In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

이 절차의 전반적인 목표는 Jerry W.Shay, Woodring Wright 박사 및 동료들이 설명한 텔로미어 제한 조각 분석 절차의 수정된 버전을 사용하여 진핵 세포의 텔로미어 길이를 결정하는 것입니다. 텔로미어 길이에 대한 데이터를 제공함으로써 이 절차는 세포 생물학, 행동 의학, 역학 및 전염병, 노화, 스트레스, 약물 치료 및 감염의 영향에 대한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 세포에서 평균 텔로미어 길이의 킬로 베이스로 직접 측정을 제공한다는 것입니다.

분석할 게놈 DNA 샘플은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 추출했습니다. 20-40 마이크로리터의 최종 부피에서 게놈 DNA의 분해를 수행합니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 다음을 결합하십시오.3마이크로그램의 게놈 DNA; 10x DNA 분해 완충액; Rsa1 제한 효소 1 마이크로 리터; Hinf1 제한 효소 1 마이크로 리터; 및 멸균 된 탈 이온수를 최종 부피까지.

모든 구성 요소가 튜브 바닥에 있는지 확인하기 위해 잠시 원심분리기를 사용합니다. 소화액을 섭씨 37도에서 최소 16시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 0.6% 아가로스 용액을 준비하여 이 절차를 시작합니다.

겔 주조를 위한 겔 전기영동 시스템을 준비합니다. 엔드 게이트를 젤 주조 트레이에 부착합니다. 아가로스 젤 용액이 섭씨 50도로 냉각되면 젤 주조 트레이에 붓고 겔에 콘을 넣은 다음 실온에서 뚜껑을 덮지 않은 상태에서 45분 동안 겔이 굳어지도록 합니다.

주조 트레이에서 엔드 게이트를 제거하고 젤에서 빗을 제거합니다. 겔 전기영동 시스템을 전기영동 버퍼로 충전 라인에 채워 겔이 버퍼에 완전히 잠기도록 합니다. 겔의 웰에 DNA 샘플을 로드하고 샘플 사이에 빈 웰을 남겨둡니다.

10마이크로리터의 DNA ladder를 젤의 반대쪽 끝에 있는 웰에 추가합니다. 30분 동안 150볼트에서 겔 전기영동을 실행하여 DNA를 겔로 빠르게 이동합니다. 30분 후 전압을 57볼트로 조정하고 18-24시간 동안 실행합니다.

젤이 18 24 시간 동안 달린 후에, elecctrophoresis 근원을 끄고 elecctrophoresis 완충액에서 젤을 가진 젤 주물 쟁반을 제거하십시오. 젤의 방향에 대한 참조 역할을 하기 위해 젤의 오른쪽 상단 모서리를 얇게 썰어줍니다. 여과지 조각을 젤보다 약간 큰 크기로 자릅니다.

주조 트레이의 젤 위에 여과지를 놓고 종이가 젤의 여분의 용액을 흡수하도록 합니다. 여과지와 젤 사이의 기포를 조심스럽게 제거하고 피펫을 롤러 역할로 사용하여 측면을 통해 기포를 짜냅니다. 종이가 젤 아래에 오도록 젤과 여과지를 뒤집어 주조 트레이에서 젤을 제거합니다.

여과지가 있는 젤을 젤 건조기로 옮기고 젤을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 피펫을 롤러 역할을 하여 플라스틱 랩과 젤 사이의 모든 기포를 제거합니다. 젤을 섭씨 50도에서 2시간 동안 건조시킵니다.

젤이 마르면 플라스틱 랩을 제거하고 젤과 여과지를 250ml의 탈이온수가 들어 있는 유리 접시에 옮깁니다. 여과지를 조심스럽게 제거하고 실온에서 15분 동안 젤을 배양합니다. 12 x 12인치 나일론 메쉬 위에 젤을 놓습니다.

나일론 메쉬와 젤을 함께 굴려 젤이 자체에 닿지 않도록 합니다. 메쉬와 젤을 혼성화 튜브에 넣습니다. 100ml의 5x SSC와 12마이크로리터의 녹색 형광 핵산 염색을 결합하고 혼성화 튜브에 넣습니다.

섭씨 42도에서 30분 동안 교잡 오븐에서 회전하며 배양합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호하십시오. 30분 후 혼성화 튜브에서 나일론 메쉬와 젤을 제거합니다.

굴러서 250ml의 탈이온수가 담긴 유리 접시에 평평하게 놓습니다. 나일론 메쉬를 부드럽게 제거합니다. 표시된 설정으로 인광미판을 사용하여 젤을 이미지화합니다.

방사능 텔로미어 프로브를 방사능 취급 시설의 규정에 따라 준비합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브에서 다음을 결합하십시오 : 텔로미어 프로브의 2 마이크로 리터; 2.5 마이크로 리터의 10x 폴리 뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액; P32로 감마 인산염 그룹에 표시된 ATP에 3 마이크로 리터; 4 마이크로 리터의 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제; 및 DNase가 없는 멸균 탈이온수를 최종 부피 20마이크로리터까지 추출합니다. 튜브를 간단히 원심분리합니다.

튜브를 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 잠시 원심분리하고 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 반응을 멈춥니다. 준비된 G25 크로마토그래피 컬럼에 방사성 프로브 용액을 로드하고 700배 g에서 2분 동안 원심분리합니다.

방사성 텔로미어 프로브를 포함하는 여과액을 저장합니다. 젤을 250ml의 변성 용액이 담긴 유리 접시에 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 변성 용액을 제거하고 250ml의 멸균 탈이온수로 교체하십시오.

실온의 오비탈 쉐이커에서 10분 동안 배양합니다. 탈이온수를 제거하십시오. 250ml의 중화 용액으로 대체하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

젤을 나일론 메쉬로 굴려 혼성화 튜브에 넣습니다. 혼성화 용액 20ml를 넣고 섭씨 42도의 혼성화 오븐에서 10분 동안 교대로 배양합니다. 10분 후 혼성화 용액을 제거하고 20ml의 새 혼성화 용액으로 교체하십시오.

텔로미어 프로브 전체를 추가하고 섭씨 42도의 혼성화 오븐에서 하룻밤 동안 회전하면서 배양합니다. 텔로미어 프로브를 사용한 혼성화가 완료되면 혼성화 튜브에서 젤과 메쉬를 제거하고 250ml의 2x SSC가 들어 있는 유리 접시에 넣습니다. 접시에서 나일론 메쉬를 펴서 제거합니다.

유리 접시를 오비탈 셰이커에 놓고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 2x SSC를 제거하고 250ml의 0.1x SSC와 0.1% SDS 용액으로 교체한 다음 실온의 오비탈 쉐이커에서 15분 동안 배양합니다. 0.1x SSC와 0.1% SDS 솔루션을 제거합니다.

250 ml의 2x SSC로 교체하고 오비탈 쉐이커에서 15분 더 배양합니다. 2x SSC에서 젤을 제거하고 젤을 플라스틱 랩으로 감쌉니다. 젤과 플라스틱 랩 사이의 모든 거품과 공기 주머니를 제거합니다.

형광체 스크린이 있는 노출 카세트에 젤을 넣고 형광체 스크린을 밤새 젤에 노출시킵니다. 다음 날에는 형광체 이미저를 사용하여 노출된 형광체 스크린을 이미지화합니다. 형광체 이미지는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 텔로미어 길이 정량화에 이후에 사용됩니다.

불멸화된 인간 포피 섬유아세포 세포주와 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 분리된 3가지 농도의 DNA를 텔로미어 길이에 대해 분석했습니다. 녹색 형광 핵산 염색으로 염색된 건조된 아게로즈 겔의 이 형광체 이미지는 1열과 8번째 열에서 DNA 사다리 띠의 위치를 보여줍니다. 겔 상단에서 각 분자량 표준물질까지 측정된 거리는 파란색 화살표로 표시됩니다.

텔로미어 프로브를 사용한 교잡 후 텔로미어 띠는 각 레인에서 번짐으로 나타납니다. 150개의 상자로 구성된 그리드는 각 레인과 하나의 배경 레인에 대해 계산되었습니다. 각 샘플 세트에 대해 선택한 분석 영역이 표시됩니다.

각 샘플 세트에 대해 B로 표시된 별도의 배경 레인을 선택하여 각 샘플 세트에 대해 배경 강도가 유사한지 확인했습니다. 평균 텔로미어 길이 계산은 인간 말초 혈액 단핵 세포보다 불멸화 세포주에서 평균 텔로미어 길이가 더 높다는 것을 보여주었습니다. 이러한 결과는 또한 각 레인에서 분석된 게놈 DNA의 양이 혼성화 후 검출 가능한 신호를 얻는 데 중요하다는 것을 보여줍니다.

이 기술을 마스터하면 2 1/2일에 걸쳐 12시간 동안 수행할 수 있으며, 제대로 수행되면 두 번의 하룻밤 배양을 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 샘플에 대해 최소 3마이크로그램의 DNA를 사용하고 각 샘플을 중복하여 측정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 노화 분야의 연구자들이 인간을 포함한 다양한 동물 종에서 텔로미어 길이를 유지하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 텔로미어 자체의 평균 길이를 직접 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 방사능으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.