관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광 현장에서 하이브리드 (FISH) 예쁜 꼬마 선충

이 형광 in situ hybridization 기술의 전반적인 목표는 C.Elegans의 텔로미어 수와 길이를 간결하게 분석하는 것입니다. 이 방법은 종양 재생, 텔로미어의 선택적 연장 및 세포 노화에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 간결하고 텔로미어를 24시간 이내에 시각화하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

15ml 튜브에 파편이 없는 약간의 액체 매체와 함께 육중한 성충을 수집합니다. 이제 다음과 같이 벌레를 세 번 씻으십시오. 총 부피 15ml에 대해 M9 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 300G에서 3분 동안 튜브를 회전시키고 벌레 펠릿 위에 용액을 버립니다. 그런 다음 이 과정을 반복합니다. 원심분리 후 웜이 떠 있으면 원심분리기의 브레이크를 가볍게 하십시오.

세 번째 세척 후 웜에 M9 5ml를 그대로 두십시오. 그런 다음 증류수 6.5ml, 고아염소산염 2ml, 5몰 수산화칼륨 1ml를 추가합니다. 벌레가 이 표백 용액에서 50RPM의 교반으로 3분 동안 배양하도록 합니다. 그런 다음 벌레를 소용돌이쳐서 깎아내고 알을 풀어줍니다.

해부 현미경으로 방출된 난자를 찾습니다. 아직 방출되지 않은 경우 배양을 계속하거나 최대 8분까지 배양을 계속합니다. 기생충이 대부분 용해되고 알이 없는 경우 튜브에 M9를 15ml까지 채우고 이전에 기생충을 씻었던 것처럼 알을 세 번 씻습니다.

씻은 달걀에 M9의 대부분을 제거한 상태에서 PBST로 부피를 500 마이크로 리터로 채운 다음 500 마이크로 리터의 4 % PFA를 첨가하십시오. 이제 2%PFA에 함유된 40마이크로리터의 난자 분취량을 폴리리신으로 코팅된 슬라이드의 웰에 로드합니다. 그런 다음 슬라이드를 가습 챔버로 옮기고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

이 프로토콜의 경우 섭씨 80도에서 보관된 드라이아이스에 알루미늄 블록을 사용합니다. 또한 메탄올과 아세톤을 섭씨 20도에서 보관하십시오. 고정 단계가 완료된 후 슬라이드에서 대부분의 PFA 용액을 제거하고 약 5마이크로리터를 남깁니다.

그런 다음 두 번째 폴리리신 코팅된 슬라이드를 각 샘플 슬라이드 위에 배치하여 두 개의 코팅된 표면이 서로 달라붙어 조직을 웰에 가두도록 합니다. 과도한 고정제가 있으면 티슈로 닦아냅니다. 이제 슬라이드를 차가운 알루미늄 블록에 최소 15분 동안 올려 놓아 얼립니다.

한편, 슬라이드를 위해 얼음 위에 메탄올과 아세톤 목욕을 준비합니다. 슬라이드가 얼면 하나를 비틀어 샘플을 얼려 깨뜨립니다. 상단 슬라이드를 버리고 하단 슬라이드를 얼음처럼 차가운 메탄올에 5분 동안 담급니다.

모든 샘플에 대해 이 작업을 수행합니다. 동결 균열을 통해 단단한 달걀 껍질을 통해 프로브와 항체를 침투할 수 있습니다. 계란이 성공적으로 동결 금이 가면 두 슬라이드에서 계란을 볼 수 있습니다.

메탄올에서 최소 5분 후 슬라이드를 5분 동안 차가운 아세톤으로 이동합니다. 다시 5분 후에 PBST에 샘플을 3회 담가두고, 한 번 목욕할 때마다 5분씩 담가둡니다. PBST 세척 후 슬라이드는 섭씨 4도에서 100% 에탄올에 며칠 동안 보관할 수 있습니다.

계속 진행하려면 샘플 웰에 20마이크로리터의 RNase 용액을 추가하고 섭씨 37도의 가습 챔버에서 한 시간 동안 배양합니다. 다음으로 2x SSCT로 슬라이드를 세탁할 때마다 15분 동안 두 번 세탁합니다. 두 번의 세척 후 샘플에 20마이크로리터의 혼성화 용액을 추가하고 가습실에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양합니다.

한편, 이중 가닥 DNA 프로브용 프로브를 준비합니다. 섭씨 95도에서 5분 동안 변성시킨 다음 얼음에 잠깐 식힙니다. 한 시간 후 혼성화 용액을 흡입하고 프로브 용액을 추가합니다.

이 단계부터 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 프로브를 추가한 후 샘플을 유리 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 섭씨 80도의 열 블록에 가습 챔버를 만듭니다.

열 블록이 섭씨 80도까지 다시 안정화되면 예열된 챔버에 샘플 슬라이드를 놓고 3분 동안 변성시킵니다. 그런 다음 처리된 모든 슬라이드를 섭씨 37도의 가습실에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후 PBST에서 실온에서 5분 동안 샘플을 세척합니다.

준비시, 세척 1시간 전에 혼성화 용액을 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다. 그런 다음 슬라이드를 혼성화 세척 용액 병에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 혼성화 용액을 제거하려면 실온에서 15분 동안 PBST로 샘플을 세척합니다.

이 작업을 세 번 수행합니다. 마지막 PBST 세척을 흡인한 후 각 샘플에 20마이크로리터의 차단 용액을 추가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 실온의 가습 챔버에서 배양합니다. 그런 다음 차단 용액을 흡인하고 1 대 200에서 FITC 복합 항 디곡시제닌 항체 용액으로 교체합니다.

슬라이드를 덮고 어둠 속에서 3시간 동안 실온에서 배양합니다. 항체 염색 후 어두운 곳에서 세척할 때마다 15분 동안 PBST로 샘플을 두 번 세척합니다. 다음으로 PBST를 흡입하고 DAPI가 포함된 10마이크로리터의 마운팅 솔루션으로 교체합니다.

커버 유리를 바르고 과도한 용액을 흡수하십시오. 마지막으로 커버 유리의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 형광 현미경으로 샘플을 관찰합니다. PNA 프로브를 사용하여 텔로미어가 충분한 돌연변이에서 살아남은 동물의 텔로미어를 관찰했습니다.

생식선에서 핵 당 텔로미어의 수는 정량화 할 수 있습니다. 텔로미어 신호는 TALT1 신호와 함께 국소화되어 TALT1이 텔로미어가 없는 생존을 담당한다는 개념을 뒷받침합니다. 텔로미어 신호의 강도는 소프트웨어를 사용하여 비교되었습니다.

이 신호는 텔로미어가 결핍된 돌연변이를 생성하는 데 사용된 부모 균주보다 ALT 생존자에서 더 강했습니다. 파라포름알데히드와 포름아미드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.