인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

이 방법은 인간 세포에서 RdRP 또는 TERT의 생물학적 중요성은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 이 분석법이 세포에서 발현되는 인간 RdRP 활성을 검출하는 최초의 민감한 방법으로 확립되었다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HeLa 세포를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다.

PBS 10밀리리터로 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 450배 중력에서 샘플을 원심분리하고 상등액을 버립니다. 세포 1,000만 개당 1ml의 얼음처럼 차가운 Lysis Buffer A를 사용하여 부드러운 피펫팅으로 세포를 용해합니다.

1.5ml 튜브에서 10초 동안 25%의 초음파 발생기 증폭으로 샘플을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 섭씨 4도에서 15분 동안 20, 400배 중력에서 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 모으고 상등액을 각각 1ml씩 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

용해물 1ml당 40마이크로리터의 사전 세척된 단백질 A-아가로스 비드를 추가하여 용해물을 미리 세척합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞습니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 회전시킵니다.

13, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 시간 중력에 표본을 분리기를 설치하고, 상등액을 재기하십시오. 다음으로, 사전 세척된 단백질 A-아가로스 비드 40마이크로리터와 항인간 TERT 항체 10마이크로그램을 사전 세척된 용해물에 추가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞고 샘플을 밤새 섭씨 4도에서 회전시킵니다.

3에 원심분리, 4 섭씨 온도에 30 초 동안 300배 중력에 원심 분리, 상등액을 제거하십시오. 다음으로 Wash Buffer One으로 비드를 세척합니다. 비드에 Wash Buffer One 1 1ml를 넣고 튜브를 뒤집어 잘 섞습니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 3, 300배 중력에서 샘플을 원심분리하십시오. 상층액을 제거하고 이 단계를 세 번 더 반복합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 AGC 용액을 세척한 후, 부드러운 피펫팅으로 60마이크로리터의 소코코 뉴클레아제 반응 혼합물에 비드를 재현탁하여 비드를 미세구균 뉴클레아제로 처리합니다. 그런 다음 펠티에 타입 인큐베이터에 설정된 셰이커의 턴테이블에서 샘플을 섭씨 25도에서 15분 동안 부드럽게 흔듭니다. 3, 섭씨 4도에서 30초 동안 300배 중력으로 샘플을 원심분리한 후 상등액을 제거합니다.

마지막으로, 3밀리몰 EGTA를 함유한 AGC 용액으로 비드를 두 번 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Wash Buffer Two로 비드를 한 번 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 새 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비합니다. P dash 32로 알파 인산기에 표지된 6마이크로리터의 우리딘 삼인산을 반응 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

그런 다음 혼합물에 1마이크로리터의 템플릿 RNA를 추가하고 잘 섞습니다. 생성된 RdRP 반응 혼합물 20마이크로리터로 비드를 재현탁합니다. 다음으로, 펠티에(Peltier) 타입 인큐베이터에 설치된 셰이커의 턴테이블에서 샘플을 섭씨 32도에서 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다.

배양 후 5.4 마이크로리터의 20 millig Proteinase K와 45.4 μl의 2X Proteinase K Buffer를 반응 혼합물에 첨가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 펠티에 타입 인큐베이터에서 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 흔듭니다. 샘플에 109.2마이크로리터의 RNase-free 물을 첨가한 후 200마이크로리터의 산 페놀-클로로포름을 추가합니다.

실온에서 5분 동안 21, 100배 중력에서 샘플을 원심분리하기 전에 와류로 잘 혼합합니다. 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.

그런 다음 20 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨, pH 5.2, 4 마이크로 리터의 침전 운반체 및 250 마이크로 리터의 에탄올을 수성상에 첨가합니다. 혼합을 위해 튜브를 잘 흔듭니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 중력의 100배인 21도에서 시료를 원심분리한 후 상등액을 버립니다.

다음으로, 펠릿을 섭씨 영하 300도에서 저장된 부피 당 70 % 부피의 차가운 에탄올로 펠릿을 세척하십시오. 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 100배 중력에서 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 자연 건조시킵니다.

펠릿을 RNase가 없는 물 20마이크로리터에 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 새 튜브에서 RNase 반응 혼합물을 준비합니다. 180마이크로리터의 RNase 반응 혼합물을 샘플에 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 튜브를 배양합니다. 샘플에 부피 SDS당 10% 부피의 2.3마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 20mg/밀리리터 Proteinase K 2마이크로리터를 샘플에 추가하고 섭씨 37도에서 15분 더 배양합니다.

이제 205마이크로리터의 산성 페놀-클로로포름을 샘플에 추가합니다. 이전과 같이 혼합 및 원심분리 후 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 3 몰 나트륨 아세테이트, 침전 운반체 및 에탄올을 수성상에 첨가 한 다음 이전에 수행 한 것처럼 펠릿을 혼합, 원심 분리 및 세척합니다.

다음은 조작되지 않은 세포에 대해 노코다졸 또는 DMSO로 처리된 HeLa 세포에서 IP-RdRP 분석의 세 가지 대표적인 결과입니다. 화학적으로 합성된 34-뉴클레오티드 RNA를 주형으로 사용하였다. 하룻밤 동안 노출된 후 RdRP 산물은 특히 유사분열 단계 내의 HeLa 세포에서 20-30개의 뉴클레오티드를 볼 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 TERT의 RdRP 활동을 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.