Name: 관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광 현장에서 하이브리드 (FISH) 예쁜 꼬마 선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 형광 현장 하이브리드화(FISH)를 이용한 텔로미어 수와 길이 분석 방법을. 24시간 이내에 시각화 및 정량이 가능하여 종양 재생과 세포 노화 연구에 활용됩니다.

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돌연변이 벌레 균주는 Caenorhabditis Genetics Center에서 친절하게 제공했습니다. 본 연구는 대한민국 보건복지부의 자금 지원을 받아 한국보건산업진흥원(KHIDI)을 통한 한국보건기술 R&D 사업(Korea Health Technology R&D Project)의 지원을 받았다(보조금 번호: HI14C1277).

PCR에 의한 디그 옥시 제닌 dUTP를 1. 레이블 프로브 <ol><li> 이전 13 설명 ​​된대로 10 배의 dNTP 믹스 디그 옥시 제닌 dUTP를을 포함하여 PCR 라벨링을 수행합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 스핀 컬럼으로 정제 PCR 생성물을 정제 하였다. <ol><li> 프로브가 짧을 200 bp의 경우, 반응 혼합물로부터 스핀 - 컬럼 크로마토 그래피보다는 스핀 칼럼 정제 무료 디그 옥시 제닌 dUTP를 제거. </li></ol></li></ol> 2. 준비 폴리 라이신 코팅 슬라이드 참고 : 전체 절차는 약 2 시간 소요됩니다. 대부분의 단계는 건조 단계를 제외하고, 실온에서 수행된다. <ol><li> 슬라이드를 청소 <ol><li> 플라스틱 용기에 슬라이드를 배치하고 간단히 증류수 (DW)와 슬라이드를 헹군다. 물을 제거하고 1 % DW 유리 세정제를 함유하는 용기를 채운다. </li><li> 실온에서 50 rpm으로 (RT)에서 15 분 동안 교반 슬라이드. DW 3 슬라이드를 씻으RT에서 5 분마다 시간. </li><li> 교반과 함께 15 분 동안 70 % 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. 70 % 에탄올을 취소하고 15 분 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 배치합니다. </li></ol></li><li> 멀티 웰 유리 슬라이드 리신 코팅 참고 : 염색 과정에 걸쳐 샘플 밀착성을 제공하기 때문에, 슬라이드 유리 라이신 코팅은 중요한 단계이다. 저조한 코팅 된 슬라이드 샘플의 손실이 발생할 것입니다. <ol><li> 0.01 % 폴리 리신으로 원액을 희석 (W / V) 증류수이다. 희석 된 0.01 %의 20 μl를 깨끗한 유리 슬라이드의 우물에 (w / v)의 폴리 리신을 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 동안 유리 슬라이드 부화. </li><li> 1 시간 동안 65 ° C 건조 블록 공기 건조에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 먼지 무료로 상자에 폴리 라이신 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 슬라이드 유리에 벌레 3. 고정 (그림 1) <ol><li> FISH를위한 준비 배아 참고 : 수확 벌레를 모두 t 전에그 세균 음식 현미경 성장 배지를보고에 의해 소비된다. 기아는 성인 웜의 계란 생산을 줄이고 달걀 부화를 증가시킨다. 자세한 방법은 14, 15에 설명되어 있습니다. <ol><li> 표준 방법 (14)에 따라 50mm 페트리 접시에 벌레를 성장. </li><li> 모든 세균 음식을 섭취 한 후 주걱으로 분기 한천 미디어를 잘라. 오염을 방지하기 위해서 절단 전에 멸균 주걱. </li><li> 100mm 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 한천의 모든 조각을 넣어. 신선한 박테리아 음식에 도달하는 벌레를 거꾸로 한천 조각을 돌립니다. </li><li> 48 시간 72 후, M9 버퍼와 벌레를 수집합니다. NGM 플레이트에 M9 버퍼 5 ㎖ - 3을 추가합니다. NGM의 표면에 피펫 M9 버퍼는 벌레를 씻어. </li><li> 벌레와 액체를 수집하고 15 ML 튜브에 추가 할 수 있습니다. 참고 : 30 % 자당 용액에서 수확, 원심 분리기 벌레 후 한천 이물질이있는 경우. 파편이 펠렛 동안, 웜에 떠표면. </li><li> 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다. 3 분 300 XG에서 원심 분리하여 벌레를 펠렛과 M9 버퍼의 대부분을 제거합니다. 이 단계를 2 번 더 반복합니다. 참고 : 웜은 아직 원심 분리 한 후 부동 경우, 원심 분리기의 브레이크 레벨 = 1 값으로 설정. </li><li> 기음 M9 버퍼입니다. 벌레에 표백 솔루션을 추가합니다. 웜의 0.5 ml의 당 5 M KOH의 6.5 DW ml의, 차아 염소산 2 ㎖, 1 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 50 rpm에서 3 분 동안 실온에서 락으로 벌레를 품어. 15 초 동안 소용돌이 웜은 기계적으로 벌레를 전단과 계란을 노출합니다. </li><li> 표백하는 동안 해부 현미경 튜브를 관찰한다. 벌레가 반으로 잘라하고 계란이 해제되어 있는지 확인합니다. 성인 신체의 대부분이 용해되면, 15 ml의 볼륨을 만들기 위해 M9 버퍼를 추가합니다. </li><li> 3 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 기음 M9의 대부분을 15 ml의 볼륨을 보충하기 위해 신선한 M9 버퍼를 추가합니다. 반복 세척 단계 3 회. 노트:그들은 표백 과정을 방해으로, 웜의 과도한 양을 사용하지 마십시오. 보다 8 분 세척까지 전체 반응 시간을 유지합니다. 오버 표백 계란 강한 자기 형광을 생산하고 있습니다. </li><li> 200 ㎕의 2 % PFA을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 200 μL까지 폴리 소르 베이트 20 (PBST)을 인산염 완충 식염수를 추가한다. 주의 : PFA는 발암 물질이기 때문에, PFA를 사용하기 전에 보호 복, 보호 장갑 및 눈 방패를 착용하십시오. </li><li> 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드의 우물에 2 % PFA에서 계란의 40 μl를 추가합니다. </li><li> 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어. 슬라이드는 내부에 배치 된 직후 습기 챔버를 닫습니다. 참고 : 고정 된 상태로 계란은 슬라이드의 바닥에 정착. </li></ol></li><li> 물고기를 해부 생식선 준비 <ol><li> 수확 성인 웜 M9 버퍼 1 ㎖를 피펫 팅에 의해 50mm NGM 판에 성장. 세균성 식품 전에 수확 웜은 고갈된다. </li><li> 어떤 세균 기지에서 벌레를 씻어H M9 버퍼 2 회. 참고 : 잔류 박테리아는 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드에 달라 붙는 해부 생식선을 방해 할 수 있습니다. </li><li> 300 x g에서 원심 분리하여 벌레 펠렛. M9를 제거하고 마이크로 피펫에 의해 빈 NGM 플레이트로 웜을 전송합니다. </li><li> 폴리 라이신 처리 된 슬라이드의 잘에 2 밀리미터의 levamisole을 포함하는 M9 버퍼의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 1 ML 튜브에 M9 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 입 피펫으로 웜을 전송하기 위해 버퍼를 사용합니다. </li><li> M9 버퍼를 함유하는 1 ㎖의 튜브에 모세관을 배치하여 M9 완충액 입 피펫의 끝을 채운다. </li><li> 웜의 머리가 입 피펫을 입력하도록 해부 현미경, 단지 성인 웜 드래그 입 피펫의 머리 앞에 입 피펫의 팁을 넣어. 웜의 머리 끝을 입력하면, 웜의 몸 전체가 팁으로 그려집니다. </li><li> 입 피펫을 사용하여 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드로 웜을 전송합니다. </li><li> 의 절단, 면도칼을 사용하여머리 또는 슬라이드 웜의 꼬리의 끝 (F). 웜이 절단 될 때, 생식선 밖으로 나타납니다. 생식선은 슬라이드에 충실 할 것이다. <ol><li> 하나 잘 적어도 30 벌레를 준비합니다. 추가로 30 웰 웜에 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 습기 챔버에 슬라이드를 넣고 입으로 피펫으로 M9 버퍼를 대기음. </li><li> 습 챔버 내에서 15 분 동안 실온에서 2 % PFA 20 μl를 첨가하여 샘플을 고정한다. </li></ol></li></ol> 4. 고정 및 Permeabilization <ol><li> 드라이 아이스에 알루미늄 블록을 놓고 깊은 냉동고에 보관 (-80 ° C). -20 ° C에 보관 메탄올 및 아세톤. </li><li> PFA 고정 단계 3.1.15 또는 3.2.11 후 ~ 정착액의 5 μl를 마이크로 피펫 떠나는를 사용하여 정착액을 제거합니다. </li><li> 샘플 슬라이드에 다른 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드를 넣습니다. 솔루션이 과도한 경우 종이 타월로 정착액을 제거합니다. 그들은 서로 붙어되면 슬라이드를 이동하지 마십시오. </li><li> 슬라이드를 고정적어도 15 분 동안 알루미늄 블록. 주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일. </li><li> 슬라이드가 고정되는 동안 얼음 냉 메탄올 및 아세톤을 함유하는 병을 넣어. </li><li> 슬라이드를 꺼내 샘플을 동결 균열을 비틀어. 상단 슬라이드를 폐기하십시오. 즉시 5 분간 빙냉 메탄올로 슬라이드 소크. </li><li> 5 분 동안 얼음처럼 차가운 아세톤으로 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 잔류 정착액을 제거하기 위해 5 분 동안 슬라이드를 PBST 3 회 반복한다. 다음 단계로 진행 또는 4 ° C에서 100 % 에탄올에 슬라이드를 저장합니다. 주의 : 샘플을 적어도 2 저장 될 수있다 - 삼일. </li></ol> 고정 세포의 5. 하이브리드 <ol><li> (PBST 10 μg의 / ㎖의 RNase을 포함)의 RNase 용액 20 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 습한 챔버에서 슬라이드 부화. </li><li> 폴리 소르 베이트 20 (2 배 SSCT) 15 분 각각에 2 배 식염수와 구연산 나트륨에 두 번 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 20 추가하이브리드 솔루션의 μL와 37 ° C 배양기에서 습기 챔버를했습니다. 1 시간 후, 피펫으로 하이브리드 솔루션을 제거합니다. </li><li> 하이브리드 솔루션을 제거하기 전에 프로브를 준비합니다. 상기 프로브는 이중 쇄 DNA가되면, 건조 블록을 5 분 동안 95 ℃에서 가열에 의해 프로브를 변성. 가열 후, 얼음 짧게에 프로브를 냉각. </li><li> 샘플에 프로브를 포함하는 하이브리드 용액 10 μl를 추가합니다. 2,000 파기 표지 된 프로브 1의 비율로 사용 농도 : 200 PNA 프로브 1의 비율로 사용 농도. 커버 유리와 샘플을 커버. </li><li> 열 블록 (80 ° C)에 물을 적신 종이 타월을 넣어. 습도 및 온도를 유지하기 위해 열 블록 플라스틱 상자 덮개를 넣는다. </li><li> 가열 블록의 온도 (80 ℃로) 안정화 된 후, 가열 된 종이 수건 시료 슬라이드를 놓고 플라스틱 박스 커버와 함께 샘플을 커버한다. 3 분 동안 샘플을 변성. </li><li> Inc의하룻밤 37 ℃에서 습기 챔버에서 슬라이드를 ubate. </li></ol> 6. 세척 및 면역 형광 <ol><li> 37 ° C에 하이브리드 세척 용액 (2 × SSC, 50 % 포름 아미드)를 따뜻하게. </li><li> 5 분 동안 실온에서 두 번 PBST에서 샘플을 씻으십시오. 커버 유리를 제거합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 혼성화 세척 용액의 샘플을 씻는다. </li><li> 3 회 RT에서 PBST의 샘플 슬라이드를 씻으십시오. 참고 : RT에 습기 챔버의 모든 후속 단계를 수행합니다. </li><li> 차단 용액 20 μl를 추가하고 습기 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 솔루션을 차단 제거하고 FITC 접합 된 항 디곡 시게 닌 항체 용액 (1 : 200)를 추가 RT 또는 밤새 4 ℃에서 3 시간 동안. </li></ol> 7. 설치 및 관측 <ol><li> 15 분마다 PBST로 2 번 샘플 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> DAPI와 솔루션을 장착의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 커버 유리하고 Enter 키를 넣습니다. 초과 솔루션을 제거종이 수건. </li><li> 장착 용액의 증발을 방지하기 위해, 매니큐어와 커버 유리의 가장자리를 밀봉. </li><li> 공 초점 현미경으로 관찰한다. 높은 배경으로 배아를 제외합니다. 20 핵 - 4 필드에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 100X 대물 렌즈와 제조업체의 지시에 따라 이미지를 가져 가라. 참고 : FITC에 대한 488 nm의 레이저로, CY3에 대한 555 nm의 레이저로, DAPI에 대한 405 nm의 레이저로 샘플을 익사이트. </li></ol> 텔로미어 신호의 8 정량 참고 : 이전 16 설명한 바와 같이 정량화가 이루어졌다. 비교 될 수있는 모든 이미지는 노출 시간 및 광원을 포함 동일한 설정으로 촬영한다. <ol><li> 이 .tif 형식으로 이미지를 보냅니다. </li><li> 다운로드 및 이미지 분석 소프트웨어를 설치한다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 실행하고 버튼을 동의 클릭합니다. </li><li> 열기 버튼을 클릭합니다. 이미지 파일을 두 번 클릭하여 텔로미어의 FISH와 이미지를 엽니 다. </li><li> 딸깍 하는 소리[편집] - [선택 처리 영역, 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드래그하여 관심의 선택 영역입니다. 모든 비특이적 염색을 제외. </li><li> [광학 밀도를 발견] 텔로미어 신호 채널을 선택하고 .txt 파일에 결과를 저장할 파일 이름을 입력 - [측정]를 클릭합니다. 주 : 결과 열은 다음 순서대로 : 스폿의 형광 반점의 스폿 영역의 배경 강도. </li><li> 값을 복사하여 현장의 형광에서 현장의 배경 강도를 뺍니다. 값은 이제 통계적 분석 될 수있다. </li></ol>

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우리 프로토콜의 주요 장점은 세포 구조의 형태로 눈에 띄는 손상없이 절차의 단순함이다. 여러 단계 C.에 최적화 된 이 프로토콜에 간스의 물고기. 성공적인 FISH를위한 중요한 단계는 프로브의 라벨, 배아 및 침투의 고정을 포함한다. 디그 옥시 제닌 표지 된 dUTP의 방법은, PCR이나 닉 - 번역에 의해 사용하기 쉬운 표시 방법을 제공한다. 긴 표적 서열 레이블을 지정하려면, 닉 번역이 바람직하다. 이 경우, 프로브는 프로브의 침투를 용이하게하기 위해 적절한 제한 효소로 분해되어야한다. 비오틴 표지 된 프로브는 세포질에서 배경 신호의 과잉 생산 때문에 비오틴-dUTP를 태그하지 않는 것이 좋습니다. 내인성 비오틴 차단 시약이​​ 시판되고 있지만,이 시도되지 않았다. 이 프로토콜은 효율적인 정량화를위한​​ 세포의 밀도를 증가시키는 절연 배아를 사용한다. C의 장 핵. 엘레 크기가 크고, 과도한 수와 체세포 핵의 나머지 부분에 ...

텔로미어는 비정상적인 융합 저하로부터 염색체 끝 부분을 보호합니다. 포유류 텔로미어는 G-풍부한 hexameric 반복, TTAGGG 및 shelterin 단지로 구성되어있다. 선충의 텔로미어 반복 서열은 포유 동물 (TTAGGC)의 그것과 유사하다. 대부분의 진핵 세포는 염색체 말단에 텔로미어의 반복을 추가하는 텔로 머라 제를 사용한다. 그러나, 10 - 암세포의 15 % 텔로미어 (ALT) 3의 대안 길어 알려진 텔로 머라 독립 메커니즘을 이용한다. 이전에, 우리는 텔로미어의 반복과 TALT라는 이름으로 관련 시퀀스가 중요한 불임이 살아 텔로 머라 돌연변이 라인의 텔로미어에서 증폭 된 보도했다. 텔로미어 길이를 정량적 PCR에 의해 또는 전체 -4,5,6,7- 텔로미어의 평균 길이를 제공 서던 블롯에 의해 측정 하였다. 전체 게놈 시퀀싱 데이터에서 텔로미어 반복의 읽기 횟수는 총 텔로미어의 내용 (8)의 지표입니다. 죄 있지만GLE 텔로미어 길이 분석 (STELA) 단일 텔로미어의 길이가,이 텔로미어 (9)의 공간 정보를 제공 할 수 제공 할 수있다. POT-1 :: mCherry 리포터 단백질이 생체 내에서 텔로미어의 공간 정보를 제공하는 반면 POT-1 단백질 (10)을 결합 단일 가닥 텔로미어이기 때문에, 그것은 이중 가닥 말단 소립의 길이를 나타낼 수 없다. 상기 방법은 반복적 인 시퀀스의 평균 정보를 제공하는 반면, 현장 하이브리드 (FISH)의 형광 염색체 규모에 금액과이자의 개별 시퀀스의 공간 패턴을 관찰 할 수 있습니다. 대신 DNA의 정제, 조직 또는 세포는 FISH에서 기본 공간 정보를 보존하기 위해 고정되어있다. 따라서, FISH는 텔로미어 반복 개별 반복 서열의 관찰을위한 양적 및 질적 도구입니다. 이 프로토콜은 모두 telo의 동시 검출을위한 효율적인 방법을 제공단순한 및 기타 반복 이전에 기술 된 방법 (11, 12)에서 개선을 기반으로. C. 엘레 유충 또는 성인 고도로 분화 된 세포와 다세포 유기체이다. 세포의 텔로미어 이질성 스폿 다수의 정량적 분석을 방해한다. 분석 된 세포의 수를 최대화하기 위해 배아 절연 및 FISH 용 폴리 리신 코팅 된 슬라이드에 도포한다. 또한,이 프로토콜은 또한 면역와 결합 될 수있다. 프로토콜이 동작하는 증거로서, 우리는 두 가지 관찰 반복 서열을 정량화 할 수 있음을 보여준다. TALT1에 대한 DNA 프로브는 간단한 PCR은 디그 옥시 제닌-dUTP를 통합하여 생성되었습니다. 그런 다음이 TALT1 프로브와 형광 표지 텔로미어 PNA 프로브를 동시에 하이브리드 하였다. 그 후, 디그 옥시 제닌은 표준 면역 형광 방법에 의해 검출되었다. 우리는 여기 TALT1는 TRT-1의 텔로미어와 colocalized 대표 이미지를 제시 </em은&gt; 생존자.

<table><tbody><tr><td>PNA 프로브</td><td>PANAGENE</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207741910</td> PBST Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>에 희석된 1:200 사용NaOH를 몇 방울 떨어뜨린 DW에서 가열하여 4% 파라포름알데히드를 준비합니다. 10x PBS의 0.1 볼륨을 추가합니다.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>하이브리디자이톤 용액</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50% 포름아미드, 10%(w/v) 덱스트란 설페이트, 50 &#956; g/ml 헤파린, 100 &#956; g/ml 효모 tRNA, 100 &#956; g/ml 초음파 처리된 연어 정액 DNA</td></tr><tr><td>Hybridizaiton 세척 솔루션</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 50% 포름아미드</td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>독성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td> 원액 Dextran sulfate<td></td></tr><tr><td></td><td>에 대해 10mg/ml 만들기SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS 1L DW</td><td></td><td></td><td>용 : 80g NaCl, 2.0g KCl, 27g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2.4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>상업명은 Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine 용액(0.1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>M9</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>사용 전에 새로운 0.01% w/v 용액을 준비합니다.3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, NaCl 5 g, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L</td></tr><tr><td>표백 용액</td><td></td><td></td><td>20% 차아염소산나트륨, 0.5 M KOH</td></tr><tr><td>항체 완충액</td><td></td><td></td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% 아지드화나트륨(독성)</td></tr><tr><td>차단 용액</td><td></td><td></td><td>5% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 항체 완충액</td></tr> <tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE 헬스케어</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>1L, NaCl 175.3g, 구연산나트륨 88.2g, H2O를 1L, pH를 7.0으로 조정</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigenin-dUTP mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR 정제 컬럼</td><td>코스모제네텍</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>유리세정제 / ULTRA CLEAN</td><td>덕산 퓨어케미칼</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 글래스 슬라이드</td><td>MP 바이오메디컬</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>선충 성장 배지</td><td></td><td></td><td>1 L, NaCl 3 g, 한천 17 g, 펩톤 2.5 g, H2O를 974 ml에 만듭니다. 플라스크를 오토 클레이브하고 냉각시킵니다. 1M CaCl2 1ml, 에탄올 중 4mg/ml 콜레스테롤 1ml, 1M MgSO4 1ml, 1M KPO4 25ml를 추가합니다.</td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA,</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X가 대물 렌즈로 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>습한 챔버</td><td></td><td></td> DW 이미지 분석 소프트웨어에 <td>적신 종이 타월로 채워진 플라스틱 상자</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>피터 란즈도르프 박사</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</empna 프로브에와&gt; 하이브리드 (fish)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

텔로미어는 비정상적인 융합 및 분해로부터 염색체 말단을 보호하는 리보핵단백질 구조입니다. 텔로미어 길이는 텔로미어라제 또는 텔로미어의 대체 연장(ALT)으로 알려진 대체 경로에 의해 유지됩니다1. 최근 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 텔로미어와 ALT2 연구를 위한 다세포 모델 유기체로 부상했습니다. 게놈에서 반복적인 염기서열의 시각화는 텔로미어의 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 텔로미어 길이는 텔로미어 제한 단편 분석 또는 정량적 PCR로 측정할 수 있지만 이러한 방법은 평균 텔로미어 길이만 제공합니다. 반대로, FISH(Fluorescence in situ hybridization)는 세포 내 개별 텔로미어에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기에서는 형광 in situ hybridization에 의해 C. elegans의 텔로미어 길이를 결정하는 방법의 프로토콜과 대표적인 결과를 제공합니다. 이 방법은 형태학에 눈에 띄는 손상을 일으키지 않는 간단하지만 강력한 현장 절차를 제공합니다. 형광 표지된 펩타이드 핵산(PNA)과 디곡시게닌-dUTP 표지 프로브를 사용하여 예쁜꼬마선충 배아 및 생식선에서 텔로미어 반복과 ALT 주형(TALT)이라는 두 가지 다른 반복 염기서열을 시각화할 수 있었습니다.

그것은 이전에 해당 ALT 생존자는 내부적으로 &#39;ALT의 템플릿&#39;(TALT) 텔로미어 유지 보수 2 시퀀스 지역화 복제하여 낮은 주파수에서, TRT-1 (ok410), 텔로 머라 아제가 결핍 된 돌연변이 체에서 나타날 수 있습니다보고되었다. PNA 프로브를 사용하여, 우리는 해부 생식선 (도 2A)에서 텔로미어를 시각화 할 수 있었다. 희미한 텔로미어 신호에 TRT-1 (ok410)와 ALT 생존자를 모두 검출되었다. 퍼지 신호는 그들이 자기 ​​형광하지 않을 수 있음을 시사 만 DAPI와 중첩되었다. 전면 광고 텔로미어와 같은 반복 (ITR)는 지속적으로 C.의 연구에 TRF 분석에서 관찰된다 간스의 텔로미어 4,10. PNA 프로브의 특이성을 고려하면, 이들은 ITR은 게놈 전반에 걸쳐 분산 될 가능성이있다. <...

우리는 반복적인 염기서열을 관찰하고 정량화하기 위해 예쁜꼬마선충의 생식선과 배아에서 형광 현장 교잡화(FISH)의 간결한 절차를 보고합니다. 우리는 두 가지 다른 반복 서열, 즉 텔로미어 반복과 텔로미어의 대체 연장(TALT) 템플릿을 성공적으로 관찰하고 정량화했습니다.

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

본 형광 인 시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 기술의 전반적인 목표는 C.elegans의 텔로미어 수와 길이를 간결하게 분석하는 것입니다. 이 방법은 종양 재발, 텔로미어의 대안적 연장(alternative lengthening of telomeres) 및 세포 노화에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 절차가 간결하며 24시간 이내에 텔로미어를 시각화하고 정량화할 수 있다는 점입니다.잔해물이 없는 소량의 액체 배지와 함께 임신한 성체 벌레를 15 milliliter 튜브에 수집합니다. 이제 다음과 같이 벌레를 세 번 세척합니다. 총 부피가 15 milliliters가 되도록 M9 버퍼를 추가합니다.그 다음 튜브를 300 G에서 3분 동안 원심 분리하고, 벌레 펠렛 위의 상층액을 제거합니다. 이 과정을 반복합니다. 원심 분리 후 벌레가 떠 있다면, 원심분리기의 브레이크 강도를 낮추십시오.세 번째 세척 후, 벌레를 5 milliliters의 M9과 함께 둡니다. 그다음 6.5 milliliters의 증류수, 2 milliliters의 차아염소산염, 그리고 1 milliliter의 5 molar 수산화칼륨을 첨가합니다. 벌레를 이 표백 용액 내에서 50 RPM으로 교반하며 3분 동안 배양합니다. 이후 벌레를 볼텍싱하여 몸체를 절단하고 알을 분리합니다.해부 현미경 하에서 방출된 알을 확인합니다. 아직 알이 방출되지 않았다면 배양을 최대 8분까지 계속합니다. 벌레가 대부분 용해되어 알이 자유롭게 분리되었다면, 튜브에 M9을 채워 15 mL로 맞춘 후, 이전에 벌레를 세척했을 때와 동일하게 알을 세 번 세척합니다.M9의 대부분을 제거하고 세척한 알에 PBST를 채워 부피를 500 microliters로 맞춘 다음, 4%PFA 500 microliters를 첨가합니다. 이제 2%PFA에 담긴 알 40 microliter씩을 폴리라이신(polylysine) 코팅 슬라이드의 웰에 분주합니다. 그런 다음 슬라이드를 습윤 챔버로 옮겨 실온에서 15분 동안 배양합니다.본 프로토콜을 위해, -80 °C의 드라이아이스에 알루미늄 블록을 보관하십시오. 또한, 메탄올과 아세톤을 20 °C에서 보관하십시오. 고정 단계가 완료되면, 슬라이드에서 PFA 용액의 대부분을 제거하고 약 5 µL만 남기십시오.그 다음, 두 코팅된 표면이 서로 달라붙어 웰(well) 내의 조직이 고정되도록 각 샘플 슬라이드 위에 두 번째 폴리라이신(polylysine) 코팅 슬라이드를 덮습니다. 고정액이 너무 많으면 티슈로 닦아냅니다. 이제 슬라이드를 차가운 알루미늄 블록 위에 최소 15분 동안 놓아 동결시킵니다.그동안 슬라이드용 메탄올 및 아세톤 배스를 얼음 위에 준비합니다. 슬라이드가 얼면, 하나를 비틀어 샘플을 동결 파쇄(freeze crack)합니다. 위쪽 슬라이드는 버리고 아래쪽 슬라이드를 얼음처럼 차가운 메탄올에 5분 동안 담급니다.모든 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 동결 파쇄(Freeze cracking)를 통해 단단한 알껍데기를 뚫고 프로브와 항체가 침투할 수 있게 됩니다. 알이 성공적으로 동결 파쇄되었다면, 두 슬라이드 모두에서 알의 모습이 관찰될 것입니다.메탄올에 최소 5분 동안 둔 후, 슬라이드를 차가운 아세톤으로 옮겨 5분 동안 처리합니다. 이후 PBST에 5분씩 3회 담가 샘플을 세척합니다. PBST 세척이 끝난 슬라이드는 4°C의 100% ethanol에 수일 동안 보관할 수 있습니다.계속 진행하려면, 샘플 웰에 20 µL의 RNase 용액을 넣고 습도 조절 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 2x SSCT로 15분씩 2회 세척합니다. 두 번의 세척 후, 샘플에 20 µL의 hybridization 용액을 넣고 습도 조절 챔버에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다.그동안 이중 가닥 DNA 프로브를 준비합니다. 95 °C에서 5분 동안 변성시킨 후, 잠시 얼음 위에 놓아 냉각합니다. 1시간 후, 하이브리다이제이션 용액을 흡입하여 제거하고 프로브 용액을 첨가합니다.이 단계부터 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. 프로브를 추가한 후, 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 80 °C 가열 블록 위에 습윤 챔버를 만드십시오.열 블록이 다시 80°C로 안정되면, 샘플 슬라이드를 가온 챔버에 넣고 3분 동안 변성시킵니다. 그 다음, 처리된 모든 슬라이드를 37°C의 습윤 챔버에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 상온의 PBST에서 5분 동안 샘플을 세척합니다.준비를 위해, 세척 1시간 전에 하이브리드화 용액을 37°C로 가온합니다. 그런 다음 슬라이드를 하이브리드화 세척 용액이 담긴 병에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 하이브리드화 용액을 제거하려면, 상온에서 PBST로 샘플을 15분 동안 세척합니다.이 과정을 세 번 반복합니다. 마지막 PBST 세척액을 흡입하여 제거한 후, 각 시료에 블로킹 용액 20 µL를 넣고 습윤 챔버에서 실온 암실 상태로 한 시간 동안 배양합니다. 그 다음 블로킹 용액을 흡입하여 제거하고, 1:200로 희석한 FITC 접합 항-digoxigenin 항체 용액으로 교체합니다.슬라이드를 덮고 암실에서 실온으로 3시간 동안 배양합니다. 항체 염색 후, 암실에서 PBST로 샘플을 15분씩 2회 세척합니다. 다음으로 PBST를 흡입하여 제거하고 DAPI가 포함된 마운팅 용액 10 µL로 대체합니다.커버 글라스를 덮고 과잉 용액을 흡수하여 제거합니다. 마지막으로, 커버 글라스의 가장자리를 매니큐어로 밀봉한 후 형광 현미경으로 시료를 관찰합니다. PNA 프로브를 사용하여 텔로미어 충분 돌연변이에서 생존한 동물의 텔로미어를 관찰하였습니다.생식샘에서 핵당 텔로미어의 수는 정량화가 가능합니다. 텔로미어 신호가 TALT1 신호와 동일 위치에서 검출되었으며, 이는 TALT1이 텔로미어 없는 생존을 담당한다는 개념을 뒷받침합니다. 텔로미어 신호의 강도는 소프트웨어를 사용하여 비교하였습니다.ALT 생존자에서 나타난 신호는 텔로미어 결핍 돌연변이체를 생성하는 데 사용된 모주(parental strains)보다 더 강했습니다. 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 포름아미드(formamide)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

여기에서는 고정되고 손상되지 않은 선충에서 게놈 DNA를 시각화하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 비디오에는 수정되지 않은 예쁜꼬마선충 난모세포에서 염색질을 계수하는 프로토콜의 예가 포함되어 있습니다.

에탄올 고정 및 DAPI 염색: 예쁜꼬마선충에서 DNA를 시각화하는 방법

출처: Pigazzini, M. L., et. al. 노화 시 아밀로이드 구조의 특성화 C. 엘레간스 형광 수명 이미징을 사용하여. J. Vis. Exp. (2020). 이 동영상은 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)을 사용하여 C. elegans 뉴런에서 polyQ 단백질 응집을 평가하고 대조군 및 샤페론 단백질 결핍 기생충을 비교하는 방법을 보여줍니다. 샤페론이 결핍된 웜의 응집이 증가하면 군집된 형광단 간의 에너지 전달이 촉진되어 형광 수명이 단축됩니다. FLIM에서 생성된 색상으로 구분된 지도는 이러한 차이를 묘사하여 실험 그룹 간의 집계 수준을 강조합니다.

Caenorhabditis elegans 뉴런에서 PolyQ 단백질 응집의 형광 수명 이미징

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

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Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

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SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 형광 현장 하이브리드화(FISH)를 이용한 텔로미어 수와 길이 분석 방법을. 24시간 이내에 시각화 및 정량이 가능하여 종양 재생과 세포 노화 연구에 활용됩니다.

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광

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