Name: C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 C. elegans에서 광범위 식이 제한과 유전자 발현을 연결하는 계산 프레임워크를 통해 수명 변조 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요. 이 기법은 노화 신경생물학 연구에 필수적입니다.

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우리는 Bargmann 및 Horvitz 실험실을 시 약에 대 한 감사합니다. 일부 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 또한 원고에 대 한 의견 M. Lipovsek 감사합니다. 이 연구는 Wellcome 트러스트 (그랜트 087146 프로젝트: Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 및 BB/M00757X/1 Q.C.), 유럽 연구 위원회 Q.C. (NeuroAge 242666), 미국 국립 보건원 (R01AG035317 및 R01GM088333 H.L.에), 및 미국에 의해 지원 되었다 국립 과학 재단 (H.L., M.Z.에 0946809 GRFP에 0954578).

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저자는 공개 없다.

여기, 우리는 훨씬 광범위 한 식품 농도 보다 이전에 게시 프로토콜을 캡슐화 하는 식이 제한에 대 한 새로운 방법을 제시. 이 방법은 링크 C. 선 충 박사 문학에서 본 두 이전 별도 현상, 세균성 부족과 수 두 식이 효과 수 있도록 클래식 식이 제한 연구 한 프로토콜. 새로운 확장 범위 박사 패러다임을 사용 하 여, 특정 환경 큐에 응답에 단일 세포 유전자 발현을 검토 하 고이 셀 정보를 인코딩 하는 방법에 대 한 일반적인 프레임 워크 선물이. 우리의 프레임 워크 수명 및 양적 이미지를 각각 수행 하는 방법을 보여 주는 두 개의 실험 프로토콜을 광범위 한 범위에서 이러한 실험 프로토콜에서 박사 데이터 다음 시험 될 수 있다에서 제공 하는 전산 분석 다른 음식 조건에서 변화 유전자 식 수준이 나 수명에 의해 인코딩된 정보를 계량 하이 프레임 워크.
넓은 범위의 박사 패러다임을 사용 하 여 수명 실험 포함 6 가지 음식 수준 (표 1). 이 적은 음식 수준, 규정식 부족10,11 등에서 장 수 검사 또는 먹고 2 유전 배경35를 사용 하 여 보다 더 많은 접근을 필요로 합니다. 그러나, 단일 조건 하에서 수명에서 검토 박사에서 유전자의 역할의 해석을 제한할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 최근에 daf-7 돌연변이 야생 타입 동물12 (그림 1A)에 비해 음식 농도에 대 한 응답의 양방향 감쇠는 보여주었다. 식품의 부재, daf-7 돌연변이 야생 타입 동물에 비해 그들의 수명 단축을 표시 합니다. 우리만 식이 부족을 고려 했다, 만약 우리 것 이라고 해석 하는 daf-7 유전자, 만 수명 확장에 필요한 사실 daf-7 역할은 더 복잡 한 되 고. 따라서, 프로토콜의이 부분의 중요 한 결과 여부 관심사의 유전자를 설정 하는 음식에는 전체 수명의 변화에 대응을 변조에 관여입니다.
다른 방법에 비해이 프로토콜의 주요 장점 중 하나 자손 생산 수명 분석을 진행 하는 동물에서을 제거 하는 새로운 방법을 사용 한다는 것입니다. 대부분 연구 약물 FuDR를 사용 하 여 그들을 렌더링 하는 살 균 성인 생식의 확산을 억제. 그러나, 최근 학문 보여주었다 FuDR 치료 수명17,,1819,20,21, 호출 상태 및 유전자 특정 효과 가질 수 있습니다. 그것의 일반적인 적용을 질문입니다. 이 프로토콜에서 자손 생산의 24 시간을 통해 달성 된다 RNAi의 틴 달걀 껍질의 형성을 억제, 계란-5 유전자를 대상으로 동물의 치료 결과에 선 충 C. oocytes 수정 된 그들의 죽음의22,23. 이 방법의 장점은 매우 늦은 연기 고 그래서 C. 선 충에서 장 수의 주요 레 귤 레이 터는 생식 방해 하지 않습니다.
넓은 범위의 박사 프로토콜의 한 잠재적인 경고는 세균성 농도의 꽉 제어 되도록 세균 확산을 제어 하는 항생제의 사용에 대 한 의존도. 벌레의 용기 내의 세균 확산 C. 선 충16에서 죽음의 주요 원인이 될 알려져 있다. 따라서, NGM agar에 carbenicillin 같은 bacteriostatic 항생제를 사용 하 여 세균 확산을 방지 하 고 비 항생제 컨트롤16에 비해 벌레의 수명을 증가. 항생제, 리 팜 피신36 38항생물질 가족37,멤버 등 특정 유형의 박테리아에 미치는 영향에 관계 없이 C. 선 충 에서 수명 연장 표시 되었습니다. 확산입니다. 그러나, carbenicillin 또는 스 세균성 확산에 미치는 영향에 관계 없이 장 수를 증가할 수 있다 문학에서 증거가 있다.
수명 환경 정보, 신경 네트워크, 유전자 발현에 의해 라우팅 생리학에 전송 되는 복잡 한 계산의 출력으로 볼 수 있습니다. 어떻게 특정 유전자를 이해 하는 방법론을 제공 하는 우리의 프로토콜 환경 정보의이 흐름에 영향을 미칠. 이 문제를 해결 하려면 우리는 신뢰할 수 있는 이미지 처리를 단일 세포 수준에서 유전자 식 응답 분포를 결정 해야 합니다. 뿐만 아니라 음식 풍부에서에 유전자 발현의 평균 응답 변경 하지만 또한 큰 인구에서 전체 통계 분포 나타냅니다 우리의 방법의 적용에 대 한 중요 한 요구를 추정 수 있는. 음식 풍부한 유전자 식 응답의 정확한 설명을 특정 뉴런에 의해 정보 뿐만 아니라 신경 회로 의해 고용 된 코딩 전략 계량 정보 이론의 응용 프로그램 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법의 이미징 및 계산 측면 생물 학적 상황의 큰 집합에 적용 됩니다. 그러나 우리의 작업에서 우리 음식에 관련 된 작은 신경 네트워크에 감지,, 정보 처리 기능 분석에 국한 되지 않습니다 특정 셀 형식이 나 특정 환경 신호 집중. 미래에 이러한 방법론 큰 다양 한 생리 적인 출력에 영향을 미치는 입력된 변수를 잠재적으로 확장할 수 있습니다. 이러한 방식을 어떻게 유전자 규제 네트워크 부호화, 프로세스의 더 큰 이해에 기여 하 고 정보 전송 것입니다.

모든 유기 체는 감지 하 고 그들의 생존을 위해 환경에 변화에 대처할 수 있이 필요가 있다. 동물, 신 시스템 기본 검출기와 변환기의 환경에 대 한 정보는 고 생물의 생존1에 영향을 미칠 수 있는 모든 변화에 생리 적인 응답을 조정 합니다. 음식 풍부한은 환경 큐 여러 상황에 잘 공부 뿐만 아니라 채집2, 등 음식 관련 행동을 조절 하지만 또한 동물의 장 수에 미치는 영향입니다. 수명 변화 음식 풍부에 의해 변조 식이 제한 (DR)으로 알려진 현상 이며 광범위 한 진화 보존3.
꼬마 선 충 선 충 류는 근본적인 생물학 질문을 해결 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 기술의 과다 웜 게놈 RNAi 및 vivo에서 유전자 기술 편집 등의 조작을 허용 하는 개발 되었습니다. 벌레 및 광학 투명도의 작은 물리적 크기 또한 빌려 스스로 모두 transcriptional 및 변환 형광 기자 들의 비보에 이미징 및 높은 처리량 등의 기술 마이크로4유틸리티. 함께, 이러한 도구 어떻게 신경 회로 직접 동물 행동 검사 밝혀 될 수 있습니다.
C. 선 충 은 bacterivore 이며 여러 가지 방법이 세균성 농도5,6,7,8 조작 하 여 음식 풍부의 정확한 제어를 허용 하는 게시 된 . C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 박사 두 개의 다른 문맥에서 연구 되었습니다. 처음으로 다른 유기 체에서 음식 수준 감소에 대 한 응답에서 본 변화 거울 '클래식 닥터', 불릴 수 있다. 이러한 맥락에서 음식 풍부한 광고 libitum 수준에서 감소 결과 증가 수명에 최적에 도달 하면, 후이 지점 장 수 감소 음식6,7, 더 감소 될 때까지 9. 두 번째 컨텍스트는 박사 C. 선 충 에서 공부 하고있다 어떤 세균성 음식 소스10,11의 완전 한 제거로 벌레의 장 수 증가 규정식 부족 이다. Entchev 외. (2015)12, 우리는 박사가 두 개의 다른 패러다임에서 결과에 복잡성을 시험 될 수 있다 보였다 동시에 컨텍스트에서 우리 용어 '넓은 범위 박사'. 아래에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 유전자의 새로운 클래스 식별 박사에는 양방향으로 음식 풍요에 수명 응답을 조절 하 고 음식12 (그림 1)을 감지 하는 신경 회로에 관련 된.
환경 변화에 동물의 응답 생리학에 환경 정보를 전달 하는 복잡 한 규제 상호 작용을 감각 시스템을 연결 하는 생물학 과정의 순서를 통합 합니다. 같은 "정보 흐름"의 기계적 세부 사항 들은 알려진 하 고, 비록 다른 생물 학적 구성 요소 들이 복잡 한 계산 구성 방법을에 대 한 통찰력을 얻으려고 유전 도구를 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 작품에서 우리는 daf-7 , tph-1 식품 감지 신경 회로, 변조 선 충 C.12 수명 통해 음식 풍부에 대 한 환경 정보의 전송에 참여 보였다 , 13. 정보 이론14의 수학적 프레임 워크를 적용 하 여 우리 환경 정보, 비트, daf-7 와 유전자 식 변화에 의해 표현 되는 금액을 정할 수 있었다 tph-1 다른 음식 수준에서 특정 신경 세포에. 이것에서 우리 다음 (그림 2)이 신경 회로 어떻게 유전자 제어에 의해 고용 인코딩 전략을 밝히기 수 있었다.
다음 프로토콜에서 우리는 특정 신경 세포에 표현 된 관심사의 유전자의 영향 무엇 이며 어떻게 그들이 수명 환경에서 음식 정보 흐름에 참여를 이해 하는 데 필요한 단계를 개요. 광범위 하 게, 우리는 분리 두 실험 프로토콜에 계산 워크플로. 실험적인 측면에 대 한 그것은 돌연변이가지고 중요 한 광범위 한 범위에서 검사할 수 있는 관심의 유전자의 박사 충실 transcriptional 기자 다른 음식 수준에서 유전자의 식 수준을 정할 필요가 있습니다. 우리의 방법에서 설명 하는 전산 분석 수행 수 있도록, 데이터 집합 식 배포판의 의미 있는 견적을 제공 하기 위해 충분 한 크기의 필요 합니다. 비록 우리는 분석에 대 한 템플릿 소스 코드를 제공, 사용자는 우리의 계산 프레임 워크에 걸쳐 광범위 하 게 사용 되는 정보 이론의 언어에 잘 알고 있이 필요가 있다. 소스 코드는 R와 c + +에서 작성 됩니다. 따라서, 프로그래밍 능력의 특정 수준을 의미 있는 방식으로 그들을 적용 하는 데 필요한 이기도 합니다.

<table><tbody><tr><td>카르베니실린 디소듐 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1389-5G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>스트렙토마이신 황산염 시</td><td>그마-알드리치</td><td>S6501-50G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>; 이소 프로필 &beta; -D-1- 티오 갈락 토피라 노시드 (IPTG)</td> <td>RNAi 플레이트 용</td> <td>시그마-알드리치</td><td>I6758-10G</td> 유도제</tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td> S 기저에 사용되는 <td>시그마 알드리치</td><td>71380-1KG-M</td><td>및 NGM 한천</td></tr><tr><td>디 칼륨 인산염 (K2HPO 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05104.1000</td><td>S 기저 및 NGM 한천</td></tr><tr><td>이수소 인산염 칼륨(KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-1KG</td><td>S 기저에 사용되며 NGM 한천</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-1KG</td><td>NGM 한천</td></tr><tr><td>에 사용됩니다.염화칼슘 (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td>NGM에 사용</td></tr><tr><td>한천 수산화나트륨(NaOH)시</td><td>그마-알드리치</td><td>71687-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td> 표백에 사용 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨(NaClO)</td> 이미징에 사용<td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05614.2500</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Invitrogen</td><td>표</td>백에 사용 <td>12780052 박테리아 성장에 사용</td></tr><tr><td>Adavanced TC 6cm 조직 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628960</td><td>수명 플레이트</td></tr><tr><td>CellStar 10cm 조직 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>이미징 용 플레이트</td></tr><tr><td>Low Retention P200 팁</td><td>Brandt</td><td>732832</td><td>액체</td></tr><tr><td>한천</td><td>BD</td><td>214510</td><td>NGM, RNAi 및 NSC 플레이트용 Agar</td></tr> 박<tr><td>토 펩톤</td><td>BD</td><td>211820</td><td>NGM, RNAi 및 NSC 플레이트용 펩톤</td></tr> 액체 Agar 내 기생충 취급 팁</tbody></table>

c. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

감각 시스템 감지, 처리, 및 그들의 환경에 반응 하는 동물을 수 있습니다. 음식 풍부한 동물 생리학과 행동에 깊은 영향 환경 큐입니다. 최근에, 우리는 음식 풍부에 의해 선 충 류 꼬마 선 충 에서 장 수의 변조는 이전 인식 보다 더 복잡 한 것을 보였다. 음식 수준에 변화에 수명의 응답 신경 회로 내에서 처리 하는 정보를 제어 하는 특정 유전자에 의해 결정 됩니다. 우리의 프레임 워크 결합 유전자 분석, 높은 처리량 양적 이미징 및 정보 이론. 여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한과 생리 적인 관련성은 어떤 유전자의 특성 이러한 기법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 특히,이 워크플로 어떻게 관심사의 유전자 조절 수명 넓은 범위 식이 제한;에서 공개 하도록 설계 되었습니다. 다음 설정 어떻게 유전자의 표현 따라 음식 수준; 그리고 마지막으로, 제공 하는 정보의 양의 편견된 정량화를 환경에서 음식 풍부에 대 한 유전자 발현에 의해 전달. 신경 회로의 컨텍스트에서 여러 유전자를 동시에 검사 하는 경우이 워크플로 회로 의해 고용 된 코딩 전략을 파악할 수 있습니다.

야생 타입 N2 스트레인 함께 관심사의 유전자의 돌연변이 대 한 수명 실험을 실시 하 여 한이 유전자는 넓은-범위 박사 식품 응답에서 역할 여부를 설정할 수 있습니다. 야생 유형 응답 그림 1A에 묘사 된 것을 비교 해야 합니다. 돌연변이, 음식 조건, 비균일 효과로 반영이 응답의 어떤 변조는 이러한 유전자 올바르게 변화에에서 대응 하의 어느 지점 추가 조사에 음식 풍부 하는 벌레의 능력에 영향을 나타냅니다는 넓은 범위의 박사이 유전자의 식 응답 보증 된다. 그러나, 돌연변이의 장 수 응답 하지 않으면 크게 다른 야생 유전자는 적어도 평균 수명 수준에서 넓은 범위의 박사의 효과 시험 아무 역할이 있다. 변이 원인이 전체 수명 응답의 일정 한 변화 유전자 장 수에 음식에 관계 없이 영향을 미칠. 이 관심사의 유전자의 표정은 음식-응답, 정보가이 유전자에 의해 수행 하는 경우 수명에 전송 되지 않습니다 가능성 배제 하지 않습니다.
프로토콜의 다음 단계는 식 레벨 관심의 유전자에 대 한 광범위 한 범위의 박사에서 변경 하는 방법을 결정 하는. 그림 1B, 우리 daf-7, ASI 감각 신경에 있는 음식 수준에 변화에 대 한 응답을 보여주는의 transcriptional 기자의 식 레벨을 통해 이것을 설명 합니다. Daf-7(-) 돌연변이에 transcriptional 기자의 식 응답 변경 됩니다. 수명 수준에서의 유전자 정말 음식 반응 있다면 하나 그들의 식 음식으로도 변화할 것 이다 기대할 수 있습니다. 대응 하 게, 돌연변이 백그라운드로 transcriptional 기자 박사는 광범위 한 범위에 대 한 응답에서 변경된 식 프로필을 있어야 합니다. 그러나, 그것은 또한 가능한 야생 타입 백그라운드에서 관심사의 유전자의 transcriptional 기자 식에 어떤 음식 반응 변화를 표시 하지 않습니다. 이 상황에서이이 프로토콜의 범위를 벗어나는 post-transcriptional 규제 효과 나타낼 수 있습니다.
다이아나 외. (2017)13, 우리는 ASI에 daf-7 및 ADF 및 NSM tph-1 식 값 추출. 그림 2A, 우리는 주어진된 음식 수준 ASI와 ADF에 식 분포의 추정을 보여 줍니다. 단일 벌레 이미지에서 여러 해독 하는 데 뿐만 아니라 양의 전체 신경 회로 (그림 2B-2 C)의 조합 정보 뿐만 아니라 각 신경에 의해 독립적으로 인코딩 정보를 분석할 수 있습니다. 결합이 두 가지 정보 이론적 측정 음식에 대 한 정보를 전달 하는 뉴런에 의해 고용 하는 인코딩 전략 측면에서 시스템의 특성을 수 있습니다. 회로에서 중복의 금액 합계의 각 뉴런에 대 한 상호 정보 공동 상호 정보 (채널 용량) 회로의 조합 해독을 고려 하 여 얻은 빼서 여 얻어질 수 있다. 이러한 차이의 양수 값 부품 중 누적 정보는 실제 정보 전체 회로 의해 보다 큰 때문에 인코딩 전략의 중복 문자를 나타냅니다. 진정한 정보 인코딩 구성 요소 (그림 2B)의 합 보다 더 큰 때문에 반대로 음수 값 시너지 전략을 반영 합니다. 정보 및 중복 다이아나 외 에 예를 들어 유전자 규칙의 가능한 더 높은 순서 역할을 탐험 다른 genotypes에서 비교 될 수 있다 (2017) 13 daf-7 돌연변이의 효과 상승 (그림 2C-2D)를 중복에서 인코딩 전략을 전환합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg"> 
그림 1 : 넓은 범위 박사에서 수명 및 유전자 표현의 응답 야생 타입 N2 스트레인 (검은 선)의 (A) 평균 수명 박사는 광범위 한 범위에 대 한 복잡 한 응답을 표시 합니다. 이 응답의 크기는 daf-7 진 (레드 라인)의 null 돌연변이에 감쇠입니다. 오차 막대를 나타내는 평균, Entchev 그 외 여러분 에서 풀링된 데이터의 표준 오차 (2015) 12. 야생 타입 배경 (검은 선)에 daf-7 유전자에 대 한 transcriptional 기자 (B) 평균 식 수준 또한 광범위 한 범위 박사에 대 한 복잡 한 단조 비 응답 표시. Daf-7(-) 유전 배경에서이 transcriptional 기자의 식 높은 감쇠 하 고 음식 수준에 작은 변화에 대응을 보여줍니다. 오차 막대를 나타내는 평균, Entchev 그 외 여러분 에서 단일 재판에서 데이터의 표준 오차 (2015) 12. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg"> 
그림 2 : 계산 방법론. ASI로 그리드 차원 30 x 30을 사용 하 여 'ks' R 패키지에 ADF와 daf-7 식에서 tph-1 식의 2 차원 밀도 추정의 (A) 그림. Tph-1 및 daf-7 (전체)의 공동 식으로 인코딩된 정보 (B) 시각화 개별적으로 (부품의 합계) ADF, ASI 및 NSM 뉴런에 대 한. 중복 및 시너지 문자 인코딩의 오른쪽에 누적 세로 막대의 높이 전체 회로 의해 인코딩된 정보 사이 다름에 의해 표시 됩니다. (C) 식품 정보 야생 유형 동물 및 daf-7(-) 돌연변이 의해 사이 비교. (D) 상호 정보 돌연변이에서 관찰의 감소는 시너지 인코딩 쪽으로 스위치를 동반 된다. 패널 B-D는 다이아나 외. 에서 적응 (2017) 13. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>세균성 농도 (셀/ml)</td>
			<td>광학 밀도 (600nm)</td>
			<td>(이전)에서 희석 요인</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.12E + 10 일</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 일 09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 08 년</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 07 년</td>
			<td>0.316</td>
			<td>10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 07 년</td>
			<td>0.100</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S 기초)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 음식 수준 및 넓은 범위 박사에 사용 되는 희석 요인 박테리아l 농도 (셀/mL) 그들의 각각 OD600 측정 및 이전에서 각 농도 달성 하는 데 필요한 희석 요소는 광범위 한 범위 박사 프로토콜 사용.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">수명 실험 온도</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>하루</td>
			<td>12.5 ° C</td>
			<td>15 ° C</td>
			<td>17.5 ° C</td>
			<td>20 ° C</td>
			<td>22.5 ° C</td>
			<td>25 ° C</td>
			<td>27.5 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">신선한 NGM 접시에 모든 종자를 청크와 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">Daf-7(-) 긴장의 P0 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 5 접시) 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">강포한 유형 긴장의 P0 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 5 접시) 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">Daf-7(-) 종자의 f 1 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 90 접시) 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">강포한 유형 긴장의 F1 세대를 설정 하 고 (접시 당 1 L4, 30 접시) 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">F2 L4 애벌레를 선택 &gt; 계란 5 RNAi 플레이트 및 20 ° c (접시, 24 접시 당 15 L4) 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">NSC 판 2.0 e + 9 셀/ml 음식 수준 시드 1 일 오래 된 성인을 이동 하 고 20 ° C에서 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">NSC 접시 실험 음식 조건 시드 실험 온도 2 일 오래 된 성인 이동</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>전송</td>
			<td>전송</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>전송</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 다른 온도에서 실시 하는 수명에 대 한 일정. 예제로 daf-7(-) 및 야생 유형 긴장을 사용 하 여 서로 다른 온도에서 넓은 범위의 박사 수명 실험 설정 하는 데 필요한 단계의 개요 개요. 각 실험 식품 수준의 신선한 번호판 전송 수 온도 증가 함께 감소 합니다. 이것은 높은 온도에서 동물 더 빠르게 노화 사실과 그래서 더에 대 한 계정에 전송 물리적 손상 하는 경향이 있다.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>일</td>
			<td>Ima</td></tr></tbody></table>깅 파이프라인
		
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>Daf(-) 배경에서 청크 기자 변종입니다. 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>야생 타입 백그라운드에서 청크 기자 변종입니다. 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>Daf-7(-) 기자 긴장의 P0 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 2 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>야생 타입 기자 긴장의 P0 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 2 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>Daf-7(-) 기자 종자의 f 1 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 12 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>야생 타입 기자 종자의 f 1 세대를 설정 합니다. 10 cm NGM 접시 당 3 L4 애벌레를 사용 합니다. 4 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>오후에 daf-7(-) 기자 긴장을 표 백제 (~ 5 분) 3 10 cm NGM 접시에 달걀을 입금 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>표 백제 야생 타입 기자 (~ 10) 오전 아침에 예금 NGM 접시 3 10 cm에 계란 긴장과 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>L4 10 cm 달걀 5 RNAi 접시를 씻는 다. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>NSC 판 2.0 e + 9 셀 시드 1 일 성인 세척/ml. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 여 그리고 20 ° c.에 유지</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>NSC 판 워시 2 일 성인 실험적인 음식 수준으로 시드. 긴장과 변화 당 3 접시를 사용 하 여 실험 온도.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>신선한 NSC 접시에 전송. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 실험 온도에서 유지.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>신선한 NSC 접시에 전송. 스트레인 당 3 접시를 사용 하 고 실험 온도에서 유지.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>접시에서 동물을 선택 하 고 이미지에 대 한 준비.</td>
		</tr>
	

표 3: 이미징 파이프라인에 대 한 일정. 넓은 범위의 박사 이미징 실험 다른 온도에 daf-7(-) 및 야생 유형 배경 예제로 형광 transcriptional 기자 종자를 사용 하 여 설정 하는 데 필요한 단계의 개요 개요.

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

이 프레임워크의 전반적인 목표는 광범위한 식단 제한과 관련된 유전자를 식별하고, 발현 수준에 의해 인코딩된 환경 정보를 정량화하고, 환경과 수명을 연결하는 기본 코딩 전략을 이해하는 것입니다. 이 방법은 노화 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는데, 예를 들어 어떤 유전자가 수명을 조절하기 위해 환경으로부터 정보를 전달하는지 등이다. 이 프레임워크는 C 엘레간 감각 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 구성 요소가 협력하여 환경 정보를 처리하는 모든 생물학적 시스템에 보다 일반적으로 적용될 수도 있습니다.이 기술의 주요 장점은 뉴런 그룹에 의해 인코딩된 환경 정보를 정량화하고 이 정보를 다운스트림 타겟에 전달하기 위해 neuroselquites가 사용하는 코딩 전략을 결정한다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MGM 플레이트에서 OP50을 배양한 후 2리터 삼각 플라스크에 500ml의 LB 배지를 준비하고 오토클레이브합니다. 각 플라스크에 OP50 단일 콜로니를 접종하고 약 14시간 동안 섭씨 37도 및 200RPM에서 배양물을 성장시킵니다.다음으로, 스트렙토마이신(streptomycin) 밀리리터당 50마이크로그램으로 배양액을 보충합니다. 그런 다음 플라스크를 섭씨 30도에서 37분 더 흔든 다음 플라스크를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 각 배양액 450ml를 별도의 500ml 멸균 원심분리기 병에 옮기고 남은 배양액을 박테리아의 농도를 결정하는 데 사용되므로 얼음에 보관합니다.4500 x G와 섭씨 4도에서 25분 동안 병을 회전시킨 다음 상층액을 버리고 병을 얼음 위에 보관하십시오. 900마이크로리터의 멸균 LB로 각 플라스크에서 남은 배양액 100마이크로리터를 희석합니다. 1ml의 멸균 LB를 사용하여 분광 광도계를 영점화한 다음 각 배양물의 10배 희석의 OD600을 측정합니다.예를 들어, 야간 배양의 10배 희석의 OD600이 0.28인 경우 배양물의 실제 OD600은 2.8입니다. 이 예에서 1.12 x 10의 작업 스톡 용액에서 10번째 OP50 셀(OD600 56과 동일)에 도달하려면 원래 부피의 20분의 1 또는 22.5밀리리터의 멸균 S 기저 용액 또는 SB에 스트렙토마이신 50마이크로그램을 보충한 450ml 배양액의 펠릿을 다시 현탁합니다. 이 표에 나열된 희석 계수를 사용하여 작업 재고의 연속 희석에서 SB 및 연쇄상구균의 실험에 사용되는 모든 후속 농도를 만듭니다.텍스트 프로토콜에 따라 C Elegans 리포터 균주를 배양 및 동기화한 후 15ml의 SB를 사용하여 3개의 플레이트에서 웜을 연속적으로 세척하고 멸균 15ml 튜브에 액체를 수집합니다. L4 유충이 자연적으로 침전되도록 한 다음 약 0.5ml의 액체를 제외한 모든 액체를 흡입합니다. 야생형 리포터 균주에서 이 유형은 L4.In 돌연변이 배경보다 어린 유충을 제거하며, 이 단계는 OK3125가 사망한 경우 우리와 같이 포획된 유충을 제거하는 데 도움이 됩니다.그런 다음 9ml의 SB를 사용하여 웜을 다시 현탁시킵니다. 다시 말하지만, L4 유충의 침강 속도를 모니터링한 다음 이 과정을 반복하기 전에 대부분의 L4 유충이 펠릿화되면 약 0.5ml의 상층액을 제외한 모든 것을 흡인합니다. L4 유충이 포함된 액체에 0.1% 플루로닉 F127이 보충된 10마이크로리터의 멸균 S 기저 배지를 추가합니다.이것은 계면 활성제 역할을하며 유충이 플라스틱 피펫 팁의 내부 표면에 달라 붙는 것을 방지합니다. P200 low retention 피펫 팁을 사용하여 유충을 부드럽게 다시 매달아 놓은 다음 5 x 225 microlit의 egg five RNAi 박테리아가 파종된 3개의 10cm RNAi 플레이트에 150 microlit를 분취합니다. 벌레가 5개의 박테리아 잔디밭 모두에 균등하게 분포되어 있는지 확인하십시오.액체가 한천에 흡수되면 세척 절차로 제거되지 않은 플레이트에서 L4가 아닌 유충을 수동으로 제거하여 제거합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 20도에서 24시간 동안 보관하십시오. 광범위한 DR을 시작하려면 이전의 수동 제거 단계에서 벗어난 어린 유충을 모두 제거하고 접시에 하루 된 성충만 남깁니다.각 균주에 대해 15ml의 멸균 SB 연쇄상구균을 사용하여 3개의 플레이트에서 15ml 튜브로 1일 된 성인을 씻습니다. 지렁이가 자연적으로 침전되도록 한 다음 0.5ml를 제외한 모든 상층액을 흡입합니다. 9.5ml의 SB 연쇄상구균으로 기생충을 다시 현탁시키고 침전 및 세척 단계를 반복합니다.0.5 밀리리터의 상층액을 제외한 모든 용액을 최종 세척하고 흡인시킨 후 10 마이크로리터의 SB 플루를 추가하고 P200 피펫 팁을 사용하여 유충을 부드럽게 다시 매달아 놓습니다. 100 마이크로 리터의 유충을 5 x 225 마이크로 리터의 박테리아가 파종 된 NSC 플레이트에 2 x 10에서 밀리리터 당 9 번째 세포의 농도로 분주합니다. 100마이크로리터를 5개의 박테리아 잔디밭 모두에 고르게 분포시킵니다.현미경으로 접시에 존재하는 동물의 수를 추정하여 접시 당 100 마리에서 150 마리 사이의 벌레를 목표로합니다. 이 범위 내에서 웜 밀도를 달성하는 데 필요한 액체의 부피를 결정한 다음 두 개의 추가 플레이트에 분취합니다. 첫 번째 플레이트의 웜 수도 이 범위에 속하도록 조정합니다.그런 다음 플레이트를 섭씨 20도에서 24시간 동안 보관하십시오. 다음날, 이틀 된 성충을 모아 실험적인 음식 농도에 대한 욕구로 씨앗을 뿌린 새로운 NSC 플레이트에 벌레를 배포합니다. 액체가 한천에 흡수되면 플레이트를 24시간 동안 원하는 실험 온도로 이동합니다.다음 날, 생후 3일 된 성체를 모아서 동일한 실험 농도의 음식으로 씨를 뿌린 신선한 NSC 플레이트에 분배합니다. 액체가 한천에 흡수되면 플레이트를 48시간 동안 실험 온도로 되돌립니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 조립하고 정량화하기 전에 미세유체 장치를 사용하여 동물을 이미지화합니다.여기에서 볼 수 있듯이 야생형 n2 균주의 평균 수명은 광범위한 DR에 대한 복잡한 반응을 나타냅니다. 이 반응의 크기는 daf-7 유전자의 모든 돌연변이에서 약화되는데, 이는 이 유전자가 먹이 풍부도의 변화에 올바르게 반응하는 벌레의 능력에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. daf-7 유전자 및 야생형 배경에 대한 전사 리포터의 평균 발현 수준은 또한 daf-7 DR.In 광범위한 범위에 대해 복잡한 비단조 반응을 나타냅니다(유전적 배경, 이 전사 리포터의 발현은 매우 약화되어 있으며 식품 수준의 변화에 대한 반응이 거의 없습니다. 이 그림은 주어진 식품 수준에 대한 ADF 뉴런에서 TPH1 발현과 ASI 뉴런에서 daf-7 발현의 공동 분포 추정을 보여줍니다.이 막대 그래프는 TPH1 및 daf-7의 유전자 발현 수준을 기반으로 ADF, ASI 및 NSM 뉴런에 의해 조합 또는 개별적으로 인코딩된 식품 정보를 나타냅니다. 인코딩의 중복적이고 시너지 효과가있는 문자는 오른쪽의 누적 막대의 높이 차이와 전체 회로에 의해 인코딩 된 정보로 표현되는 뉴런으로 인코딩 된 조합 정보와 개별 정보를 비교한 결과입니다. 이 절차를 시도하는 동안 코딩 전략을 정량화하기 위한 정보 이론의 복제에는 유전자 발현 분포의 정확한 추정이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이러한 이유로 표본 크기는 이 프레임워크의 일반적인 적용 가능성에 중요한 요소입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 식량 풍요와 수명을 연결하는 새로운 유전자를 식별하고 특성화하기 위해 광범위한 식단 제한 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

여기에 단단한 판 기반식이 제한을 수행하는 프로토콜을...

솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

여기, 선물이 편차를 줄이기 위해, 재현성, 개선 및 해석을 용이 하 게 하기 위해에서 RNA, DNA, 그리고 동일한 샘플에서 단백질의 격리에 대 한 프로토콜.

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

학습하세요 C. elegans에서 광범위 식이 제한과 유전자 발현을 연결하는 계산 프레임워크를 통해 수명 변조 메커니즘을 규명하는 방법을 배우세요. 이 기법은 노화 신경생물학 연구에 필수적입니다.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

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