Name: In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 학습하세요 수정된 TRF 분석법으로 진핵세포의 텔로미어 길이를 정량하는 방법을. 방사성 표지 프로브를 이용한 in-gel 하이브리드화로 신호 강도를 높이고 DNA 손실을 최소화하여 세포 노화 및 분자생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 부분적으로 P30CA047904 상을 수상한 Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral 종양학 공유 시설의 지원을 인정합니다.

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
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<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
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<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
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<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
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<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

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전기 영동 후 게놈 DNA 번짐은 800 bp보다 높습니다. 이는 제한 효소가 결함이거나 추가 효소 (위에서 설명한 바와 같음)가 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 두 번째 가능한 설명은 단백질이 여전히 DNA에 붙어 있다는 것입니다. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정 할 때 260/280 비율은 약 1.8이어야합니다. 이 비율이 &lt;1.5 인 경우 제한 효소 소화를 방해 할 수있는 단백질 오염이 있습니다. DNA 샘플을 재조직해야하거나 proteinase K 분해 및 페놀 : 클로로포름 추출 후 에탄올 침전으로 단백질을 제거해야합니다. 상업적 DNA 단리 키트의 사용은 일상적으로 1.8-2.85의 260/280 비율의 DNA를 생성합니다. 형광체 스크린에 젤이 노출 된 후에는 텔로미어 조각이 검출되지 않습니다. 이것은 가난한 라디오 라벨 텔로미어 프로브, 부적절한 하이브리드 화조건 또는 불충분 한 양의 게놈 DNA 시작. 텔로미어 프로브를 준비 할 때, G-25 컬럼의 ...

텔로미어 (telomeres)는 염색체의 말단에 위치하고 있으며, 세포 유전 정보를 보호하는 데 중요한 역할을하는 TTAGGG (인간 염색체상의 서열)의 뉴클레오타이드 반복 서열이다 3 , 4 , 5 . 텔로미어는 수천 개의 염기쌍으로 DNA 복제 중에 나머지 염색체의 무결성을 보호하는 역할을합니다. 염색체 복제가 완벽하지 않아서 염색체의 끝이 완전히 복사되지 않습니다. 이러한 복제의 비효율은 &quot;최종 복제 문제&quot;로 불리고 각 복제 라운드 동안 일부 텔로미어 반복을 잃게됩니다 6 , 7 . 텔로미어 길이는 잃어버린 텔로미어 서열 8 , 9 를 대체하는 효소 인 텔로 머라 아제에 의한 세포 분열 이후에 회복 될 수있다. 그러나, 텔로 머라 아제는결과적으로, 시간이 지남에 따라 텔로미어는 짧아지고 결국 세포 노화가 일어난다. 텔로미어 단축으로 인해 텔로미어는 노화와 노화 관련 질병의 위험성을 나타내는 바이오 마커로 간주됩니다 11,12 . 또한 텔로미어 길이는 유전 적, 환경 적, 생활 양식의 요인 및 산화 스트레스와 같은 다른 자극에 영향을 받아 텔로미어 길이가 독성학, 역학 및 행동 연구에서 바이오 마커 역할을 할 수 있음을 나타냅니다 13 , 14 , 15 . 이 기사는 Mender and Shay 2 와 Kimura et al.이 채택한 modified terminal restriction fragment (TRF) 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하는 기술을 설명합니다 . 16 , Herbert, Shay 및 Wrig와 비슷하다.ht 1 과 Haussmann과 Mauck 17 . 전통적으로, TRF 분석은 서던 블롯 절차를 포함합니다. 서던 블롯은 텔로미어 길이를 연구하기위한 &quot;금 표준&quot;으로 간주되며 역학 연구에서 백혈구 텔로미어 길이를 검사하는데 적극적으로 사용됩니다 18 . 이 TRF 분석은 텔로미어 반복을 남겨두고 소화 된 게놈 DNA를 사용합니다. 그런 다음 DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하고 변성시키고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮긴다. 텔로미어 서열은 텔로미어 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화된다. 분리 된 텔로미어를 멤브레인으로 옮기는 대신, 다른 TRF 기술은 DNA 변성의 유무에 관계없이 in-gel hybridization 기술을 사용합니다. 변성의 포함은 일부 종 19 에서보고 된 간질 텔로미어의 검출을 고려할 때 중요합니다. 변성 단계가없는 절차는 th단일 가닥 DNA는 말단 텔로미어에서 오버행하고 간질 텔로미어 서열 18 에는 결합하지 않을 것이다. TRF 분석 외에도 텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. Flow-FISH 기술은 유동 세포 계측법을 사용하여 별개의 세포 유형의 개별 세포의 평균 텔로미어 길이를 측정 할 수 있습니다 16 , 20 . Flow-FISH는 자동화를 통해 텔로미어에 고도로 특화된 프로브를 정확하게 표기하고 사람의 실수를 줄이는 한편 비용이 많이 들고 효율적이지 않으며 신선한 샘플과 숙련 된 기술자가 필요하기 때문에 전염병 연구에 대한 능력이 제한됩니다 16 . 또한,이 방법은 세포 집단의 염색체 수의 잠재적 변화를 설명하지 못한다. 또 다른 기술인 qPCR은 전염병 연구를위한 텔로미어 길이를 측정하는 수단으로 널리 받아 들여지고있다 <sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16은 다른 방법에 비해 적은 양의 DNA에 대한 높은 처리량, 저비용 및 요구 조건 때문에 발생합니다. 그러나, qPCR은 단일 복사 유전자에 비례하여 평균 텔로미어 DNA 함량만을 측정 할 수 있으며, 따라서 평균 텔로미어 길이의 간접적 인 추정치이다. 또한 남부 연구와 비교하여 비교 연구에서 높은 변동 계수를 산출하여 의심스러운 정확도 21로 이어진다. 재단 절차에는 일부 연구에 대한 사용을 제한하는 자체 결함이 있습니다. TRF 기술은 다른 방법에 비해 많은 양의 DNA가 필요합니다 (시료 당 2 ~ 3 μg). 이것은 충분한 게놈 DNA가 수집 될 수 있고 분해 된 DNA 샘플에는 사용할 수없는 임상 샘플의 텔로미어 길이를 검사하는 기술의 적용을 제한합니다. 또한, TRF 분석은 값 비싸고 노동 집약적이어서 결과를 산출하는 데 4-5 일이 걸립니다. 그러나 TRF는 낮은 변동 계수를 산출합니다.재현성을 부여합니다. 이 프로토콜은 기존의 Southern blot ( in situ gel hybridization을 사용)과 다르지만, 두 기술은 근본적으로 같습니다. 여기에 제시된 기술은 Southern blot과 in-gel hybridization의 조합입니다. Southern blots의 DNA 변성 단계를 in-gel hybridization과 관련 짓습니다. 이 조합은 서던 블롯에 비해 향상된 프로브 신호 강도의 추가 이점을 가지며 우리 연구실 내에서 지속적으로 정량화 가능한 결과를 산출했습니다. 또한 화학 발광 탐침보다 방사능 탐침을 사용하면 신호 강도가 높아지며 phosphorimager로 시각화 및 정량화가 가능하여 사용자 친화적 인 TRF 분석이 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, 제한 효소</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, DNA 분해.&nbsp; Cutsmart Buffer (소화 완충액)</td></tr><tr><td>Hinf1, 제한 효소</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, DNA 소화가 포함되어 있습니다. Cutsmart Buffer (소화 버퍼)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>전기영동 등급 아가로스</td></tr><tr><td>Optikinase가 포함되어 있습니다&nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td></tr><tr><td>SYBR 녹색 핵산 얼룩 I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드</td></tr><tr><td>감마-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>방사성 동위원</td></tr>소 <tr><td>Qiagen 혈액 및 세포 배양 DNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>DNA 추출 키트</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>readioactive oligo probe</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>비이온 합성 고분자</td></tr> <tr><td>정제용Equipment/Software </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 Gel 전기영동 시스템(20cm x 25cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Gel 전기영</td></tr>동 <tr><td>Horizon 11.4 Gel 전기영동 시스템(11cm x 14cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Gel 전기영</td></tr>동 <tr><td>나일론 메쉬, 50, 12" x 12"</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE 스토리지 형광체 스크린</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>형광체 스크린 노출 카세트</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 하이브리드화 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>원통형 하이브리드화 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer 오비탈 쉐이커</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>오비탈 셰이커</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>젤 및 형광체 스크린 이미징용</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>버전 6.05</td><td>그래프 프로그램</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>스프레드시트 프로그램</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>분광광도계</td></tr></tbody></table>

in-gel hybridization을 이용한 telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. 전통적인 접근 방법 인 Telomere Restriction Fragment (TRF) 분석법은 게놈 DNA 샘플을 제한 효소로 소화시켜 텔로미어 DNA 반복 및 일부 서브 텔로미어 DNA를 남기는 DNA 하이브리드 화 기술을 사용합니다. 이들은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되고, 필터 멤브레인으로 옮겨지고, 화학 발광 또는 방사능으로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화되어 텔로미어 제한 단편을 시각화한다. 이 접근법은 PCR과 같은 다른 기술보다 많은 양의 DNA를 필요로하지만 세포 집단의 텔로미어 길이 분포를 측정 할 수 있으며 절대 킬로베이스로 표현 된 측정을 허용합니다. 이 원고는 텔로미어 길이를 결정하기위한 수정 된 DNA 하이브리드 화 과정을 보여줍니다. 게놈 DNA는 먼저 제한 효소 (절단하지 않는 게놈텔로미어), 아가 로스 겔 전기 영동으로 분리 하였다. 이어서, 겔을 건조시키고 DNA를 변성시키고 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 에 인 시츄 하이브리드 화시킨다. 이 in situ 하이브리드 화는 텔로미어 DNA의 손실을 피하고 신호 강도를 향상시킵니다. 하이브 리다이 제이션 후에, 겔은 형광체 스크린을 이용하여 영상화되고, 텔로미어 길이는 그래프 프로그램을 사용하여 정량화된다. 이 절차는 Drs의 실험실에서 개발되었습니다. Woodring Wright와 Jerry Shay는 텍사스 대학교 남서부 대학교 1 학년 2 학년입니다. 여기에서는 몇 가지 수정 사항을 포함하여이 절차에 대해 자세히 설명합니다.

세포주 BJ-hTERT (telomerase immortalized human foreskin fibroblasts)와 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 분리 된 3 가지 농도의 DNA (1, 2 및 3μg)를 텔로미어 길이에 대해 분석 하였다. 표 1 은 각 DNA 샘플의 레인 할당을 보여줍니다. 그림 1 은 젤의 핵산 형광 얼룩을 보여줍니다. 분자량 표준이 명확하게 나타납니다. 겔 상단에서 각 분자량 표준까지의 거리를 측정했습니다 ( 그림 2 ). 도 3 은 텔로미어 프로브와의 하이브리드 화 후의 겔의 인산 사진을 도시한다. 텔로미어 밴드는 각 차선에 얼룩으로 표시됩니다. 150 레인의 그리드가 각 레인과 배경 레인에 대해 계산되었습니다 ( <strong class...

이 기사에서는 텔로미어 길이의 신속하고 효율적인 직접 측정을 제공하는 수정 된 터미널 제한 단편 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하기위한 자세한 프로토콜을 논의합니다. 이 기술은 텔로미어 길이를 정량화하기 위해 DNA의 다양한 세포 공급원에 적용될 수 있습니다.

In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

본 절차의 전반적인 목표는 Jerry W. Shay 박사, Woodring Wright 박사 및 동료들이 설명한 텔로미어 제한 단편 분석 절차의 수정된 버전을 사용하여 진핵 세포의 텔로미어 길이를 결정하는 것입니다. 텔로미어 길이에 대한 데이터를 제공함으로써, 본 절차는 세포 생물학, 행동 의학, 역학 및 감염성 질환뿐만 아니라 연령, 스트레스, 약물 치료 및 감염의 영향에 관한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 세포에서 평균 텔로미어 길이를 kb 단위로 직접 측정할 수 있다는 점입니다.분석할 genomic DNA 샘플은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 추출하였습니다. 최종 부피 20 ~ 40 µL로 genomic DNA 소화를 수행합니다. 각 마이크로원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합합니다: genomic DNA 3 µg, 10x DNA digest buffer, Rsa1 제한 효소 1 µL, Hinf1 제한 효소 1 µL, 그리고 최종 부피까지 멸균 탈이온수모든 성분이 튜브 바닥에 모이도록 짧게 원심 분리합니다. 소화 반응물을 37 °C에서 최소 16시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 0.6% agarose 용액을 준비하여 이 절차를 시작하십시오.겔 제작을 위해 겔 전기영동 시스템을 준비합니다. 겔 캐스팅 트레이에 엔드 게이트를 부착합니다. 아가로스 겔 용액이 50 °C로 식으면 겔 캐스팅 트레이에 붓고, 겔에 콘을 배치한 후 덮개를 덮지 않은 상태에서 실온에 45분 동안 두어 겔을 굳힙니다.캐스팅 트레이에서 엔드 게이트를 제거하고, 젤에서 콤을 제거합니다. 젤 전기영동 시스템의 표시선까지 전기영동 완충액을 채워 젤이 완충액에 완전히 잠기도록 합니다. 샘플 사이에 빈 웰을 하나씩 두어 젤의 웰에 DNA 샘플을 로딩합니다.겔의 양 끝단 웰에 DNA ladder 10 µL를 넣습니다. DNA가 겔 내부로 빠르게 이동하도록 150 V에서 30분 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 30분 후, 전압을 57 V로 조정하여 18~24시간 동안 수행합니다.겔을 18~24시간 동안 전기영동한 후, 전기영동 전원 장치를 끄고 전기영동 버퍼에서 겔이 담긴 겔 캐스팅 트레이를 꺼냅니다. 겔의 방향을 확인하는 기준점으로 삼기 위해 겔의 오른쪽 상단 모서리를 잘라냅니다. 필터 페이퍼를 겔보다 약간 더 큰 크기로 자릅니다.캐스팅 트레이에 담긴 젤 위에 필터 페이퍼를 올리고, 페이퍼가 젤 위의 과잉 용액을 흡수하도록 둡니다. 피펫을 롤러처럼 사용하여 기포를 측면으로 밀어내며 필터 페이퍼와 젤 사이의 기포를 조심스럽게 제거합니다. 젤과 필터 페이퍼를 뒤집어 페이퍼가 젤 아래에 오도록 하여 캐스팅 트레이에서 젤을 분리합니다.필터 페이퍼와 함께 젤을 젤 건조기로 옮기고, 젤 표면을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 피펫을 롤러처럼 사용하여 플라스틱 랩과 젤 사이의 모든 기포를 제거합니다. 50 °C에서 2시간 동안 젤을 건조합니다.겔이 마르면 플라스틱 랩을 제거하고 겔과 여과지를 250 milliliters의 탈이온수가 담긴 유리 접시로 옮깁니다. 여과지를 조심스럽게 제거한 후, 겔을 상온에서 15분 동안 배양합니다. 겔을 12 by 12 inch 나일론 메쉬 위에 올려놓습니다.나일론 메쉬와 겔이 서로 겹치지 않도록 주의하며 함께 말아줍니다. 말아놓은 메쉬와 겔을 하이브리다이제이션 튜브에 넣습니다. 5x SSC 100 milliliters와 녹색 형광 핵산 염색액 12 microliters를 혼합하여 하이브리다이제이션 튜브에 넣습니다.회전 기능이 있는 하이브리다이제이션 오븐에서 42 °C로 30분 동안 배양합니다. 용액이 빛에 노출되지 않도록 차단하십시오. 30분이 지나면 하이브리다이제이션 튜브에서 나일론 메쉬와 겔을 꺼냅니다.말아놓은 것을 펼쳐 250 milliliters의 탈이온수가 담긴 유리 접시에 평평하게 놓습니다. 나일론 망을 조심스럽게 제거합니다. 지정된 설정으로 포스포이미저(phosphorimager)를 사용하여 겔의 이미지를 촬영합니다.방사성 물질 취급에 관한 시설 규정에 따라 방사성 텔로미어 프로브를 준비합니다. 마이크로원심분리 튜브에 다음 성분들을 혼합합니다: 텔로미어 프로브 2 µL, 10x 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 버퍼 2.5 µL, 감마 인산기에 P32로 표지된 ATP 3 µL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 4 µL, 그리고 최종 부피가 20 µL가 되도록 DNase-free 멸균 탈이온수를 추가합니다. 튜브를 짧게 원심분리합니다.튜브를 37 °C 항온수조에서 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 짧게 원심분리한 후, 65 °C에서 20분 동안 배양하여 반응을 중단시킵니다. 준비된 G25 크로마토그래피 컬럼에 방사성 프로브 용액을 로딩하고, 700 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다.방사성 텔로미어 프로브가 포함된 여과액을 보관하십시오. 겔을 250 milliliters의 변성 용액(Denaturing Solution)이 담긴 유리 접시에 넣고 상온에서 15분 동안 배양하십시오. 변성 용액을 제거하고 250 milliliters의 멸균 탈이온수로 교체하십시오.실온의 오비탈 셰이커에서 10분 동안 배양합니다. 탈이온수를 제거합니다. 이를 250 milliliters의 중화 용액으로 교체하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.젤을 나일론 메쉬로 말아 하이브리다이제이션 튜브에 넣습니다. 하이브리다이제이션 용액 20 milliliters를 추가하고, 회전 장치가 있는 하이브리다이제이션 오븐에서 42 degrees Celsius로 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 하이브리다이제이션 용액을 제거하고 새로운 하이브리다이제이션 용액 20 milliliters로 교체합니다.텔로미어 프로브 전량을 첨가하고, 회전 기능이 있는 하이브리드화 오븐에서 42 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 텔로미어 프로브와의 하이브리드화가 완료되면 하이브리드화 튜브에서 겔과 메시를 꺼내어 250 mL의 2x SSC가 담긴 유리 접시에 넣습니다. 접시에서 나일론 메시를 풀어서 제거합니다.유리 디쉬를 오비탈 쉐이커에 놓고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 2x SSC를 제거하고 0.1x SSC 및 0.1%SDS 용액 250 milliliters로 교체한 후, 오비탈 쉐이커를 이용하여 실온에서 15분 동안 배양합니다. 0.1x SSC 및 0.1%SDS 용액을 제거합니다.2x SSC 250 milliliters로 교체하고 궤도 쉐이커에서 15분 더 배양합니다. 2x SSC에서 겔을 꺼내어 플라스틱 랩으로 감쌉니다. 겔과 플라스틱 랩 사이의 모든 기포와 공기 주머니를 제거합니다.겔을 인광 스크린이 포함된 노출 카세트에 넣고, 인광 스크린을 겔에 하룻밤 동안 노출시킵니다. 다음 날, 인광 이미저를 사용하여 노출된 인광 스크린을 촬영합니다. 촬영된 인광 이미지는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 텔로미어 길이 정량화에 사용됩니다.불멸화된 인간 포피 섬유아세포 세포주와 인간 말초 혈액 단핵구에서 분리한 세 가지 농도의 DNA를 대상으로 텔로미어 길이를 분석하였습니다. 녹색 형광 핵산 염색약으로 염색하여 건조시킨 아가로스 겔의 이 인광 이미지에서는 1번과 8번 레인의 DNA 래더 밴드 위치를 보여줍니다. 겔 상단에서 각 분자량 표준물질까지 측정된 거리는 파란색 화살표로 표시되어 있습니다.텔로미어 프로브로 하이브리드화를 수행한 후, 각 레인에서 텔로미어 밴드가 스미어 형태로 나타납니다. 각 레인과 배경 레인 하나를 포함하여 150개의 박스로 구성된 그리드를 계산하였습니다. 각 샘플 세트에 대해 선택된 분석 영역이 표시되어 있습니다.각 샘플 세트의 배경 강도가 유사한지 확인하기 위해, B로 표시된 별도의 배경 레인을 각 샘플 세트마다 선택하였습니다. 평균 텔로미어 길이 계산 결과, 불멸화 세포주가 인간 말초혈액 단핵구보다 더 긴 평균 텔로미어 길이를 나타냈습니다. 또한 이러한 결과는 하이브리드화 이후 검출 가능한 신호를 얻기 위해 각 레인에서 분석하는 게놈 DNA의 양이 매우 중요하다는 것을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 2박 3일에 걸쳐 총 12시간 동안 진행할 수 있으며, 두 번의 하룻밤 배양이 필요합니다. 이 절차를 시도할 때, 각 샘플당 최소 3 µg의 DNA를 사용하고 각 샘플을 이중으로 측정해야 함을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발 이후, 노화 분야의 연구자들은 인간을 포함한 다양한 동물 종에서 텔로미어 길이를 유지하는 데 관여하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 영상을 시청한 후, 텔로미어 자체의 평균 길이를 직접 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 방사성 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복과 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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