Name: 같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극 체외 스트로크의 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 학습하세요 뇌 미세절편을 이용한 흥분독성 매개 뇌손상 연구 방법입니다. 성숙한 뇌조직을 활용하여 신경회로를 보존하고 동물 사용을 최소화하면서 생존성을 2시간 이상 유지하는 체외 뇌졸중 모델을 구축합니다.

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이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 헌터 의학 연구소, 뉴캐슬 대학에서 연구 기금에 의해 지원되었다.

모든 절차는 NSW 동물 연구 법, NSW 동물 연구 규정 및 대한 연습의 호주 코드를 포함하여 관련 지침 및 규정에 따라뿐만 아니라 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에서 승인을 수행 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용. 1. 뇌 조직의 해부 <ol><li> 잘린 십이주 된 수컷 쥐를 희생. 쥐도 근사하고 잘린 희생 할 수있다, 또는 최초의 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 % 유지) 70 % N 2 30 %의 O 2 마취 할 수 있고, 그 목을 베. </li><li> 가능한 빨리 두개골에서 뇌를 제거 (이상적으로,이보다 2 분에 수행해야합니다). </li><li> 프리 핸드의 해부에 의해 피질을 제거합니다. 마이하도록 절개 가능한 뇌 적게 손상, 가능한 최단 시간 내에 수행되어야슬라이스의 무결성을 ntain. </li><li> 잔류 피부를 제거하기 위해, 기타 퍼, 혈액,,, 37 ° C 크렙스 완충액 (118 mM 염화나트륨, 4.7 mM의 염화칼륨, 1.3 mM의 염화칼슘의 소량 (3-5 ml)에 뇌를 담가 1.2 ㎜의 인산이 수소 칼륨, 1.2 mM의 황산 마그네슘, 25 mM의 나트륨, 탄산 수​​소, 11.7 mM의 글루코오스, 0.03 mM의 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 95 % 산소 / 5 % 이산화탄소 (carbogen)의 pH 7.4)로 평형화. </li></ol> 2. Microslices의 준비 <ol><li> 여과지의 두 조각을 배치하고 따뜻한 크렙스 버퍼를 살짝 묻혀있다하는 맥일 웨인 헬기의 무대에서 뇌를 놓습니다. 두뇌와 따뜻한 크렙스 버퍼에 적신 여과지를 유지하지만 너무 젖은 뇌가 미끄러지지 않을 수 있습니다 종이의 표면에 액체가 무료입니다. </li><li> 250 μm의 코로나 섹션으로 머리를 조각. 영양소, 산소 및 노폐물 th로일반적으로 혈액 공급이 절연 신경 조직에서 조직을 둘러싸는 유체 교환하여 교환에서, 슬라이스의 사이즈는 적절한 산소 및 영양소 교환이 발생할 수 있도록하는 두께로 400 μM이어야한다. </li><li> 맥일 웨인 단계 90 ° 돌립니다. </li><li> 250 μm의 시상 조각으로 머리를 조각. 여기서, 이러한 뇌 섹션 (가변 길이의 250 μM × 250 μm의 슬라이스 조직의 두께에 따라) microslices로 지칭된다. </li><li> (사용 크렙스 버퍼의 양이 조직의 양에 따라 달라집니다) 15 ㎖를 37 ° C 크렙스 버퍼 둥근 바닥 튜브에 microslices를 놓습니다. </li></ol> 3. Microslices의 평형 <ol><li> 부드럽게 개별 microslices가 일시 중단 될 때까지 교반 한 후 그 중력에서 해결 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 인해 일시 중단 된 세포 파편에 흐린 될 상층 액을 제거하고 신선한 37 ° C 10 mL를 넣고크렙스는 튜브에 버퍼. </li><li> 파편의 대부분 제거 될 것이다,이 세척 절차를 네 번 반복합니다. </li><li> 이 후, 부드러운 흔들림 / 반전으로 37 ° C에서 microslices을 평형 및 크렙스는 총 1 시간 동안 매 15 분을 버퍼로 변경합니다. </li><li> 이 때, 2 ML 신선한 37 ° C 크렙스 버퍼를 추가하고 평평한 바닥 폴리스티렌 15-20 microslices (microslice 현탁액 150 μL)를 전송하여 만들 수 있습니다 부드럽게 가장자리 (과 여분의 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 5 ㎖ 튜브 P1000 팁의 끝에서 1 ~ 2 mm 절삭). 각 microslice가 산소 분위기에서 몇 밀리미터보다 더되지 않도록, 단층의 튜브의 기부에 균일 microslices 스프레드. </li></ol> 4. 흥분 독성 자극 <ol><li> 37 ° C에서 microslices을 품어, 지속적으로 위치하는 가스 라인을 사용하여 150 μL의 microslice 서스펜션의 표면에 carbogen 전달다만 microslice 서스펜션 (기계 혼란을 피하기 위해)의 표면 위에 에드. </li><li> (: 최종 농도 2.5 mM의 글루타민산 염 + 50 μM 글리신 흥분 독성 자극) 또는 단독으로 150 μL 크렙스 버퍼 (nonstimulated를 제어) 150 ㎕의 5 mM의 글루타민산 염 + 100 크렙스 버퍼 μM 글리신과 microslices을 처리합니다. 다양한 자극이 단계에서 사용될 수있다 (를 포함 하나 이에 국한되지 않는 AMPA, NMDA + 글리신, 탈분극의 KCl, 및 산소 / 글루코스 부족). </li><li> 여러 번 후 자극 (0, 30, 60, 90, 120, 300 초)에서 배양 용액을 제거하고 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 (30 MM 트리스, 산도 7.4, 1 ㎜의 에틸렌 글리콜의 300 μL로 교체 디아민 테트라 아세트산, 4 mM의 EDTA, 100 μM 몰리브덴 산 암모늄, 5 mM의 나트륨 피로 포스페이트, 25 mM의 불소화 나트륨, 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 밀리미터 phenylmethanesulfonylfluoride 완전 프로테아제 억제제 칵테일). </li><li> 유리 테플론 다운스 균질화를 사용하여 얼음에 microslices 균질화(20 스트로크, 700 RPM). </li><li> 등 -80 ° C 및 다양한 신호 분자, 죽음 분자에 보관 균질 서양 얼룩에 의해 측정 할 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는이 논문에서 수행 된 작업의에 대한 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.

여기서, 본래 성숙한 뇌 조직에서 흥분 독성 및 허혈 - 매개 세포 사멸에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 microslices의 생성을위한 시험 관내 기술이 설명된다. 이 기술은 실행 가능한 조직 (1-3 피규어), 즉 큰의 Organotypic 조각 15 대사와 유사하다을 생산하고 있습니다. 또한,이 microslice 모델은 밀접하게 생체 내 10 흥분 독성 매개 뇌 손상 다음과 같은 관찰 된 응답에 해당합니다. AMPA, NMDA 또는 ​​글루타민산 염과 뇌 microslices의 생체 자극에 90 번째는 생체 내 10에있는 폐쇄 90초 기간으로 분자의 다양한 동일한 응답 (예를 들어, CaMKII을, GluN2B 및 GluA1)를 유도한다. 이는 본원에 기재된 microslice 모델 허혈 및 흥분 독성에 관여하는 분자 메커니즘을 조사...

뇌졸중의 가장 일반적인 형태는 대뇌 혈관 폐색 될 때 발생하는 허혈성 뇌졸중이다. 혈액의 흐름 중단 한 결과 조직의 국소 빈혈은 세포막의 탈분극 확산, 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 일으키고, 세포 죽음의 활성화에 이르게 세포 내 칼슘의 지속적인 상승은 1 경로. 이 과정은 &#39;흥분 독성 (excitotoxicity)&#39;라고하고, 스트로크 2 등의 병리의 다양한 의해 생성 된 신경 세포의 죽음에 관련된 일반적인 경로입니다되었습니다. 흥분 독성 및 다른 신경 세포 죽음의 계곡에 관련된 신호 전달 경로의 억제는 뇌졸중 다음 신경 세포의 손상을 제한 할 수있는 매력적인 방법입니다. 동물 전체 시스템을 사용할 때 흥분 독성 (excitotoxicity)과 허혈성 뇌졸중에 관련된 정확한 분자 메커니즘을 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 같은 차 배아와 &#39;신경과 같은&#39;(예를 들어 neuroblasto로엄마와 선암 불후의 선)는 세포 배양 시스템은 자주 사용된다. 이러한 모델의 주요 이점들은, 상대적으로 비용 효과적인 쉽게 조작 할 수 있으며 세포 사멸이 용이하고 정량 측정 할 수 있다는있다. 그러나, 신호 전달 경로는 배양 3,4를 사용 조건 및 미성숙 신경 세포에 의해 변경하고 선이 다른 수용체를 표현하고 뇌 5-8 성숙에 비해 신호 분자 수 불멸 할 수 있습니다. (공 배양 시스템이 사용되는 경우, 또는 2 개)의 손상 뇌 조직이 서로 상호 작용하는 다양한 종류의 세포를 함유하는 이종 반면 또한, 배양 된 신경 세포는 단지 하나의 세포 유형의 검사를 허용한다. Organotypic 슬라이스 배양 시스템 (뇌 조직의 얇은 절편)도 사용되며, 이들이 생체 내에서 발견되는 이러한 모델은 이종의 세포 집단의 연구를 허용한다. 이 기술을 사용하는 경우에는, 조직의 제한된 양 슬라이스는, 각각의 동물로부터 수득 할 수있다한 불후의 세포주로 배양 할, 장기 문화 매체는 슬라이스의 경로와 수용체 신호에 변화가 발생할 수 없습니다. 성숙한 두뇌의 Organotypic 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 반면, 미성숙 뇌에서 슬라이스 문화에 더 많은 의무, 그리고 더 일반적으로 사용된다. 신경 신호 전달 경로를 검사 할 수있는 사용하기 쉬운 그대로 성숙한 뇌, 모방 또는 표현 모델을 개발하기 위해 필요하다. 여기서, 흥분 독성 또는 허혈성 모욕 다음 세포사에 관여 분자 메커니즘을 규명하는 데 사용할 수있는 손상 신경 조직을 포함하는 생체 외 기법을 설명한다. 이 기술은, 실험을 수행하는 데 필요한 동물의 수를 감소 재현이며, 더 큰 슬라이스의 Organotypic 대사 유사한 방식으로 동작 가능한 조직을 생성한다. 또한, 신경 회로, 셀룰러 상호 작용 및 시냅스 콜로라도mpartment 부분적으로 그대로 유지됩니다. 사용되는 생리 버퍼는 셀 &#39;봉인&#39;에 막, 그리고 수 세포가 원래의 막 저항 9를 복구 할 수 있습니다. 이 뇌 조각 모델을 충실하게 흥분 독성 매개 뇌 손상 10 다음 관찰 된 반응을 모방 할 수있다, 뇌졸중에 관련된 분자 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>동물의 목을 베는 데 사용되는</td> <td>단두대</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뇌</td><td>제거 및 해부를 위한 수술</td>장비 <td></td><td></td> 집게, 가위, 핀셋, 등</tr><tr><td>McIlwain 헬리콥터</td><td>McIlwain 헬기는 Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments 및 Ted Pella를 포함한 다양한 회사에서 제조/유통합니다.</td><td></td><td>100-400 &#181을 생성하는 데 사용됩니다. M 뇌 절편.</td></tr><tr><td>라운드 바닥 플라스틱 튜브</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 목욕</td><td></td><td></td><td>조직을 37 &deg로 유지하기 위해; C</td></tr><tr><td>가습기/공기에 쐬는 기구</td><td></td><td></td> 가<td>습한, 산소가 함유된 환경에 있는 microslices를 지키기 위하여 이용</td></tr>되는 <tr><td>편평한 바닥 폴리스티렌 관</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce 균질화기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

같은 뇌 microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

전체 동물 체제를 사용하는 경우 허혈성 뇌졸중과 같은 신경 병리학 적 조건에 관련된 분자 메커니즘을, 검사, 어려울 수 있습니다. 예컨대, 기본 또는 &#39;신경 조의&#39;세포 배양 시스템은 일반적으로 이용된다. 이러한 시스템은 작동 비교적 용이하며, (예컨대 세포사와 같은) 다양한 기능적 결과를 쉽게 정량화 될 수있는 유용한 모델 시스템 (예 흥분 독성 - 매개 세포 사멸 경로 등) 배양 된 미숙 뉴런의 조사 결과와 경로이지​​만 반드시 성숙한 뇌에서 관찰 된 것과 같은, 또는 손상 조직에 없습니다. 따라서, 성숙한 신경 조직의 세포 메커니즘을 조사 할 수있는 모델을 개발할 필요가있다. 우리는 신경 조직 손상의 분자 경로의 다양성을 조사하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 기술을 개발했다. 설명 된 기술은 본 명세서 쥐 대뇌 피질 조직을 활용하지만,이 기술은 조직을 사용하도록 구성 될 수있다또는 뇌 영역 (예를 들어, 해마, 선조체, 등) (예 : 마우스, 토끼, 기니 돼지, 닭 등) 종의 다양 한에서. 또한, 자극 / 치료의 다양한 (예를 들어, 흥분 독성, 억제제의 투여 등)을 사용할 수있다. 결론적으로, 본원에 기재된 뇌 슬라이스 모델 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘의 다양성을 조사 할 수있다.

이 절차를 사용하여 생성 Microslices가 실용적이며, 종의 다양성 (예를 들어, 래트, 마우스, 닭) microslices을 생성하기 위하여 사용될 수있다. 생존의 세 가지 독립적 인 조치를 활용 한 : 호흡 속도 (그림 1), 아데닌 뉴클레오티드 비율 (그림 2), 및 조직의 칼륨 함량 (그림 3). 이러한 방법을 사용하면, microslices 적어도 2 시간 후 생성을 위해 실행 가능한 남아 있다고 입증되었다. 뇌 microslices는 다양한 자극에 따라 다양한 신호 전달 분자를 조사하는데 사용될 수있다 (예 KCl을 탈분극 [도 4], AMPA는 NMDA 글루타메이트 자극 (10)), 또한 여러 뇌 영역 간의 세포 신호 전달 분자의 반응을 비교하기 위하여 사용될 수있다 (그림 4).</str...

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

본 절차의 전체적인 목표는 뇌 미세 절편에 세포독성 자극을 가하여 인비트로(in vitro) 뇌졸중 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 갓 분리한 뇌로부터 미세 절편을 준비합니다. 두 번째 단계는 완만한 교반을 통해 미세 절편을 평형화하는 것입니다.평형 상태에 도달하면, 마이크로 슬라이스는 다양한 실험적 조작을 수행할 준비가 된 것입니다. 최종적으로, 결과에 따르면 마이크로 슬라이스는 생성 후 최소 2시간 동안 생존 가능한 것으로 나타났습니다. 일차 배아 신경세포 배양과 같은 기존의 다른 기술과 비교하여 본 기술의 주요 장점은 성숙한 뇌 조직 슬라이스를 활용한다는 점이며, 이는 한 가지 이상의 세포 유형을 포함하고 있어 온전한 뇌 조직을 더 잘 대표합니다.첫 번째 단계는 신선한 뇌 조직을 얻는 것입니다. 뇌를 소량의 따뜻한 Krebs 완충액에 담급니다. 잔여 피부, 털 또는 혈액을 제거하기 위해, 따뜻한 Krebs 완충액으로 적신 필터 페이퍼 두 장을 사용하여 맥레웨인 초퍼(macle wain chopper)를 준비합니다.준비가 되면 뇌를 초퍼(chopper) 스테이지 위에 올립니다. 뇌가 미끄러지는 것을 방지하기 위해 작업하는 동안 따뜻한 Crebs 완충액으로 뇌와 거름종이를 촉촉하게 유지하십시오. 표면에 액체가 너무 많이 고이지 않도록 주의하십시오.뇌를 250 µm 두께의 관상면 절편으로 자릅니다. 그다음, 스테이지를 90도 회전시켜 250 µm 두께의 시상면 절편을 만듭니다. 이 단계를 거친 뇌 절편을 마이크로 슬라이스(micro slices)라고 합니다.마이크로 슬라이스를 10~15 mL의 따뜻한 Crebs 완충액이 담긴 라운드 바텀 튜브에 넣습니다. 개별 마이크로 슬라이스가 부유할 때까지 튜브를 부드럽게 흔든 다음, 중력에 의해 가라앉을 때까지 기다립니다. 부유하는 세포 잔해로 인해 탁해진 상층액을 조심스럽게 제거하고, 튜브에 10 mL의 신선하고 따뜻한 Crebs 완충액을 추가합니다.세척 과정을 네 번 반복하여 이물질의 대부분을 충분히 제거합니다. 마이크로 슬라이스를 37 °C에서 부드럽게 흔들거나 뒤집어 평형 상태로 만들며, 15분마다 Krebs 버퍼를 교체하여 총 1시간 동안 수행합니다. 이후, 37 °C로 데운 신선한 Krebs 버퍼 2 mL를 첨가하고 15~20개의 마이크로 슬라이스를 바닥이 평평한 폴리스티렌 5 mL 튜브로 옮깁니다.가장자리가 매끄러운 초광구 파이펫 팁을 사용하여, 각

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

여기에서는 비가역적 내피 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제(L-Nio)의 국소 주입에 의해 쥐 백질에서 초점 스트로크를 생성하는 방법론을 제시합니다. 제시된 것은 두 가지 정위 변형, 역행 신경 세포 추적, 그리고 이 기술의 잠재적 응용을 확장하는 새로운 조직 라벨링 및 해부입니다.

축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈에서, 이 조각은 진화하는 간질 같이 사건을 묘사하고 간질 발생의 전 생체 권 모형으로 간주될 수 있습니다. 이 시스템은 자발적인 활동의 역학을 모니터링뿐만 아니라 간질 발생 과정을 통해 신경 염증 기능의 진행을 평가하기위한 훌륭한 도구를 나타냅니다.

라인 피질-해마 오르가노티픽 슬라이스 배양에서 간질 발생의 모델

여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

상기 프로토콜은 뇌척수증-허혈성 뇌 조직의 피알 표면에 혈관 측두근 피판의 이식-모야모야 급성 허혈성 뇌졸중의 치료를 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 혈관신생 증가에 대한 접근법의 효능은 마우스에서 일시적인 중뇌 동맥 폐색 모델을 사용하여 평가됩니다.

마우스에서 중뇌동맥 폐색 유발 뇌졸중 후 뇌근육활막증 치료 모델

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

증거가 축적되고, 그 허혈 (PC) - 뇌에 대한 비 손상 허혈성 도전 - 후속 손상 허혈성 모욕을 과도 전압 보호 기능을 부여. 우리는 C57BL6 / J 생쥐의 일시적인 국소 대뇌 허혈 (중간 대뇌 동맥 폐색, MCAO에 의한)에 초기 허혈 내성 (IT) 유도 컨디셔닝 자극으로 양측 경동맥 폐색 (BCCAO)를 설립했다.

초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

학습하세요 뇌 미세절편을 이용한 흥분독성 매개 뇌손상 연구 방법입니다. 성숙한 뇌조직을 활용하여 신경회로를 보존하고 동물 사용을 최소화하면서 생존성을 2시간 이상 유지하는 체외 뇌졸중 모델을 구축합니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극

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