이프 샘플링 세포는 샘플링 직후 또는 5시간 액체 표면 후에 결합된 어류 및 유세포 분석을 통해 분석할 수 있습니다. 섭씨 35도에서 미니 배양 농축.

식품 안전을 위한 테이프 피쉬 기법의 사용에 대해 설명했지만, 이 방법은 환경 미생물학, 식물 병리학 또는 임상 미생물학을 포함한 다른 분야에서도 사용할 수 있는 좋은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 절차와 병행하여 테이프로 추출된 샘플의 고체 또는 액상 농축에 대해 생화학 테스트 또는 PCR과 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 검사는 존재할 수 있는 살모넬라균에 대한 질문, 즉 생선 절차의 범위를 벗어나는 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.