Name: 접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 접착 테이프 샘플링과 형광 현장 하이브리다이제이션을 이용한 신선 농산물 표면의 살모넬라균 신속 검출 방법을. 이 기술은 식품 안전 현장 진단에 효과적입니다.

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1. 무균 접착제 테이프로 표면 샘플링 <ol><li> 샘플링에 사용하는 테이프를 선택합니다. 상용 곰팡이 - 테이프 또는 콘 - 전술 - 이건 샘플링 테이프 사용의 용이성에 대한 살균 및 특수 포장됩니다. 그러나, 우리는 투명 (광학 취소) 일반 사무실 테이프도 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. </li><li> 접착 테이프 10cm의 조각 (종이 템플릿을 사용할 수 있습니다)의 비 끈적끈적한 측면에 1cm 두 사각형을 그릴 수있는 영구 마커를 사용합니다. 이것은 테이프의 부분은 음식이나 환경 표면을 샘플하는 데 사용되었습니다 어떤 지적을위한 시각적인 가이드 역할을합니다. </li><li> 샘플로 표면을 향하게 쓰는 측면과 "C"모양의 테이프 루프를 형성합니다. 이렇게하려면 뒤로 (비 끈적 쪽) 테이프 (그림 1)에 그려진 사각형에 대한 엄지와 가운데 손가락 및 위치 검지로 쓰는 끝을 잡고. </li><li> 샘플로 표면에 테이프를 놓고 부드럽게 표면에 대한 표시 영역을 누르십시오. 테이프의 가장자리를 발표하지 않고, 테이프의 끈적한 면이 거품을 피하기 위해, 샘플 표면 전체 접촉할 수 있도록 검지 손가락을 사용합니다. </li><li> 도 동작을 사용하면, 천천히 신체 표면 바운드 미생물을 추출, 멀리 샘플에서 테이프를 가져옵니다. 일반 투명 사무실 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에, 셀 충전 테이프, 스티커 측면을 고정. 평면이 아닌 중늙은이 표면이 생성되도록 테이프의 적절한 긴장 / 스트레칭을 보장합니다. 이것은 변형 / 하이브리드화하는 동안 이후의 가열하는 동안 테이프의 컬링 문제를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 2. 솔리드 - 위상 강화 및 액체 표면 Miniculture <ol><li> 고체 상 농축은 샘플 셀이 한천 표면과 직접 접촉에 배치되도록 자일로 오스 - 라이신 - Tergitol 4 (XLT - 4) 한천 접시에 얼굴을 아래로 테이프를 배치하여 수행됩니다. 테이프 템플릿 / 샘플 접촉 부분은 한천 표면과 테이프의 한쪽 끝을 함께 플러시가 느슨하게 농축 다음 한천 표면에서 테이프의 쉬운 제거를 촉진하기 위해 페트리 접시의 측면 벽을 준수합니다 배치됩니다. </li><li> 번호판 거꾸로 (결로를 방지하기 위해)와 35 incubated 있습니다 - 37 ° C 살모넬라균 종의 충분한 성장을 허용합니다. 감지 수준으로 세포를 풍요롭게하는 데 필요한 잠복기의 길이는 초기 살모넬라균 오염 수준에 따라 달라집니다. 우리는 8 H 농축 후 낮은 초기 inocula에서 우수한 microcolony 형성을 관찰했습니다. </li><li> 원하는 강화 기간 후, 한천 플레이트를 엽니다. 테이프는 부화 기간 동안의 tackiness를 유지합니다. 부드럽게 테이프 한천 인터페이스에서 형성된 microcolonies 최대 회복을 보장하기 위해 검지 손가락을 사용하여 한천에 대한 테이프를 누르십시오. 페트리 접시의 벽에 붙어있는 가장자리의 테이프를 파악하고 느린, 심지어 운동으로 제거합니다. 위의 섹션 1.5에서 설명한대로 현미경 슬라이드에 세포 - 충전 테이프, 최대 스티커 측면을 탑재합니다. 아래의 "고정 및 탈수"단계로 진행합니다. </li><li> 액체 표면 miniculture 들어, 위의 섹션 1.5에서 설명한 것처럼 현미경 슬라이드에 샘플링에 사용되는 테이프를 고정하여 시작합니다. 다음 아래쪽 위쪽을 향하도록 셀 충전 테이프로 구성되어 있습니다 밀폐된 챔버를 형성되지 않은 멸균 실리콘 재관류 챔버 (Coverwell, 그레이스 바이오 연구소, 주식 회사)와 테이프의 템플릿 / 샘플 접촉 부분을 커버. 단호하게, 그러나 부드럽게 방수 도장을 보장하기 위해 장소로 챔버를 누르십시오. </li><li> 피펫 팁, 전송 ≤ 500 μL Trypticase의 간장 스프 또는 챔버의 작은 입구 포트 중 하나를 통해 다른 적합한 농축 매체를 로딩 유연한 젤을 사용합니다. 35 -37에서 증발하고 품어 슬라이드를 방지하기 위해 투명 사무실 테이프로 두 포트를 봉쇄 ° C 충분한 강화를 위해 필요. 모든 작업이 좋은 샘플링 및 처리 관행에 따라 수행되어야하지만, 포트 밀폐 테이프 또는 재관류 챔버스의 불임은 액체 표면 miniculture 동안 필요하지 않습니다. 피시 앤드 유동세포계측법의 조합은 살모넬라균 종 명백한 차별을 활성화합니다. 샘플 자체에서 온 것으로 기대하지 않는 대상 식물의 가장 큰 공헌과 함께, 현재 수 이외의 대상 박테리아. 아래의 "고정 및 탈수"단계로 진행합니다. </li></ol> 3. 고정 및 탈수 <ol><li> 직접 표면 샘플링이나 살모넬라균 종의 견고한 위상 강화를 위해. XLT - 4 한천에 25 30 분 동안 테이프 세포 고정을 수행하면 ° 500 μL 10% 중립과 샘플 연락처 영역을 다루는으로 C는 포르말린 버퍼. </li><li> sea​​lable 컨테이너 (유해 / 자극적 증기에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드 아래)로 정착액을 폐기하십시오. </li><li> 에탄올 시리즈 (; 300 μL / 3 분 각 농도 50 %, 80 % 95%)에 탈수. 아래의 "하이브 리다이 제이션"단계로 진행합니다. </li><li> 500 μL 액체 표면 miniculture 샘플의 고정을위한S, 재관류의 여왕님 unsealed 있으며, 유연한 젤 로딩 피펫 팁은 enrichate를 추출하는 데 사용됩니다. 아래 신속하고 pipetting는 모든 나머지 테이프 바운드 세포의 효과적인 제거를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 다음 전체 500 μL miniculture 볼륨이 microcentrifuge 튜브로 전송 2,000 XG (5 분)에서 다운 소용됩니다. 뜨는은 삭제됩니다, 펠렛은 다음 10 %의 동일한 볼륨에 resuspended, 30-60 s에 대한 적극적 vortexed입니다 중성 포르말린 버퍼. 세포 ° C. 25시 30 분 수정되었습니다 </li><li> 다음, 정착액 제거 및 샘플이 세포 저장소 버퍼 resuspended이며, 다음과 같은. 60 S, 50 % 이외의 변성 에탄올 50 %의 동일한 볼륨에 resuspended 인산염 - - 샘플은 2000 XG (5 분, 25 ° C) 뜨는가 삭제됩니다, 펠렛가 30 적극적으로 vortexed합니다에서 다운 늘인입니다 염분 버퍼. 고정 전지는 -20 ° C.에서 (년) 무기한으로 저장할 수 있습니다 참고 : 액체가 (예를 들어, 정착액 또는 다른 버퍼를 도입하는 경우) 변경 때마다, 그것은 철저하게 (vortexing 포함) 최소 부분에있는 세포 펠릿 (~ 10-20 μL) resuspend하는 것이 중요하다 "나가는"액체 시스템을 . 이것은 clumping을 방지하고 개별 세포도 suspensions 취득되었는지 확인하는 데 도움이됩니다. 아래의 "하이브 리다이 제이션"단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 이종 교잡 <ol><li> 상업 분자 생물학 수준의 솔루션 자료 표에 명시된 바와를 사용하여 하이브리드화 / 세탁 버퍼를 준비합니다. 최종 버퍼 구성 요소 농도가 0.7 M NaCl 있으며, 0.1 M 트리스 [산도 8.0], MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산염은 0.22 μm의 주사기 또는 컵 필터를 사용하여 분자 수준의 물 여과와 최종 원하는 볼륨으로 구성되어 10. 프로브 (아래 참조)의 추가없이 동일한 버퍼는 세척 버퍼로 사용됩니다. 앞서 열을 가하다의 하이브리드화 및 55 버퍼를 세척 ° C. </li><li> 찬란 - 레이블 추가 Sal3 (Nordentoft 외, 1997;. 5' - AAT CAC TTC TAC ACC GTG - 3 ')와 삼 - 63 (Kutter 외, 2006;. 5' - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3' preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼) oligonucleotide 프로브 (자료 표). 5 NG μL -1 총 프로브 농도는 (; 비샤 및 브렘 - Stecher, 2009a 2.5 NG μL -1 각각의 프로브를 예 :)이 사용됩니다. </li><li> 직접 투 - 테이프 견고한 위상 강화 샘플 들어, 프로브 칵테일을 포함 하이브리드화 버퍼 300 μL와 테이프의 템플릿 샘플 접촉 영역을 중첩하고 55 ° C.으로 설정 습기, 밀폐된 배양 챔버에서 테이프 바운드 세포 잡종 슬라이드 모앗 악기 (자료 표)와 같은 직접 연락 인큐베이터를 사용하는 경우, 샘플은 15 분 hybridized하고&gt; 20 슬라이드 동시에 처리할 수 있습니다. 같은 밤비노 악기 (자료 표)로 로타리 스타일 하이브 리다이 제이션 오븐이 사용하는 경우, 슬라이드가 하이브리드화 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 튜브 당 하나의 슬라이드에 배치됩니다. 열전달 직접 아니기 때문에, 이러한 샘플은 더 이상 기간 (최대 30 분)에 대한 hybridized입니다. </li><li> 하이브리드화 다음, 슬라이드를 제거하고 프로브 함유 하이브리드화 버퍼 오버레이가 삭제됩니다. 슬라이드 preheated 세척 버퍼 오버레이 또는 하나와 다음 (최대 30 분) 중 잠시 부드럽게 기울어져 슬라이드 (300 μL 각 3 rinses)을 통해 버퍼의 작은 볼륨을 pipetting하여 preheated 세척 버퍼 씻어서, 또는 공식적으로 씻어 아르 preheated 세척 버퍼를 포함하는 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브의 침수. 우리의 경험에서, 공식적인 세척이 향상된 결과 (언바운드 프로브에서 적은 헤이즈) 제공하지만, 간단한 헹굼은 살모넬라균 종의 모호하지 탐지에 적합합니다. 다음 슬라이드는 아래의 "검색"단계로 이동하기 전에 공기 건조합니다. </li><li> 액체 표면 miniculture 샘플 하이브 리다이 제이션은 활발한 펠렛의 vortexing 및 포함된 100 μL preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼에 resuspension 다음, 2000 XG에서 5 분 (-20 ° C에서 갓 고정 또는 저장 버퍼에 보관) 샘플을 회전하여 수행됩니다 프로브 칵테일. 샘플은 55 hybridized 아르 ° 500 μL preheated 세척 버퍼의 또한 다음 열 블록 또는 기타 적합한 배양 스테이션 (재료 표), 30 분 C. 테이프 바운드 샘플과 마찬가지로,이 샘플은 공식적으로 대한 씻어 수 있습니다 최대 55에서 추가 배양과 30 분하는 ° 간헐 vortexing이 세척 버퍼에 C. 또한, 샘플은 철저하게 분석을 위해 즉시 수확 (아래)에 의해 다음, 500 μL preheated 세척 버퍼를 추가 후 vortexed 수 있습니다. </li><li> 살모넬라균 종의 검출을위한 준비. 유동세포계측법 통해 액체 표면 miniculture 샘플은 5 분 2,000 XG에 아래 냈지 있으며, 표면에 뜨는가 무시되고 샘플, 300 μL 상온에서 resuspended 아르 (~ 25 ° C) PBS. 샘플가 먼 시설로 수송해야하는 경우 지연이 하이브리드화 분석 사이에 예상되는 경우, 또는 샘플 전에 아나로 냉장 또는 얼음에서 개최됩니다용해. 또한, 샘플은 셀 저장 버퍼 (PBS와 절대 에탄올의 혼합 50:50)로 전송 및 감지할 수있을 정도의 손실없이 일주일에 최대 -20 ° C에서 개최됩니다 프로브 - 수여 형광 (비샤 및 브렘 - Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. 검색 <ol><li> 살모넬라균 종의 온 - 테이프 감지. 형광 현미경을 통해, 직접 - 투 - 테이프 또는 고체 위상 강화 샘플은 핵 counterstain 4 포함된 ~ 10 μL Vectashield H - 1200 설치 매체 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI), 커버 슬립과 함께 탑재와 overlayed 아르 다음 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 incubated. </li><li> 단기 집중 오일 커버 슬립에 배치되며, 샘플은 높은 배율 오일 목표 (63x 또는 100x)를 사용하여 검사하고 있습니다. DAPI 필터가 초점에 샘플을 가지고하는 데 사용됩니다, 현미경은 다음 적절한 필터 (녹색 또는 빨간색, 최종 라벨 프로브에 사용되는 염료에 따라 다름) 및 살모넬라의 세포로 전환됩니다는 (자신의 형광에 따라 시각 득점 아르 피규어 2, 3). </li><li> 액체 표면 miniculture 샘플 cytometric 검출을위한 다양한 악기 현지 예약 상황에 따라 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에서는 PBS - 정지 샘플 5 ML 라운드 바텀 샘플링 튜브 (BD 팔콘)에 양도하고 647 nm의 (자료 표)에서 여기로 FACSCanto 흐름 cytometer를 사용하여 검사하고 있습니다. 총 박테리아의 높은 숫자를 포함하는 풍부한 예제에 대해 "낮은 유량"설정 (10 μL 분 -1) 사용되며, 5,000-50,000 이벤트가 수집됩니다. 데이터 FlowJo 소프트웨어 (버전 8.8.6, 나무 스타 (주), 애쉬 랜드, OR) 또는 기타 적합한 분석 소프트웨어 (그림 4, 패널 A와 B)을 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 살모넬라균 종의 표본 추출을위한 접착 테이프 중 하나를 사용하십시오. 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 토마토 (100 X 오일 목적)의 표면에서 직접 - 투 - 테이프 샘플링과 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 물고기 탐지를위한 일반적인 결과입니다. 텍사스의 두 프로브 칵테일은 레드 - 라벨 프로브는 (Sal3/Salm-63) 사용되었다 이러한 세포를 분류합니다. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 Microcolonies 37에서 8 H에 테이프 농축 ° C. 후 초기 inoculum은 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서 샘플되었습니다 자일로 오스 라이신 Tergitol - 4 (XLT - 4) 한천의 표면에 형성. 고체 상 농축은 탐지에 사용할 세포의 숫자를 증가 또한 셀룰러 rRNA 컨텐츠를 향상시킵니다. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. S.의 샘플링에 대한 접착 테이프의 사용 enterica serovar Typhimurium 피시 앤드 유동세포계측법 (패널 A)을 통해 500 μL Trypticase 간장 맛을 (패널 B 가득한 재관류 챔버 5 H 아닌 선택적 액체 표면 miniculture 농축 후 직접 분석하여 다음 인위적으로 오염 토마토의 표면에서 ).

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생산 표면에 병원균의 검출을위한 간단하고 빠른 방법은 시의 적절하고 실질적인 데이터를 제공함으로써 식인성 질환을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접착제 테이프 기반 샘플링 방법은 1950 년대 이후, 환경 임상 및 식품 미생물학에서 사용하고 직접 현미경 검사 또는 고체 미디어에 점착 성의 미생물의 양도 다음, 미생물의 제거를위한 표면에 &#39;스카치&#39;스타일 테이프를 눌러 포함되었습니다 성장 (Barnetson &amp; 밀른, 1973; 에드워즈 &amp; 하트먼 1952; Evancho 외, 2001;. 반갑습 외, 1980;. Lakshmanan &amp; 샤프너, 2005; Langvad, 1980). 최근 수정 석조 기념물 (라 Cono &amp; C. Urzì, 2003)의 표면을 colonizing 미생물의 문화 독립적인 분석을 위해 현장 하이브리드화 (물고기)의 형광과 테이프 기반 샘플링의 조합을 설명했다. 우리는 빠른 샘플링과 토마토,...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape 샘플링 테이프</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It 샘플링 테이프</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>투명 사무용 테이프, 일반용</td><td>다양함</td><td></td><td>광학적으로 투명하고 고유 형광이 낮아야 함</td></tr><tr><td>식품 표면</td><td>지역 식료품점</td><td></td><td>본 실험에서는 토마토(&amp;#8211;) (왁스나 오일 처리를 하지 않은 가지 달린 빨간 토마토&amp;#8211;)를 사용함</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>비선택적 액체 표면 미니 배양 농축용</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 한천 베이스</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;-선택 한천(XLT-4)용</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 한천 보충제</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>&lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;-선택 한천(XLT-4)용</td></tr><tr><td>포르말린 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10% 용액, 중성, 완충액 (세포 고정액)</td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>분자 생물학 등급 (혼성화 전 탈수용)</td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브</td><td>다양함</td><td></td><td>RNase 및 DNase-free</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 및 커버 글라스</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>분자 생물학 등급, 5M 용액 (혼성화 완충액 성분)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA 완충 용액 (100X 농축액)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (혼성화 완충액 성분)</td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>18 megohm 물에 희석한 10% 용액 (혼성화 완충액 성분)</td></tr><tr><td>Sal3 및 Salm-63 올리고뉴클레오타이드 프로브</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>6-carboxyfluorescein (FAM) 또는 Texas Red (현미경 관찰용) 또는 Cy5 (사이토메트리용)로 5&amp;rsquo;-표지됨, HPLC 정제됨</td></tr><tr><td>가변 속도 마이크로 원심분리기</td><td>다양함</td><td></td><td>프로토콜에 명시된 RCF 값을 얻기 위해 로터 직경을 이용하여 필요한 RPM을 계산하여 사용</td></tr><tr><td>CoverWell 퍼퓨전 챔버</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>비멸균</td></tr><tr><td>겔 로딩 피펫 팁 (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>작은 샘플링 포트에 쉽게 접근하고 챔버 내에서 기동성을 높이기 위한 길고 얇은 팁</td></tr><tr><td>알루미늄 히트 블록 또는 정밀 제어 가열 스테이션</td><td>다양함</td><td></td><td>본 실험에서는 Eppendorf Thermomixer R 드라이 블록 가열 및 냉각 쉐이커를 사용함</td></tr><tr><td>Bambino 미니 혼성화 오븐</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td>슬라이드를 50 ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣어 혼성화하며, 열전달이 직접적이지 않음</td></tr><tr><td>Slide Moat 슬라이드 혼성화 장치</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 240000</td><td>유리 슬라이드를 통해 신속하고 직접적인 열전달 제공</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)가 포함된 Vectashield H-1200 마운팅 용액</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>현미경 관찰 중 형광 소광을 최소화하며 DAPI 대조 염색 제공</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>다양함</td><td></td><td>본 실험에서는 Leitz Laborlux S를 사용함</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>다양함</td><td></td><td>본 실험에서는 Canon PowerShot A640 카메라를 사용함</td></tr><tr><td>이미지 획득 소프트웨어</td><td>다양함</td><td></td><td>Axiovision 소프트웨어 v. 4.6 (Carl Zeiss) 사용</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>이미지의 최소 처리용 (서로 다른 채널에서 촬영된 이미지의 중첩)</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>다양함</td><td></td><td>적색(647 nm) 여기광을 사용하는 FACSCanto 유세포 분석기 (BD Biosciences, San Jose, CA) 사용</td></tr><tr><td>유세포 분석 소프트웨어</td><td>다양함</td><td></td><td>FlowJo 소프트웨어 v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) 사용</td></tr></tbody></table>

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

이 프로토콜은 살모넬라균 종의 급속한 문화 독립적인 감지를위한 현장 하이브리드화 (물고기)에서 테이프 형광 다음 토마토와 다른 신선한 농산물 표면의 접착 테이프 기반의 샘플링을위한 간단한 방법을 설명합니다. 셀 - 충전 테이프도 검색하기 전에 고체 상 농축을위한 선택적 한천에 얼굴을 아래로 둘 수 있습니다. 또는 낮은 볼륨 액체 enrichments (액체 표면 miniculture)는 유동세포계측법를 통해 물고기와 분석에 의해 다음이 아닌 선택 국물에있는 테이프의 표면에 수행할 수 있습니다. 시작하려면, 살균 접착 테이프는 신선한 농산물과 접촉을 가지고있다, 부드러운 압력이 적용되고 테이프는 실제로 이러한 표면에 존재하는 미생물을 추출, 제거됩니다. 테이프 유리 현미경 슬라이드에 쓰는 쪽까지를 탑재하고 샘플 세포는 포르말린 (30 분)과 탈수 10 % 등급 에탄올 시리즈 (50, 80, 및 95 %, 3 분 각 농도)를 이용하여 고정합니다. 다음 셀 충전 테이프는 살모넬라균 타겟 DNA 프로브 칵테일을 포함하는 버퍼 발견하고 15 hybridized 아르 - 55시 30 분 ° C, 언바운드 프로브를 제거하는 세척 버퍼 린스 간단한 다음. 자기편, 물고기 표시된 전지는 다음 형광 현미경을 사용하여 볼 수있는 DNA 염색 4 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 및 결과 counterstained 있습니다. 고체 상 농축 들어, 셀 충전 테이프는 적절한 선택 한천 표면에 얼굴을 아래로 배치하고 위에 설명된대로 피시 앤드 현미경 다음 살모넬라균의 microcolonies의 현장 성장에 수 incubated 수 있습니다. 액체 표면 miniculture 들어, 셀 충전 테이프 끈끈한 측면을 배치하고 실리콘 재관류 챔버 적용되도록 테이프 및 현미경 슬라이드 양식 물이 꽉 챔버로의 하단 Trypticase 콩의 작은 볼륨 (≤ 500 μL) 국물 (TSB)가 도입됩니다. 입구 포트는 봉인되고 회의소는 35 incubated 있습니다 - 37 ° C, 테이프 추출한 미생물의 성장 기반 확대를 수 있도록합니다. 부화 후, 입구 포트 unsealed 있으며, 세포 분리 및 혼합 활발한 뒤로와 앞으로 pipetting, 원심 분리를 통해 수확와 10 %에서 해결된 중성 포르말린 버퍼. 마지막으로 샘플은 hybridized과 살모넬라균 종의 존재를 나타내기 위해 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다. 여기에 설명한 바와 같이, 우리의 &quot;테이프 - 물고기&quot;접근 방식은 토마토 표면에 간단하고 빠른 샘플링과 살모넬라균의 검출을 제공할 수 있습니다. 또한 시금치와 잘라페노 후추를 포함한 신선한 농산물의 다른 유형을 샘플링이 접근 방식을 사용하고 있습니다.

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다<em&gt; 살모넬라균</em&gt; 형광을 사용하여<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기).

본 프로토콜은 토마토 및 기타 신선 농산물 표면의 접착 테이프 기반 샘플링과 이후 테이프 상에서의 형광...에 대한 간단한 접근 방식을 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 신선 농산물의 접착 테이프 기반 샘플링을 rapid fluorescence in situ hybridization(FISH로 알려진 신속 형광 인시튜 하이브리다이제이션)을 이용한 salmonella 종의 전세포 분자 검출법과 결합하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 재료에 접착 테이프를 부착하여 표면에 결합된 세포를 추출함으로써 수행됩니다. 세포가 포집된 테이프는 직접 분석하거나 고상 또는 액상 농축 과정을 거칠 수 있습니다.절차의 두 번째 단계는 배지 내에 들어있거나 배지에서 농축된 세포를 대상으로 테이프 상에서 자체 고정 및 에탄올 시리즈를 이용한 탈수를 진행하는 것입니다. 두 번째 단계에는 부유 상태에서의 세포 고정이 포함되며, 이후 보관 버퍼로 세포를 재부유시킵니다. 절차의 세 번째 단계는 살모넬라 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브 칵테일을 사용하여 테이프 상에서 신속한 하이브리드화 단계를 수행하는 것이며, 이어서 세척 버퍼 린스로 과잉 프로브를 제거합니다. FAX를 통해 분석하는 샘플의 경우, FISH 단계는 부유 상태에서 수행되며, 분석 전 간단한 희석 단계를 통해 과잉 프로브를 제거할 수 있습니다.절차의 마지막 단계는 하이브리드화된 테이프 결합 세포를 DPI로 대조 염색하고 형광 현미경을 사용하여 관찰하는 것입니다. 사실 기반 분석의 경우, 대조 염색은 필요하지 않습니다. 궁극적으로, 이 방법은 샘플링된 신선 농산물에 존재할 수 있는 살모넬라 종을 시각적 또는 세포 분석적으로 검출하는 수단을 제공합니다.저는 로마 시대의 에어로 스톤(aero stone) 유물에 있는 박테리아 군집을 조사하기 위해 유사한 접근 방식을 사용한 이탈리아 연구팀에 관한 글을 읽으면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그 후 저와 r은 제가 강의하던 식품 미생물학의 신속 분석법 수업에서 이 연구에 대해 토론을 진행했습니다. 몇 주 후, 신선 농산물에서 기인한 살모넬라(salmonella) 식중독 사고가 발생하여 결국 43개 주에서 약 1500명의 환자가 발생했습니다.본 실험적 접근 방식은 신선 농산물에서 특정 박테리아 유형을 검출하기 위한 시의적절하고 실용적인 방안을 제공할 뿐만 아니라, 현장이나 식품 생산 환경에서 테스트가 가능할 정도로 휴대성이 뛰어납니다. 먼저 샘플링에 사용할 테이프를 선택하십시오. 시중에서 판매되는 곰팡이용 테이프나 멸균 처리되어 사용이 간편하게 포장된 접촉 플레이트 등이 선택지에 포함됩니다.멸균된 알루미늄 템플릿을 사용하여 10 cm 길이의 접착 테이프의 비접착면에 1 cm 크기의 정사각형을 유성 마커로 그립니다. 이는 테이프의 어느 부분이 식품 또는 환경 표면 샘플링에 사용되었는지 표시하는 시각적 가이드 역할을 합니다. 접착면이 샘플링할 표면을 향하도록 테이프로 C자 모양의 루프를 만듭니다. 이를 위해 엄지와 중지로 접착 끝부분을 잡고, 검지 손가락을 테이프 뒷면에 그려진 정사각형에 댑니다.샘플링할 표면에 테이프를 놓은 다음, 테이프의 가장자리를 떼지 않은 상태로 표시된 영역을 표면에 부드럽게 누릅니다. 검지 손가락을 사용하여 테이프의 점착면이 샘플 표면에 완전히 밀착되도록 합니다. 이때 고른 동작으로 눌러 기포가 생기지 않도록 합니다.샘플에서 테이프를 천천히 떼어냅니다. 표면에 결합된 미생물을 물리적으로 추출하여 세포 전하를 고정합니다. 일반 투명 사무용 테이프의 접착면이 위로 향하게 하여 유리 현미경 슬라이드 위에 붙이되, 테이프를 적절히 당겨 팽팽하게 유지함으로써 주름 없이 평평한 표면이 형성되도록 합니다.이는 이후 가열 과정에서 테이프의 변형이나 말림 현상으로 인한 문제를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 하이브리드화 단계에서는 샘플링된 세포가 agri 표면과 직접 접촉하여 나중에 agri 표면에서 테이프를 쉽게 제거할 수 있도록, 테이프의 면이 아래를 향하게 하여 xylose slicing tertile four 또는 XLT four agri 플레이트에 놓으십시오.증식 후, 테이프의 템플릿 샘플 접촉 부위를 agri 표면에 밀착시키고 테이프의 한쪽 끝을 느슨하게 부착합니다. 응결을 방지하기 위해 페트리 접시의 측벽이 위로 가도록 뒤집어 35 °C에서 배양합니다. 살모넬라 종이 충분히 성장하도록 하기 위해, 세포를 검출 가능한 수준까지 증식시키는 데 필요한 배양 기간은 초기 살모넬라 오염 수준에 따라 달라집니다.원하는 농축 기간이 지난 후, 배양 중에도 접착력이 유지되는 테이프가 부착된 한천 배지 플레이트를 엽니다. 테이프와 한천의 접촉면에 형성된 미세 군집을 최대한으로 회수할 수 있도록 검지 손가락을 사용하여 테이프를 한천 쪽으로 가볍게 누릅니다. 페트리 접시 벽면에 부착된 테이프 가장자리를 잡고 천천히 일정한 동작으로 제거합니다. 일반 투명 사무용 테이프를 사용하여, 표면이 평평하고 주름지지 않도록 세포 전하 테이프의 접착면이 위로 향하게 하여 현미경 슬라이드 위에 고정합니다.샘플 접촉 부위를 500 µL의 10% 중성 완충 포르말린으로 덮어 25 °C에서 30분 동안 테이프 세포 고정을 수행합니다. 자극성 또는 독성 증기 노출을 최소화하기 위해 화학 흄후드 내 밀폐 용기에 고정액을 버리고, 테이프 표면에 1x 인산 완충 식염수(PBS)를 부드럽게 흘려주어 테이프를 한 번 세척하여 샘플을 탈수합니다. 단계적 에탄올 시리즈를 사용하여 상용 분자생물학 등급 용액으로 사전 하이브리드화, 하이브리드화 및 세척 완충액을 준비하고, 0.22 µm 시린지 필터로 여과한 후 하이브리드화 및 세척 완충액을 55 °C로 예열합니다.최종 프로브 농도가 5 ng/µL가 되도록 예열된 하이브리다이제이션 버퍼에 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가합니다. 프로브 칵테일이 포함된 하이브리다이제이션 버퍼 300 µL를 테이프의 템플릿 샘플 접촉 부위에 덮습니다. 하이브리다이제이션된 테이프 결합 세포를 슬라이드 모드 기기와 같은 직접 접촉식 인큐베이터의 55 °C로 설정된 습윤 밀폐 배양 챔버에서 15분 동안 하이브리다이제이션 시킵니다. 하이브리다이제이션 후 슬라이드를 꺼내고 프로브가 포함된 하이브리다이제이션 버퍼 오버레이를 제거합니다. 피펫팅을 통해 예열된 세척 버퍼로 짧고 부드럽게 헹굽니다.기울인 슬라이드 위에 소량의 완충액을 처리하여 슬라이드를 자연 건조시키면 형광 현미경을 통한 salmonella 종의 onap 검출이 가능해집니다. 핵 대조 염색제인 dpi가 포함된 마운팅 용액인 vector shield H 1200을 슬라이드 위에 약 10 µL 도포하고 암소에서 10분 동안 배양합니다. 커버 슬립 위에 침강유를 떨어뜨린 후 고배율 오일 렌즈를 사용하여 시료를 관찰합니다.DPI 필터는 시료의 초점을 맞추는 데 사용됩니다. 그런 다음 현미경을 적절한 필터로 전환하고, 프로브 표지에 사용된 염료에 따라 salmonella 세포의 녹색 또는 적색 형광을 시각적으로 판독합니다. 유세포 분석법 검출을 위해서는 PBS에 현탁된 시료를 5 mL 라운드 바텀 샘플링 튜브로 옮기고, 647 nm에서 여기(excitation)를 통해 유세포 분석기로 분석합니다.FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 인위적으로 오염시킨 토마토 표면에서 Ty Murium terica serovar를 점착 테이프로 샘플링하면, 현미경 관찰이나 유세포 분석 세포 충전을 통해 사후 분석을 직접적으로 수행할 수 있습니다. 테이프는 salmonella 특이적 DNA 프로브 조합을 이용한 신속 형광 C two 하이브리드화 공정을 거쳤으며, 테이프 상의 salmonella 세포 초기 국소 농도에 따라 Texas Red로 표지되었습니다.고체상 농축 결과, 단일 마이크로 콜로니부터 합쳐진 형태로 자란 군집까지 다양하게 나타났습니다. 테이프로 채취한 세포는 샘플링 직후 또는 5시간의 액체 표면 배양 후에 FISH 및 유세포 분석법의 결합을 통해 분석할 수 있었습니다. 35 °C에서 미니 배양 농축을 수행하였습니다.우리는 식품 안전을 위한 테이프 피쉬 기법의 사용법을 설명하였으나, 이 방법은 환경 미생물학, 식물 병리학 또는 임상 미생물학을 포함한 다른 분야에서도 활용될 가능성이 높습니다. 이 절차와 병행하여, 테이프로 추출한 시료의 고상 또는 액상 증균 배양액에 대해 생화학적 테스트나 PCR과 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 이러한 테스트는 피쉬 절차의 범위를 벗어나, 존재할 수 있는 salmonella에 관한 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

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브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

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여기, 선물이 공동된 검색 및 quasimetagenomic 시퀀싱을 통해 살 모 넬 라의 동등에 대 한 음식과 환경 microbiomes에서 DNA 샘플을 준비 하는 프로토콜. 사용 문화 농축, immunomagnetic 분리 (IMS), 및 다중 변위 증폭 (MDA) 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA의 효과적인 농도 하실 수 있습니다.

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루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

배우세요 접착 테이프 샘플링과 형광 현장 하이브리다이제이션을 이용한 신선 농산물 표면의 살모넬라균 신속 검출 방법을. 이 기술은 식품 안전 현장 진단에 효과적입니다.

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균* 신선한 농산물에 대한*

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