관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광

본 형광 인 시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 기술의 전반적인 목표는 C.elegans의 텔로미어 수와 길이를 간결하게 분석하는 것입니다. 이 방법은 종양 재발, 텔로미어의 대안적 연장(alternative lengthening of telomeres) 및 세포 노화에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 간결하며 24시간 이내에 텔로미어를 시각화하고 정량화할 수 있다는 점입니다.

잔해물이 없는 소량의 액체 배지와 함께 임신한 성체 벌레를 15 milliliter 튜브에 수집합니다. 이제 다음과 같이 벌레를 세 번 세척합니다. 총 부피가 15 milliliters가 되도록 M9 버퍼를 추가합니다.

그 다음 튜브를 300 G에서 3분 동안 원심 분리하고, 벌레 펠렛 위의 상층액을 제거합니다. 이 과정을 반복합니다. 원심 분리 후 벌레가 떠 있다면, 원심분리기의 브레이크 강도를 낮추십시오.

세 번째 세척 후, 벌레를 5 milliliters의 M9과 함께 둡니다. 그다음 6.5 milliliters의 증류수, 2 milliliters의 차아염소산염, 그리고 1 milliliter의 5 molar 수산화칼륨을 첨가합니다. 벌레를 이 표백 용액 내에서 50 RPM으로 교반하며 3분 동안 배양합니다. 이후 벌레를 볼텍싱하여 몸체를 절단하고 알을 분리합니다.

해부 현미경 하에서 방출된 알을 확인합니다. 아직 알이 방출되지 않았다면 배양을 최대 8분까지 계속합니다. 벌레가 대부분 용해되어 알이 자유롭게 분리되었다면, 튜브에 M9을 채워 15 mL로 맞춘 후, 이전에 벌레를 세척했을 때와 동일하게 알을 세 번 세척합니다.

M9의 대부분을 제거하고 세척한 알에 PBST를 채워 부피를 500 microliters로 맞춘 다음, 4%PFA 500 microliters를 첨가합니다. 이제 2%PFA에 담긴 알 40 microliter씩을 폴리라이신(polylysine) 코팅 슬라이드의 웰에 분주합니다. 그런 다음 슬라이드를 습윤 챔버로 옮겨 실온에서 15분 동안 배양합니다.

본 프로토콜을 위해, -80 °C의 드라이아이스에 알루미늄 블록을 보관하십시오. 또한, 메탄올과 아세톤을 20 °C에서 보관하십시오. 고정 단계가 완료되면, 슬라이드에서 PFA 용액의 대부분을 제거하고 약 5 µL만 남기십시오.

그 다음, 두 코팅된 표면이 서로 달라붙어 웰(well) 내의 조직이 고정되도록 각 샘플 슬라이드 위에 두 번째 폴리라이신(polylysine) 코팅 슬라이드를 덮습니다. 고정액이 너무 많으면 티슈로 닦아냅니다. 이제 슬라이드를 차가운 알루미늄 블록 위에 최소 15분 동안 놓아 동결시킵니다.

그동안 슬라이드용 메탄올 및 아세톤 배스를 얼음 위에 준비합니다. 슬라이드가 얼면, 하나를 비틀어 샘플을 동결 파쇄(freeze crack)합니다. 위쪽 슬라이드는 버리고 아래쪽 슬라이드를 얼음처럼 차가운 메탄올에 5분 동안 담급니다.

모든 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 동결 파쇄(Freeze cracking)를 통해 단단한 알껍데기를 뚫고 프로브와 항체가 침투할 수 있게 됩니다. 알이 성공적으로 동결 파쇄되었다면, 두 슬라이드 모두에서 알의 모습이 관찰될 것입니다.

메탄올에 최소 5분 동안 둔 후, 슬라이드를 차가운 아세톤으로 옮겨 5분 동안 처리합니다. 이후 PBST에 5분씩 3회 담가 샘플을 세척합니다. PBST 세척이 끝난 슬라이드는 4°C의 100% ethanol에 수일 동안 보관할 수 있습니다.

계속 진행하려면, 샘플 웰에 20 µL의 RNase 용액을 넣고 습도 조절 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 2x SSCT로 15분씩 2회 세척합니다. 두 번의 세척 후, 샘플에 20 µL의 hybridization 용액을 넣고 습도 조절 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다.

그동안 이중 가닥 DNA 프로브를 준비합니다. 95 °C에서 5분 동안 변성시킨 후, 잠시 얼음 위에 놓아 냉각합니다. 1시간 후, 하이브리다이제이션 용액을 흡입하여 제거하고 프로브 용액을 첨가합니다.

이 단계부터 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. 프로브를 추가한 후, 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 80 °C 가열 블록 위에 습윤 챔버를 만드십시오.

열 블록이 다시 80°C로 안정되면, 샘플 슬라이드를 가온 챔버에 넣고 3분 동안 변성시킵니다. 그 다음, 처리된 모든 슬라이드를 37°C의 습윤 챔버에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 상온의 PBST에서 5분 동안 샘플을 세척합니다.

준비를 위해, 세척 1시간 전에 하이브리드화 용액을 37°C로 가온합니다. 그런 다음 슬라이드를 하이브리드화 세척 용액이 담긴 병에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 하이브리드화 용액을 제거하려면, 상온에서 PBST로 샘플을 15분 동안 세척합니다.

이 과정을 세 번 반복합니다. 마지막 PBST 세척액을 흡입하여 제거한 후, 각 시료에 블로킹 용액 20 µL를 넣고 습윤 챔버에서 실온 암실 상태로 한 시간 동안 배양합니다. 그 다음 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 1:200로 희석한 FITC 접합 항-digoxigenin 항체 용액으로 교체합니다.

슬라이드를 덮고 암실에서 실온으로 3시간 동안 배양합니다. 항체 염색 후, 암실에서 PBST로 샘플을 15분씩 2회 세척합니다. 다음으로 PBST를 흡입하여 제거하고 DAPI가 포함된 마운팅 용액 10 µL로 대체합니다.

커버 글라스를 덮고 과잉 용액을 흡수하여 제거합니다. 마지막으로, 커버 글라스의 가장자리를 매니큐어로 밀봉한 후 형광 현미경으로 시료를 관찰합니다. PNA 프로브를 사용하여 텔로미어 충분 돌연변이에서 생존한 동물의 텔로미어를 관찰하였습니다.

생식샘에서 핵당 텔로미어의 수는 정량화가 가능합니다. 텔로미어 신호가 TALT1 신호와 동일 위치에서 검출되었으며, 이는 TALT1이 텔로미어 없는 생존을 담당한다는 개념을 뒷받침합니다. 텔로미어 신호의 강도는 소프트웨어를 사용하여 비교하였습니다.

ALT 생존자에서 나타난 신호는 텔로미어 결핍 돌연변이체를 생성하는 데 사용된 모주(parental strains)보다 더 강했습니다. 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 포름아미드(formamide)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.