Name: 인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 인간 TERT의 RNA 의존 RNA 중합효소 활성을 반정량적으로 검출하는 방법입니다. HeLa 세포를 이용한 면역침전법과 효소 반응을 통해 RdRP 활성을 분석하고 RNA 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품 일부에 의해 지원 되었다 프로젝트 암 치료제 (P-직접) (K.M. 15cm0106102h0002) 및 프로젝트에 혁신적인 연구 개발에 대 한 암 연구 및 치료 진화 (P-만들기) (16 cm 01061150001, K.M.) 일본 기관에서 의료 연구 및 개발, 아메드; 다케다 과학 재단 (사원); 부여 공주 다카마쓰 암 연구 기금 (13-24520, 사원); 그리고 JSP KAKENHI 보조금 번호 JP16K07133 (사원).

1. 시 약 설치
<ol><li>
셀 동기화에 사용 하는 시 약
	<ol>
<li>2.5 m m 티 미 딘을 포함 하는 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)를 생성 하려면 125 m m 티 미 딘 준비 조직 문화 학년 물 1 mL 당 티 미 딘의 30.28 mg을 디졸브. 여과 0.22 μ m 주사기 필터 장치 솔루션. DMEM 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완의 50 mL 당 갓된 125 m m 티 미 딘 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>Nocodazole의 0.1 μ g/mL를 포함 된 DMEM을 생성 하기 위해 디 메 틸 sulfoxide 5 μ g/μ nocodazole 준비를 (DMSO)에 nocodazole 분해. 추가 5 µ g의 1 µ L / µ L nocodazole DMEM의 50 mL 당 10% (vol/vol) FBS 보충.</li>
		<li>DMEM 포함 된 DMSO의 0.002% (vol/vol)를 생성 하려면 DMEM 10% (vol/vol) FBS와 보충의 50 mL 당 DMSO의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IP RdRP 분석 결과 대 한 사용 시 약
	<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 a: 150 m m NaCl, 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 준비 및 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>아세테이트 버퍼 x 5를 준비: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.8), 500mm 칼륨 아세테이트 및 20 m m MgCl2. 실 온에서 시 약 저장.</li>
		<li>워시 버퍼 1: 1 x 아세테이트 버퍼, 글리세롤 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) 트라이 톤 X-100 0.06 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일, ethylenediamenetetraacetic 산 (EDTA) 준비-무료. 사용의 일 또는 사용 하기 전에 하루에 워시 버퍼 1을 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>AGC 솔루션 준비: 아세테이트 버퍼, 10% (vol/vol) 글리세롤과 0.02% (wt/vol) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (챕). 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>2mm CaCl2를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면 1 M CaCl2 AGC 솔루션 50 mL 당 100 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>3mm 에틸렌 글리콜 bis (b-aminoethylether)를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), AGC 솔루션 50 mL 당 0.4 M EGTA (pH 7.5)의 375 µ L 추가. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>워시 버퍼 2: 1 x 아세테이트 버퍼와 0.02% (wt/vol) 챕 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>HMD 솔루션 준비: 0.2 M HEPES-코 (pH 7.8), 40 m m MgCl2 와 2 mM dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 시 약 저장 참고: HMD 솔루션 3 개월에서 이상 갱신 수 한다.</li>
		<li>가수분해 K 버퍼 x 2 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). -20 ° c.에 시 약 저장</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2 준비: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 오렌지 G. 저장-20 ° c.에 시 약</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. HeLa 세포의 준비
참고: 준비 HeLa 세포 mitotic 단계 (조작) 또는 비동기적으로 나누어 동기화 (unmanipulated). 37 ° c.에 5% CO2 의 셀 문화
<ol><li>
헬러 세포 유사 분열에서의 동기화
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>이틀 후 도금, 2.5 m m 티 미 딘 및 10% (vol/vol) FBS DMEM의 10 mL 매체를 바꿉니다. 24 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>세 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (-)의 10 mL로 세포 세척 하 고 10% (vol/vol) FBS 6 h에 대 한 포함 된 DMEM의 10 mL로 세포 문화.</li>
		<li>Nocodazole의 10% (vol/vol) FBS, 0.1 µ g/mL를 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>부드럽게, 문화 접시를 흔들어 하 고 분리 mitotic 세포를 포함 하는 상쾌한을 검색 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Unmanipulated HeLa 세포의 준비
	<ol>
<li>플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께.</li>
		<li>도금, 후에 2 일 10 mL의 10% (vol/vol) FBS 포함 된 DMEM 매체를 바꿉니다. 문화 30 h 세포.</li>
		<li>0.002% (vol/vol) DMSO 10% (vol/vol) FBS, 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화.</li>
		<li>Trypsinization 1 mM EDTA를 포함 하는 트립 신 (2.5 g/L)의 0.7 mL을 사용 하 여 셀을 수집 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제. 참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP RdRP 분석 결과
<ol><li>단백질 A agarose 구슬 준비
	<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 선호도 수 지의 1 mL (침대 볼륨 500 µ L)를 전송. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬, 하의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총 세 세척)를 반복 합니다.</li>
		<li>구슬에의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L를 추가, 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 회전 통에 4 ° C에서 튜브 하룻밤 (또는 적어도 4 h) 회전 합니다.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 튜브 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>구슬에 세포의 용 해 버퍼 A의 500 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° c.에 구슬 저장</li>
	</ol></li>
	<li>세포 lysate의 준비
	<ol>
<li>(선택 사항) 셀 2 단계에서 고정 되어 셀 느슨하게 될 때까지 얼음에 냉동된 세포를 녹여 놓고.</li>
		<li>셀 10 mL의 PBS (-)을 한 번 씻어. 1450 x g 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>부드러운 pipetting으로 얼음 세포의 용 해 버퍼의 세포의 용 해 버퍼 A 1 x 107 셀의 당 (1 mL)으로 세포를 lyse.</li>
		<li>다음 조건; 1.5 mL 튜브에 샘플을 sonicate 25%는 sonicator의 증폭을 설정 하 고 10 sonicate s.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 20400 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>상쾌한을 수집 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 1 mL를 각각을 전송 합니다. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation
	<ol>
<li>사전 취소 단계의 3.2.6 lysate 40 µ L (구슬 볼륨 20 µ L)를 추가 하 여은 lysate의 1 mL 당 prewashed 단백질 A agarose 구슬의. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 30 분에서 4 ° c.에 대 한 샘플을 회전</li>
		<li>13000 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 샘플 원심 고 복구는 상쾌한.</li>
		<li>40 µ (침대 볼륨 20 µ L) L prewashed 단백질 A agarose 구슬 및 안티 인간 TERT 항 체의 10 µ g의 추가 (복제: 10E9-2)8 에 사전 허가 lysate. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 밤에 4 ° C에서 샘플을 회전.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 1 구슬: 구슬에 워시 버퍼 1의 1 mL을 추가, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 3 추가 시간이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>AGC 솔루션 2mm CaCl2를 포함 하는 구슬 한번 세척: AGC 솔루션 2mm CaCl2 구슬에 포함 된의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Micrococcal nuclease (MNase)와 구슬 치료: 표 1에 설명 된 MNase 반응 혼합물을 준비. 부드러운 pipetting으로 구슬 MNase 반응 혼합물의 60 µ L에서 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 25 ° c.에 15 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에 참고: 기복이 셰이 커를 사용 하 여이 단계에서 속도 제한에 따라 엄격 하 게 매우 중요 하다. 동영상, 회전 믹서 등의 다른 유형을 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>구슬 3mm EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션 두 번 세척: 구슬 3 m m EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>워시 워시 버퍼 2 한번 구슬: 워시 버퍼 2의 1 mL를 추가구슬, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 하 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. RdRP 반응을 설정 하는 동안 얼음에 비즈를 유지. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RdRP 반응
	<ol>
<li>표 2에 설명 된 대로 새로운 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>[Α-32P]의 6 µ L 추가 UTP (3000 Ci/mmol) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: [α-32P] ATP, [α-32P] CTP, 또는 [α-32P] GTP [α-32P] 대신 반응에 사용 될 수 있다 광섬유.</li>
		<li>템플릿 RNA의 1 µ L를 추가 (1 µ g / µ L) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합. 참고: 설정 하려면 RdRP 분석 결과, 다음 RNA 서식 파일 것이 좋습니다: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>단계의 3.4.3 RdRP 반응 혼합물의 20 µ L와 구슬 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 32 ° c.에 2 h 형 peltier 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에</li>
		<li>가수분해 K (20 mg/mL)의 5.4 µ L과 2 x 가수분해 K 버퍼의 45.4 µ L 반응 혼합물에 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 턴테이블에 샘플 (20 ~ 25 rpm)를 흔들어</li>
		<li>샘플에 RNase 무료 물 109.2 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 하 고 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플을 다음 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트의 추가 (pH = 5.2), 4 강 수 캐리어와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 µ L. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. 참고: 단계 3.4.11에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase 처리
	<ol>
<li>RNase 무료 물 단계 3.4.11에서 20 µ L에서 펠 릿 resuspend</li>
		<li>표 3에 설명 된 대로 새로운 튜브에 RNase 반응 혼합물을 준비 합니다.</li>
		<li>샘플, RNase 반응 혼합물의 180 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h에 대 한 튜브를 품 어</li>
		<li>샘플을 10% (vol/vol) SDS의 2.3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플을 가수분해 K (20 mg/mL)의 2 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 205 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 후 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송.</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 강 수의 4 µ L와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>-20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조. 참고: 단계 3.5.9에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안.</li>
	</ol></li>
	<li>젤 전기 이동 법 그리고 autoradiography
	<ol>
<li>RNase 무료 물 20 µ L와 샘플 resuspend</li>
		<li>버퍼를 로드 x 2의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>95 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여 얼음에 샘플을 짝사랑.</li>
		<li>젤을 실행 합니다. 서식 파일 크기 34 국세청 (단계 3.4.3 참조) 경우, 7 M 요소-10 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법을 변성 시키기 위해 사용 된다.</li>
		<li>젤 젤 건조 기 건조.</li>
		<li>x-레이 카세트-80 ° c.에 강화 화면 내에서 건조 젤을 영화 노출</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

IP RdRP 분석 결과 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지 하는 중요 한 방법입니다. TERT 단백질 높은 mitotic HeLa 세포, TERT RdRP 복잡 한8,,910을 형성에 표현 된다. 이 mitotic는 HeLa 세포 RdRP 활동을 감지 하는 최적의 자료는 건의 한다. 위에서 설명한 프로토콜, mitotic 그리고 비 동기화 HeLa 세포 포함 됩니다 긍정 및 부정적인 예제로 각각. 그림 1A에서 같이, mitotic는 HeLa 세포에서 권장 RNA 템플릿에서 RdRP 분석 결과 제품 20 ~ 30 사이의 광범위 한 방사성 신호 표시 nt. HeLa 세포 이외에 우리 셀 라인의 종류와 시험 수행 있고 다른 세포 유형9에 신호 패턴을 변경할 수 있습니다 발견: 일부 강한 신호만 약 30 표시 nt, 일부는 HeLa 세포와 비슷한 패턴을 보여. 우리는 짧은 RNA는 34 nt 템플릿8, 이외 템플릿 분석 결과 수행도 하 고 긴 (~ 300 nt) 다양 한 시퀀스, RNAs 성공적으로 일부 선호 있을 수 있지만 해당 서식 파일에서 RdRP 제품을 얻을. 그러나 첫 번째 재판에 대 한, 좋습니다 mitotic 단계에 34 nt RNA 템플릿을 HeLa 세포를 사용 하 여. 뇌관-종속 및 뇌관-독립적인 방식으로11RdRPs 이중 가닥 RNA를 생성할 수 있습니다. 우리 보고 TERT 인간 RdRP7,9;이 속성 유지 TERT 다시 못쓰게 메커니즘73'-폴드 구조 RNA 템플릿에서 dsRNA를 합성. 34 nt RNA 서식 파일, TERT 뇌관9를 사용 하지 않고 보완 가닥을 합성. 특히 RdRP 제품 뇌관-독립적인 방식으로, 즉 드 노 보 합성 RNA 제품, [α-32P] 합성을 검출 하기 위하여 NTP [γ-32P]로 대체 될 수 있다 NTP RdRP 반응9에.
TERT 구슬에 면역성이 있는 복합물의 MNase 처리는 원하는 결과 달성 하기 위해 중요 한 단계 이다. 너무 오래 또는 집중 떨고 MNase 치료를 수행 하는 경우 RdRP 제품 현저 하 게 감소 것입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 좋습니다 엄격 하 게 신중 하 게 프로토콜을 따라. HMD 솔루션 성공 위한 또 다른 중요 한 요소 이다입니다. 신호는 매우 약한 찾을, 새로 준비 한 HMD 솔루션을 교체 합니다.
프로토콜을 통해 하나 RNase 오염을 피하기 위해 주의 해야한다. Ribonuclease 치료 전용 장비로 수행 되어야 한다. Ribonuclease 조작 후 팁 삭제 해야 하나 그리고 RNase와 튜브 즉시, 전문 솔루션 (예: RNase 조용한), RNase 제거 나무를 변경.
TERT TERC 뿐만 아니라 생 RNAs의 또한 많은 종류와 상호 작용 하 고 우리가7그들의 부분을 보고 있다. MNase 치료 없이 IP RdRP 분석 결과 같은 IP RdRP 분석 결과에서 수정 그들의 시퀀스 기능에 생 RNA 템플릿 RdRP TERT-관련 활동과 bioinformatic 가이드에 대 한 전체 목록을 제공 합니다. 우리가 성공적으로 조직 lysate에이 프로토콜을 적용 했습니다. TERT 정상 및 종양 직물의 다양 한 표현 때문에이 분석 결과 인간의 TERT의 비정규 효소 기능을 조사 하기 위해 유용할 수 있습니다.

인간의 telomerase 역전사 (TERT) 잘 알려져, telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere telomerase RNA 구성 요소 (TERC), 특정 RNA 템플릿1을 사용 하 여. TERT telomerase의 구성 요소로 서 telomeric DNA polymerizes, 비록 구조 및 계통 발생 분석 나타냅니다 TERT 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)와 밀접 하 게 관련 된 도메인을 공유 이러한 polymerases2,,34. RdRP 보완 RNA 가닥 RNA 서식 파일을 생성 하는 효소 이다. 효소는 바이러스 뿐만 아니라 모델 생물, 식물, 효 모, 벌레, 등 에서도 인코딩되고 RdRP에 의해 이중 가닥 RNA 합성 transcriptional 및 post-transcriptional 유전자가 유기 체5,6 침묵에 기여 . 인간의 RdRP 오랜 시간 동안 실종 됐다, 하지만 우리는 인간 TERT 20097에서 RdRP 활동을 발견.
우리는 먼저 재조합 단백질7, TERT의 RdRP 활동을 확인 후 민감한 생체 외에서 분석 결과 내 생 TERT8RdRP 활동 감지를 설립. 여기, 우리가 시험관에 RdRP 분석 결과 (분석 결과 IP RdRP) 생 TERT에 대 한 보여 줍니다. 이 방법은 생 TERT의 immunoprecipitation (IP)로 시작 하 고 뒤에 있는 방사성 ribonucleotides는 초기 RNA 가닥에 통합 RdRP 반응, 생체 외에서 .

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>트립신-에틸렌디아메네테트라아세트산(EDTA) 용액</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS(-))Wako</td><td></td> <td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>티미딘</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>시그마</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td> <td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2- [4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라지닐] 에탄 술폰산 (HEPES)</td> <td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아세테이</td>트 <td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 육수화물 (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>나칼라이 테스크</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>마이크로코커스 뉴클레아제(MNase)</td><td>타카라 바이오</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 비스(b-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)</td><td>나칼라이 테스크</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포나트(CHAPS)</td><td>나칼라이 테스크</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 각 100mM</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>NEG507H 분석 RNase 억제제에 새로운 RI 사용</td></tr><tr><td></td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 ( with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M 아세트산나트륨</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE 침전 캐리어</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드, 탈이온화</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염 이수화물(EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>예: ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>예: TOMY</td><td>EX-135</td><td>B)단계 마이크로</td></tr> <tr><td>냉장 원심분리기</td>(<td>예: KUBOTA</td><td>3740</td>) <td>6.2</td></tr>단계 <tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>초음파 발생기에 마이크로팁(#4422) 설정, 6.4</td></tr>단계 <tr><td>마이크로 냉장 원심분리기</td>(<td>예: TOMY</td><td>MX-305</td>) <td>6.5</td></tr>단계 <tr><td>냉각 인큐베이터</td><td>(예: Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td>) <td>내부에</td></tr> <tr>회전식 쉐이커 설정<td>로터리 쉐이커</td><td>예: TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>냉각 인큐베이터&nbsp;</td><td>예: TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>셰이커 설정 " 미니 웨이브" 내부, 7.7 단계</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS</td><td>ONE WEV-03</td><td>7.7, 8.5 및 8.6 단계 용 쉐이커</td></tr> 인<tr><td>큐베이터</td><td>(예 : TAITEC</td><td>HB-80</td><td>쉐이커 설정 " 미니 웨이브" 내부, 8.5단계 및 8.6</td></tr>단계 <tr><td>블록 인큐베이터</td>(<td>예: ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td>)</tr></tbody></table>

인간의 telomerase 역전사 단백질의 rna 의존 rna 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 telomerase 역전사 (TERT), telomerase의 촉매 소 단위 이며 그것 elongates telomere RNA 의존 DNA 중 합 효소 활동을 통해. TERT는 역전사로 지명 된다, 비록 TERT의 구조 및 계통 발생 분석 TERT 오른 손잡이 polymerases의 회원 이며, 뿐만 아니라 바이러스 역전사 바이러스 성 RNA 의존 RNA polymerases (RdRPs)에 관한 설명. 우리는 첫째로 RdRP 무료 한 RNA를 생성 하는 인간 TERT의 활동 비 코딩 RNA 서식 서 암 세포에 침묵 하는 RNA에 기여 하 고 식별. 이 정식이 아닌 효소 활동 분석, 우리 2009 년에서 재조합 TERT 분석 결과 RdRP를 개발, 그 후 생 TERT RdRP 시험 생체 외에서 설립. 이 원고에서 우리는 후자의 방법을 설명합니다. 간단히, TERT 면역성이 있는 복합물 셀에서 격리 되며 RNA 템플릿과 RdRP 반응에 대 한 방사성 rNTP를 포함 하 여 rNTPs와 알을 품을. 단일 가닥 RNA를 제거 하려면 반응 제품, 그리고 최종 제품 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 분석은 RNase 처리 됩니다. 방사선된 RdRP 제품 하룻밤 노출 후 autoradiography 하 여 검색할 수 있습니다.

권장된 RNA 템플릿을 사용 하 여 방사성 RdRP 제품 하룻밤 노출 (그림 1A) 후 mitotic 단계에서 특히 HeLa 세포에서에서 20 ~ 30 뉴클레오티드 (nt) 사이 관찰 된다. RdRP 제품의 신호 강도 약 25 위치 두 봉우리를 설명 하는 일반적으로, 제품의 크기 분포와 협 화음에 nt 다음 세대 시퀀싱9에의해 확인 nt와 30. Mitotic 세포는 달리 동기화 없이 HeLa 세포는 거의 20-30 nt 방사성 제품의 부재를 보여 줍니다. 타원형 신호 20 아래 배치 된 모든 샘플에서 nt는 특이 현상이 나타난다.
경우에 mitotic는 HeLa 세포에서 약한 신호를 가진 ~ 30 nt 제품, RdRP 반응 잘 가지 않 았 어 나타냅니다. 예를 들어 MNase 치료 약 및 부적절 하 게 수행, mitotic 헬러의 신호 강도 세포 감소 크게 (그림 1B). 오래 된 HMD 솔루션 수행 RdRP 반응 또한 제품 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> 그림 1 : Mitotic는 HeLa 세포에서 내 생 TERT의 대표 RdRP 제품. HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과의 (A) 3 개의 대표적인 결과 (조작) nocodazole 또는 (unmanipulated) DMSO로 치료. 화학적 합성된 34 nt RNA 템플렛으로 사용 되었다. (B) 부적절 한 MNase 치료 수행 mitotic HeLa 세포에서 IP RdRP 분석 결과. (C) IP RdRP 분석 결과 신선한 또는 오래 된 HMD 솔루션 수행 mitotic HeLa 세포에서. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U / µ L</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease 버퍼, 10 배</td>
			<td>8 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>51 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: MNase 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>챕 스, 0.07% (wt/권)</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD 솔루션</td>
			<td>2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 m m</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0.4 m m</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 억제제, 40 U / µ L</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>1 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: RdRP 반응 혼합 구성 요소입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 하나 Ribonuclease, 10 U / µ L</td>
			<td>0.2 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>반응 버퍼, 10 배</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td>159.8 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: Ribonuclease 반응 혼합 구성 요소입니다.

인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

이 방법은 인간 세포에서 RdRP 또는 TERT의 생물학적 중요성은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 이 분석법이 세포에서 발현되는 인간 RdRP 활성을 검출하는 최초의 민감한 방법으로 확립되었다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HeLa 세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다.PBS 10밀리리터로 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 450배 중력에서 샘플을 원심분리하고 상등액을 버립니다. 세포 1,000만 개당 1ml의 얼음처럼 차가운 Lysis Buffer A를 사용하여 부드러운 피펫팅으로 세포를 용해합니다.1.5ml 튜브에서 10초 동안 25%의 초음파 발생기 증폭으로 샘플을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 섭씨 4도에서 15분 동안 20, 400배 중력에서 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 모으고 상등액을 각각 1ml씩 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.용해물 1ml당 40마이크로리터의 사전 세척된 단백질 A-아가로스 비드를 추가하여 용해물을 미리 세척합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞습니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 회전시킵니다.13, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 시간 중력에 표본을 분리기를 설치하고, 상등액을 재기하십시오. 다음으로, 사전 세척된 단백질 A-아가로스 비드 40마이크로리터와 항인간 TERT 항체 10마이크로그램을 사전 세척된 용해물에 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞고 샘플을 밤새 섭씨 4도에서 회전시킵니다.3에 원심분리, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 300배 중력에 원심 분리, 상등액을 제거하십시오. 다음으로 Wash Buffer One으로 비드를 세척합니다. 비드에 Wash Buffer One 1 1ml를 넣고 튜브를 뒤집어 잘 섞습니다.그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 3, 300배 중력에서 샘플을 원심분리하십시오. 상층액을 제거하고 이 단계를 세 번 더 반복합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 AGC 용액을 세척한 후, 부드러운 피펫팅으로 60마이크로리터의 소코코 뉴클레아제 반응 혼합물에 비드를 재현탁하여 비드를 미세구균 뉴클레아제로 처리합니다. 그런 다음 펠티에 타입 인큐베이터에 설정된 셰이커의 턴테이블에서 샘플을 섭씨 25도에서 15분 동안 부드럽게 흔듭니다. 3, 섭씨 4도에서 30초 동안 300배 중력으로 샘플을 원심분리한 후 상등액을 제거합니다.마지막으로, 3밀리몰 EGTA를 함유한 AGC 용액으로 비드를 두 번 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Wash Buffer Two로 비드를 한 번 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 새 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비합니다. P dash 32로 알파 인산기에 표지된 6마이크로리터의 우리딘 삼인산을 반응 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.그런 다음 혼합물에 1마이크로리터의 템플릿 RNA를 추가하고 잘 섞습니다. 생성된 RdRP 반응 혼합물 20마이크로리터로 비드를 재현탁합니다. 다음으로, 펠티에(Peltier) 타입 인큐베이터에 설치된 셰이커의 턴테이블에서 샘플을 섭씨 32도에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다.배양 후 5.4 마이크로리터의 20 millig Proteinase K와 45.4 μl의 2X Proteinase K Buffer를 반응 혼합물에 첨가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 펠티에 타입 인큐베이터에서 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 흔듭니다. 샘플에 109.2마이크로리터의 RNase-free 물을 첨가한 후 200마이크로리터의 산 페놀-클로로포름을 추가합니다.실온에서 5분 동안 21, 100배 중력에서 샘플을 원심분리하기 전에 와류로 잘 혼합합니다. 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.그런 다음 20 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨, pH 5.2, 4 마이크로 리터의 침전 운반체 및 250 마이크로 리터의 에탄올을 수성상에 첨가합니다. 혼합을 위해 튜브를 잘 흔듭니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 중력의 100배인 21도에서 시료를 원심분리한 후 상등액을 버립니다.다음으로, 펠릿을 섭씨 영하 300도에서 저장된 부피 당 70 % 부피의 차가운 에탄올로 펠릿을 세척하십시오. 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 100배 중력에서 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 자연 건조시킵니다.펠릿을 RNase가 없는 물 20마이크로리터에 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 새 튜브에서 RNase 반응 혼합물을 준비합니다. 180마이크로리터의 RNase 반응 혼합물을 샘플에 추가합니다.그런 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 튜브를 배양합니다. 샘플에 부피 SDS당 10% 부피의 2.3마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 20mg/밀리리터 Proteinase K 2마이크로리터를 샘플에 추가하고 섭씨 37도에서 15분 더 배양합니다.이제 205마이크로리터의 산성 페놀-클로로포름을 샘플에 추가합니다. 이전과 같이 혼합 및 원심분리 후 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 3 몰 나트륨 아세테이트, 침전 운반체 및 에탄올을 수성상에 첨가 한 다음 이전에 수행 한 것처럼 펠릿을 혼합, 원심 분리 및 세척합니다.다음은 조작되지 않은 세포에 대해 노코다졸 또는 DMSO로 처리된 HeLa 세포에서 IP-RdRP 분석의 세 가지 대표적인 결과입니다. 화학적으로 합성된 34-뉴클레오티드 RNA를 주형으로 사용하였다. 하룻밤 동안 노출된 후 RdRP 산물은 특히 유사분열 단계 내의 HeLa 세포에서 20-30개의 뉴클레오티드를 볼 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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