같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극 체외 스트로크의 모델

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 마이크로 절편에 세포독성 자극을 적용하여 체외 뇌졸중 모델을 만드는 것입니다. 이것은 먼저 갓 분리된 뇌에서 마이크로 조각을 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 부드러운 교반으로 마이크로 슬라이스를 평형을 이루는 것입니다.

일단 평형이 이루어지면 마이크로 슬라이스는 다양한 실험 조작을 받을 준비가 됩니다. 궁극적으로, 결과는 마이크로 슬라이스가 생성 후 최소 2시간 동안 생존할 수 있음을 보여줍니다. 1차 배아, 신경 배양과 같은 다른 기존 기술에 비해 우리 기술의 주요 장점은 우리의 기술이 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 성숙한 뇌 조직 조각을 활용하므로 온전한 뇌 조직을 더 잘 대표한다는 것입니다.

첫 번째 단계는 새로운 뇌 조직을 얻는 것입니다. 소량의 따뜻한 크렙스 완충액에 뇌를 담그십시오. 잔여 피부, 털 또는 피를 제거하려면 따뜻한 크렙스 버퍼를 적신 여과지 두 장으로 맥클 웨인 초퍼를 준비하십시오.

준비가 되면 뇌를 헬리콥터의 무대에 놓습니다. 뇌가 미끄러지는 것을 방지하기 위해 노력하면서 따뜻한 틈새 완충제로 뇌와 여과지를 촉촉하게 유지하십시오. 표면에 너무 많은 액체가 쌓이지 않도록 하십시오.

뇌를 250마이크로미터의 관상동맥 절편으로 자릅니다. 그런 다음 스테이지를 90도 회전하고 250마이크로미터 시상 슬라이스를 만듭니다. 이 단계가 끝나면 뇌 절편을 마이크로 슬라이스라고 합니다.

마이크로 슬라이스를 10-15ml의 따뜻한 크립스 버퍼와 함께 둥근 바닥 2개에 놓습니다. 개별 마이크로 조각이 매달려 있을 때까지 튜브를 부드럽게 교반한 다음 중력 하에서 정착되도록 합니다. 부유 세포 파편으로 인해 탁해질 수 있는 상층액을 조심스럽게 제거하고 튜브에 10ml의 신선한 따뜻한 크렙 완충액을 추가합니다.

철저히 세척한 후 대부분의 이물질을 제거하려면 세척 절차를 네 번 반복하십시오. 섭씨 37도에서 부드러운 흔들기 또는 반전으로 마이크로 슬라이스를 평형을 이루고 총 1시간 동안 15분마다 크렙스 버퍼를 변경합니다. 이 시간이 지나면 섭씨 37도의 새로운 크렙스 완충액 2밀리리터를 넣고 15-20개의 마이크로 슬라이스를 평평한 바닥 폴리스티렌 5밀리리터 튜브에 옮깁니다.

가장자리가 매끄럽고 보가 넓은 매우 넓은 피펫 팁을 사용하여 각 마이크로 슬라이스가 산소가 함유된 대기에서 몇 밀리미터 이상 떨어져 있지 않도록 튜브 바닥에 단일 층으로 마이크로 슬라이스를 고르게 펴십시오. 적절하게 배열되면 마이크로 슬라이스에 적절한 산소를 공급하기 위해 섭씨 37도의 수조에서 마이크로 슬라이스를 배양합니다. 가스 라인 위치가 표면 바로 위에 있는 마이크로 슬라이스 서스펜션 위로 카보겐을 지속적으로 통과시켜 마이크로 슬라이스의 기계적 중단을 방지하고 가스와 직접 접촉하는 것을 방지하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.

마이크로 슬라이스를 올바르게 폭기하는 것이 중요합니다. 가스 라인을 마이크로사이트 현탁액 표면에서 적절한 거리에 배치하는 것이 중요합니다. 여러 자극이 발생할 수 있도록 여러 라인을 함께 융합할 수 있습니다.

동시에 다양한 자극을 사용할 수 있습니다. 이 예에서 마이크로 슬라이스는 AMPA 자극을 받습니다. 마이크로 슬라이스를 세포독성 자극 또는 크렙스 완충액만으로 처리합니다.

자극된 그룹에 대한 통제를 위해. 자극 후 다양한 시간에 배양 용액을 제거하고 원하는 시점에 300마이크로리터의 얼음 저온 균질화 완충액으로 교체합니다. 자극 후, 유리 테프론 다운 균질기를 사용하여 얼음 위의 마이크로 슬라이스를 균질화하고 추가 분석이 준비될 때까지 섭씨 영하 80도에서 균질한 것을 저장합니다.

호흡수는 닭 전뇌에서 채취한 마이크로 조각이 생성 후 최대 2시간 동안 생존할 수 있음을 보여줍니다. 마이크로 슬라이스에서 발견되는 높은 A TP 및 낮은 A DP 수준도 생존 가능한 세포의 특징입니다. 이 예시에서, 조직 칼륨 함량을 측정한 결과 해부 후 배경 바로 위에 있는 것으로 밝혀졌지만, Krebs 완충액을 사용한 배양 시 증가한 것으로 나타났으며, WABE와 EGTA를 첨가하면 조직 칼륨 함량이 감소하여 마이크로 슬라이스가 일반적으로 칼륨을 활발하게 펌핑하며 그 수치가 죽은 조직이나 틈새 공간에 갇힌 칼륨 때문이 아님을 보여주었습니다.

여기서 수컷 쥐의 선조체와 감각 피질에서 마이크로 슬라이스를 생성하고 높은 칼륨 크레브 완충액을 사용하여 탈분극했습니다. 접착제 N 2 B 인산화의 속도는 피질과 선조체 사이에서 다양했던 반면, 접착제 A 1 인산화의 속도는 두 영역 사이에서 비슷했습니다. 이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 약 2시간 내에 완료할 수 있습니다.