Name: 내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 학습하세요 다중 전극 어레이를 사용하여 병아리 배아 척추 신경 네트워크에서 비스페놀 A의 효과를 평가하는 방법을. 이 기술은 발달 신경생물학 및 환경 독성학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NSF (HBCU 업 연구 개시 수상, HRD 1401426 및 EPSCoR EPS-0814251)와 NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1)에 의해 지원 됩니다. 캔사스에서 델라웨어 INBRE III 6404 친교에 의해 지원 됩니다.

아래에 주어진 프로토콜 (초기) embryogenesis, 동안 BPA 노출의 효과 테스트를 표준화 하 고 BPS, BPF, 또는 병아리 배아 뉴런에서 다른 EDC와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 델라웨어 주립 대학의 제도적 정책 및 조류 배아에 대 한 NIH 정책 다음과 같습니다. 프로토콜은 DSU의 재료와 화학 안전 지침 확인입니다.
1. 소재 설정
<ol><li>1 m m 재고 솔루션 (10% 에타 놀의 mL 당 0.23 m g)을 물에 10%의 에탄올 (v/v)에서 BPA (m.w. 228.29)을 분해. Neurobasal 매체에 후속 희석 (0.1 µ M, 0.5 µ M, 1 µ M, 5 µ M 그리고 10 µ M)를 확인 합니다. 주의: BPA는 환경 독 소 그리고 분말을 처리할 때 주의 행사 해야 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 상용 탁상 계란 인큐베이터에서 병아리 알 품 어 E7 배아에 대 한 일 동안 알을 품 어.</li>
	<li>3 ~ 4 h 70% 에탄올에 몸을 담글 하 여 측정 Sterilize MEAs의 필요한 수를 준비 하 고 세 번 약 10 mL BSLII 후드에 멸 균 증류수에 씻어. 참고:는 MEAs는 8 x 8 표에 배열 64 성공 백 금 전극 포함. 전극 직경 30 µ m 이며, 전극 사이의 간격 200 µ m 이다. 로이 MEA의 부식으로 이어질 것입니다 MEAs는 살 균에 대 한 변성된 에탄올을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>(무 균 상태를 유지)에 뚜껑 살 균 컨테이너 내부 MEAs 장소 테이블 상단 인큐베이터로 이동. 55 ° c.에 적어도 6 시간 동안 구워 이 단계는 적절 한 살 균을 위해 중요 하 고 온도 60 ° c.를 초과 하지 않아야 합니다. 무 균 유지, 추가 사용까지 MEAs 스토리지에 대 한 BSLII 후드를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 참고: 우리는 플라스틱 뚜껑 오븐 안전한 유리 베이킹 접시 사용 하 고 표면 70% 에탄올과 건조에 대 한 BSLII 후드에서 소독.</li>
	<li>약 수 엑스트라 세포 매트릭스 ECM 솔루션입니다. 밤새 4 ° C에서 유리병을 녹여 및 동결-20 ° c.에 100 µ L aliquots 참고: ECM 냉동 배송입니다. ECM 해야 하지 주어질 실내 온도에 준비까지 코트와 실내 온도에 polymerizes, 그것 생산, 일단 코트 수는 없습니다. ECM 성장 인자 없이 알 수 없는 요인으로 인해 추가 효과 방지 하기 위해 선호 된다.</li>
	<li>모든 해 부 악기 (Dumont #5 집게, 곡선된 겸 자, 작은 위, 및 봄이 위) 소독 자체 씰링 소재 70% 에탄올과 해 부 요리를 코팅 하 고 절 개 후드에 말리.</li>
</ol>2. 병아리 배아 신경 문화와 네트워크 활동
<ol><li>도금의 날, 제거 된 유리병-20 ° C 냉동 고에서 ECM의 70% 에탄올 스프레이 얼음에. BSLII 후드 안쪽에 300 µ L 찬 neurobasal 매체를 추가 하 여 25% 희석.</li>
	<li>p 200를 사용 하 여 pipetteman을 터치 전극 표면에 박막을 떠나 즉시 제거 돌보는 MEA의 중심에 25 %ECM 100 µ L를 추가 합니다. MEA를 커버 하 고 신경 세포를 접시에 준비까지 CO2 배양 기 (37 ° C, 5% CO2)에 배치.</li>
	<li>70% 에탄올과 E7 달걀 (배아 7 일, 7 일 동안 37 ° C에서 incubated)의 외피를 소독. 감기 균 행 크의 균형 염 솔루션 (HBSS) 칼슘 없이 포함 된 Sylgard 하단 해 부 접시에 배아를 목을 벨. 눈 주위 고 눈알을 제거. 집게를 잘 몬 트 # 5를 사용 하 여 봄이 위 복 부에 절 개를 확인 하 고 개 및 광학 tectum 폭로 피부의 바깥 층을 제거. 껍질 하 고 신중 하 게 pial 멤브레인을 제거 합니다. 다른 페 트리 접시에는 개를 전송 하 고 봄이 위 약 2 m m의 작은 조각으로 잘라. 참고: 거기 해서는 안됩니다 pial 막의 제거 후에 개에 연결 된 어떤 혈관. 비록 우리 악기와 해 부 지역 70% 에탄올으로 소독 철저 하 게은으로 절 개 후드 밖에 서 수행 하는 경우 상당히 좋은 결과 얻은 그것은 메 마른 절 개 후드, 해 부를 수행 하는 것이 좋습니다 가능한 경우, .</li>
	<li>살 균 전송 피 펫을 사용 하 여, 15 mL 원심 분리기 관으로 개 조각을 수집 하 고 제거 가능한 HBSS 개 싱크 분리기 튜브의 바닥의 조각을 시키는 후.</li>
	<li>0.05%의 1 mL을 추가 트립 신/EDTA (37 ° C에 미리 예 열)와 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 조직 조각을 방해 하지 않고 트립 신을 제거 하 고 1 mL neurobasal 매체를 추가. 조직 싱크대 바닥에 조각 하 게 하 고 매체를 제거 합니다. 이 세척을 한 번 더 반복 합니다. 이 단계는 트립 신/EDTA를 씻어.</li>
	<li>Neurobasal 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 분쇄 시작. 분쇄는 메 마른 불 광택 파스퇴르 피 펫을 복용 하 고 그것을 통해 조직의 여러 번 통과 부드럽게 조직의 아니 더 많은 조각을 볼 수 있습니다 때까지 포함 한다. 어떤 부분이 반복된 패스 후 남아 있으면 그냥 두고 바닥에 정착. 참고: 분쇄-거품은 형성 중지 하 고 열망 하 여 제거 하는 동안 볼만 하지 마십시오.</li>
	<li>Neurobasal 매체와 다시 중단된 셀 1시 10분 희석 하 고 Trypan Blue 염료와는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀. 믹스 50 µ L 희석된 셀의 0.5 mL 원심 분리기 튜브에서 Trypan 블루 솔루션의 50 µ L로. hemacytometer에는 coverslip에 배치 후 10 µ L을 추가 하 고 밝은 명확한 셀 (파란색 셀 죽 었 고 계산 한다). 참고: 단일 E7 광섬유 tectum 범위 1와 5 x 107 셀/mL 사이에서 일반적인 셀 번호.</li>
	<li>천연 접시 ECM에 세포 코팅 MEAs 2200 셀/평방 mm의 밀도. 우리의 나 시스템에 대 한이 MEA 당 약 130000 셀 변환 됩니다. 밤새 셀 첨부 파일 및 neurite 연장 (그림 1)에 대 한 CO2 인큐베이터에서 MEAs을 1 ml는 MEA에 볼륨을가지고 neurobasal 매체를 추가 합니다. 참고: 다른 분야와 전극 숫자의 MEAs에 대 한 다른 셀 밀도 수 시도-일반적으로, 더 높은 세포 조밀도 결과 더 큰 네트워크 활동, 하지만 또한 짧은 살린된 문화.</li>
	<li>다음 날, neurobasal 매체에 10 µ M의 최종 농도에 대우 MEA 단계 1.1에서에서 만든 1 m m 재고에서 BPA를 추가 합니다. 제어 MEA 물 (v/v) 솔루션에서 10% 에탄올의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>대체 보냈다 매체 neurobasal 매체 포함 10 µ M BPA 매일까지 7 일에서 생체 외에서 (7DIV) 그 후, 매일 네트워크 활동 증가. 참고: 네트워크 활동 증가, 신진 대사 활동 증가 하 고 미디어 변경 내용을 더 자주 필요. 중간을 오렌지를 설정 하지 마십시오.</li>
</ol>3. 신경 네트워크 활동을 기록
<ol><li>수집의 날, 신선한 neurobasal 매체와 문화 매체를 교환 하 고 녹음 하기 전에 2 h의 최소 CO2 배양 기에는 MEAs를 반환 합니다. 레코딩 소프트웨어를 시작 하 고 37 ° C에 온도 아이콘을 클릭 하 여는 MEA의 온도 설정 (보충 그림 3.1a-b). 참고: 녹음 도금의 3 일 일찍 시작할 수 있습니다 및 문화 살아 있는 계속할 수 있습니다.</li>
	<li>(아래 왼쪽된 창 패널에서 스트림) "뮤 즈" 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 인수 매개 변수를 놓으십시오, "추가 처리" 및 "스파이크 탐지기"를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. "탐지기 스파이크 (6 x 표준)" 파일 이름 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.2a-b).</li>
	<li>다음 스파이크 검출기에 오른쪽 클릭, "추가 처리" 및 "파열 탐지기"를 선택 하 고 팝업 창에서에서 확인을 클릭 합니다. "탐지기 버스트" (ISI) 뮤 즈 아이콘 아래에 나타납니다 (보충 그림 3.3 a-b).</li>
	<li>다음 버스트 검출기에 오른쪽 클릭, "추가 처리"와 "신경 통계 컴파일러." 선택 팝업 창에서에서 파일 헤더, 잘 통계 집계 및 Synchrony 선택 되었는지 확인 합니다. 클릭 확인입니다. "통계 컴파일러" 아래에 표시 됩니다 (보충 그림 3.4 a-b). 참고:이 적응형 임계값 (6 x 표준 필터), 5, 평균 발사 속도 감지 10에 스파이크의 최소한 100 ms에 간 스파이크 간격을 설정 합니다 synchrony 매개 변수 20 ms에서와 최소 스파이크 속도 분 당 0.083333 스파이크에서 s.</li>
	<li>하단에 시계 아이콘을 클릭 하 여 녹음 시간 5 분 (300, 000 밀리초)에 대 한 예약된 녹화를 설정 합니다. 이 모든 5.1 분을 기록 하 고 5 분 동안 기록에 대 한 설정 섹션에서 정보를 변경 하 여 이루어집니다. 이 즉시 시작 될 것 이다 하 고 한 번 실행 될 것 이다 (보충 그림 3.5).</li>
	<li>MEA의 온도 MEA를 이동 하기 전에 37 ° C를 도달 했습니다 확인 하십시오. 인큐베이터에서는 MEA를 제거 하 고 기록 단위에 배치는 MEA를 잠글. 시작 예정 된 녹음 섹션에서 시작 레코드 또는 "파일 재생" 창에서 기록 아이콘을 클릭 하 여 네트워크 활동을 기록 합니다. 일반적으로, 5 분 (300, 000 밀리초)의 녹화 시간, 충분 하다 비록 더 이상 녹음 최대 10 분의 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>녹음 후 인큐베이터에는 MEA를 반환 합니다. 참고: 합니다 주의 불 임을 유지 하 고는 MEA가 인큐베이터 밖에 시간을 최소화 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>오프 라인 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 원시 데이터의 분석을 수행할 수 있습니다. 파일 풀 다운 메뉴 클릭 하 고 녹음을 엽니다. 원시 데이터 파일 분석을 선택 합니다. 필요한 급격히 매개 변수 캡처 원시 녹음 재생.</li>
	<li>스파이크의 평균 수를 얻으려면 스파이크 검출기 모듈을 사용 하 고 Synchrony 인덱스를 얻기위한 신경 통계 컴파일러 모듈을 사용 합니다.</li>
	<li>스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 (제 3) 하기 전에 통계 컴파일러 모듈 로드 합니다.</li>
	<li>스파이크 검출기, 버스트 검출기 및 통계 컴파일러 모듈 창 내에서 풀 다운 메뉴에서 스파이크 목록, 네트워크 버스트 목록 및 고급 통계, 각각 선택 합니다.</li>
	<li>감독된 폴더에.csv 파일을 만듭니다 있는 데이터 파일을 기록 하려면 기록 단추를 클릭 합니다. 스파이크 매개 변수-스파이크와 Synchrony 인덱스의 총 수-.csv 파일에 기록 됩니다. 참고:이 프로세서 시간과 컴퓨터 리소스를 사용할 수 원시 데이터를 기록 하는 동안 실시간으로 분석 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

급속 한 성장 및 embryogenesis 등 개발의 단계는 BPA를 포함 한 다양 일 분 비 방해 화합물의 해로운 효과에 특히 취약 합니다. 우리 생체 외에서 척추 신경 네트워크 모델에 BPA 노출의 효과 연구에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 BPA synchrony 인덱스 개발 신경 네트워크 (그림 2-b)로 서 스파이크 속도 낮추고 설립.
우리의 방법론은 BPA 노출 초기 embryogenesis 동안 공부 고 다른 EDCs의 효과 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다. 여자에서 배아 신경 문화 쥐 또는 마우스를 포함 하 여 다른 척 추가 있는 모델에 비해 상대적으로 쉽게 설정 수 있습니다. 또한, 필요는 없습니다 별도 동물 방-실험실 벤치에 간단한 보육은 이러한 분석을 수행 하기에 충분 한입니다. 우리는 네트워크 활동에 EDC, BPA의 영향을 평가 하기 위한 멀티 전극 시스템 (MEA)의 사용을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요 한 측면은 무 균의 유지 보수. 이 포함 하는 무 균 조건 하에서 배아의 해 부-70% 에탄올과 살 균 행 크의 균형 염 솔루션의 사용 악기를 살 균 하는 것입니다 충분 한. 데이터가 주 기간 동안 수집, 그것은 살 균 처리는 MEAs의 유지에 중요 한입니다. 일단 설립 신경 문화 수 수 경작 장기-최대 3 개월-고 따라서 EDCs 및 신경 네트워킹에 다른 화합물에 장기 노출 공부 하는 데 유용. 이 프로토콜의 또 다른 중요 한 측면은 도금을 해 부에서 시간. 최적의 시간은 trypsin으로 직물의 외피를 포함 하 여 30 분입니다. 더 이상 시간을, 셀의 가난한 생존.
여기 어떤 화학 또는 행동과 신경 기능에 영향을 주는 약물의 평가에 적용할 수 있는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 여기, 우리는 m m2당 2200 셀의 셀 밀도 사용 그러나,이 수정할 수 및 다른 셀 밀도 사용 될 수 있다. 일반적으로, 우리는 셀 밀도 증가 네트워크 활동-짧은 시간에 더 많은 스파이크 나타났습니다. 방법 설명, 네트워크 활동에 화학 물질의 효과 사정에 매우 유용 하지만 한계는. 방법의 가장 큰 한계 중 하나입니다 이러한 생체 외에서 문화 2 차원 척추 뇌의 3 차원 구조를 반영 하지 않을 수 있습니다. 이 슬라이스 기록을 사용 하 여 극복할 수 있습니다. 또 다른 대안은 이다, 발전 병아리 태아 치료를 적용할 의미 계란15의 광범위 한 끝에 작은 창, 치료 처방의 끝에 뇌를 해 부하는 vibratome에 두꺼운 부분 고 대 한 MEA에 배치 네트워크 활동을 기록합니다.
우리의 프로토콜 네트워크 활동의 개발에 EDCs의 효력의 검사를 가능 하 게 하 고 이러한 화학 물질의 효과 대 한 기계적으로의 탐험을 제공 한다는 점에서 중요 하다.

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, 일반적으로 언급으로 Bisphenol-A 또는 BPA, 산화 첨가제에에서 있으면 다양 한 폴 리 카보 네이트 및 열 종이에서 배열 하는 에폭시 수 지 기반 제품, Cd, 및 균열 증거 유리 안쪽에의 코팅 음료 캔. BPA 에스트로겐1을 내 분 비 방해 대리인 것으로 알려져 있다, 비록 그것의 병에 효과에 BPA 매일 우연한 노출 때문에 대 한 연구는 주로 마지막 10-15 년에 밖으로 나와. BPA 노출도 낮은 레벨의 결과 어머니2,3의 노출을 통해 embryogenesis 동안 포함 한 초기 발달 기간에 가장 심오한. Utero에서 노출 여성 태아의 내 분 비 방해 화학 물질에는 또한 유 방 암4,5질에서 증가 질병 민감성에 연결 되었다. 동물 연구는 BPA에 노출 리드 비정형 뇌 구조와 기능 이상이 동작6에 설명 했다. 결과적으로, 유아 젖 병에 BPA 사용 하 여 유럽과 북미 지역, FDA 등에서 가장 규제 기관에 의해 금지 되었습니다. 규정 준수, 많은 제조 업체 4, 4'-sulfonyldiphenol 또는 bisphenol-S (BPS)로 전환 합니다. BPA와 BPS 인 구조 아날로그와 최근 보고서 estrogenic 전사7BPS의 유사한 효능을 보였다는 사실에 근거한 BPA 기준으로이 화합물의 독성 연구 중요 하다.
여기는 병아리 태아 척추 모델을 사용 하 여 신경 세포의 네트워크에 BPA (및 다른 EDCs)의 효과 테스트 하는 프로토콜에 설명 합니다. 생체 외에서 문화 뉴런의 시 냅 스 연락처를 형성 하 고 (스파이크 라고도 함) 하는 활동 전위를 생성. 이러한 문화의 급격히 활동 다중 전극 배열 (MEA) 시스템을 사용 하 여 기록할 수 있습니다. 스파이크는 synchrony에 있을 때 그들은 서로 5 ms 이내 발생으로 간주 됩니다. 결국 동기화 초기 랜덤 급격히 활동 신경 네트워크8,9개발의 핵심 기능입니다. Synchrony 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 될 수 있다 그리고 몇 가지 알고리즘 문학9,,1011에 설명 되어 있습니다. 우리의 분석에서 우리는 MEA 수집 시스템 드라이브 레코딩 소프트웨어에 통합 되어 있는 동료와 Paiva12 에 의해 개발 된 알고리즘을 사용 합니다. 미 발달 병아리 뉴런의 강력한 스파이크 활동 신경 네트워크 활동13에 BPA의 효과 공부에 대 한 프로토 타입을 제공 합니다. 관찰 기록 급격히 활동 다중 전극 배열 사용 하 여, BPA 노출 신경 스파이크 synchrony9,14의 개발을 억제 합니다. 여기, 우리는 병아리 배아 문화에 신경 스파이크 synchrony의 개발에 대표적인 결과 함께 문화에 병아리 태아 신경에 BPA 노출 공부에 대 한 상세한 방법론을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>#5 foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Axion Muse MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M64-GL1-30Pt200</td><td>원고에서 MEA 시스템으로 불림</td></tr><tr><td>Axis Software</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>원고에서 녹음 소프트웨어로 불림</td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>현지 농장 또는 Spafas</td><td></td><td></td>에서 얻은<td>수정된 닭 달걀</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소, 페놀 레드-프리</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>원고에서 Extra Cellular Matrix (ECM)라고 불릴 것입니다.</td></tr><tr><td></td><td>BrainBits</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer 통계 소프트웨어</td><td>Nex Technologies</td><td>Neuroexplorer 버전 5</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15514-12</td><td></td></tr><tr><td>실가드 바닥 해부 접시</td><td>Living Systems Instrumentaion</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue dye</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

두번째-페 놀, 비스 페 놀 A (BPA)와 두번째-페 놀-S (BPS), 플라스틱 및 수많은 일상적인 제품의 생산에서 널리 이용 되는 대리인 polymerizing 있습니다. 그들은 내 분 비 혼란 시키는 화합물 (EDC) estradiol 같은 속성으로 분류 됩니다. 장기 노출 EDCs, 낮은 복용량 에서도 다양 한 건강 결함 등 암, 행동 장애, 불 임, 초기 발달 기간 동안 큰 취약점으로 연결 되었습니다. 신경 기능의 개발에 대 한 BPA의 효과 연구, 우리는 체 외에서 신경 네트워크 모델 초기 배아 여자 뇌에서 파생 된 사용. 우리는에 노출 발견 BPA 특히 급상승 활동 및 동기화 네트워크 활동의 개발에 영향을. 네트워크 활동에 변화는 분자 화합물 또는 약의 대상과 행동 결과에 미치는 영향 사이의 중요 한 링크입니다. 다중 전극 배열 점점 네트워크 활동 체 외에 약물의 효과 연구에 유용한 도구가 되고있다. 여러 시스템 사용할 수 시장에서 있으며, 전극, 유형 및 전극 배열 및 기본 기본 원리, 분석 소프트웨어의 품질의 수에 있는 변이 그리고 데이터 취득은 걸쳐 동일 합니다 다른 시스템입니다. 현재 2 차원 생체 외에서 문화 분석에 국한, 하지만 이러한 MEA 시스템 네트워크 활동 두뇌 조각에서 vivo에서 사용할 수 있도록 향상 되 고 된다. 여기, 우리는 배아 노출 및 신경 네트워크 활동 및 대표 결과 함께 synchrony에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

우리 병아리 태아 신경 문화에서 synchrony 개발에 BPA의 효과 검사합니다. 급상승 활동의 동기화는 신경 네트워크 체 외의 정상적인 발전의 지표 이다. 서로 5 ms 이내 두 스파이크 발생 동기 간주 됩니다. 처음 무작위 급격히 활동을 표시 하는 체 외에서 신경 문화-스파이크 무작위로 발생 하 고 간 스파이크 간격 표시 정규 분포. 문화는 성숙, 급격히 활동 더 동기화 된다 고 간 스파이크 간격 일정. 문화의 동기 급격히 활동 Synchrony 인덱스 (SI) 파생 소프트웨어12 기록 사용 하 여 시간 스파이크의 교차 상관 분석으로 quantitated 했다. 우리는 BPA 노출 부정적인 영향을 미치는 네트워크 활동 개발 급격히 활동과 synchrony 인덱스 (그림 2는 및 2b)를 줄임으로써 발견. 요약 하자면, 우리는 배아에 BPA 노출의 해로운 효과 미치는 영향 문화에 병아리 뉴런에서 synchrony 개발을 통해 평가 될 수 있다 신경 기능을 포함 하 여 그것의 발전 나타났습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg"> 그림 1: 여자 개 절 개에서 분리, 도금, 및 네트워크 활동의 기록 단계를 묘사 하는 프로토콜의 도식. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg"> 그림 2: (A) 스파이크의 평균 수는 상당히 낮은 BPA 취급 E7 여자 개 문화 제어 문화에 비교 될 때. 스파이크의 평균 수는 레코딩 소프트웨어를 사용 하 여 추출 되었다. 수단 (제어, 14,890 ± 949.0, N = 15, BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) 크게 달랐다 (짝이 없는 t-검정, p &lt; 0.0001). (B) 평균 synchrony 인덱스 (SI)는 크게 낮은 BPA 취급 E7 여자 개 문화 제어 문화에 비교 될 때. SI는 레코딩 소프트웨어 내에서 신경 통계 컴파일러 모듈을 사용 하 여 추출 했다. 시 수단 (제어, 0.5159 ± 0.06547 N = 15, BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) 크게 달랐다 (짝이 없는 t-검정, p &lt; 0.0001). 오차 막대는 표준 편차를 묘사. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

환경 독 소에 노출 수 있습니다 심하게 발전 태아에 영향을. 내 분 비 혼란 시키는 화학 제품 bisphenols 부정적인 알려져 있습니다와 같은 신 경계에 영향을. 여기는 초기 배아에 독 소 노출의 기능에 미치는 영향을 연구 하는 생체 외에서 (병아리 태아) 척추 신경 네트워크 모델을 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다.

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 비스페놀과 같은 내분비 교란 화합물이 다중 전극 어레이에 구축된 척추 동물 신경 네트워크의 네트워크 스파이킹 활동에 미치는 영향을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 배아 뇌의 네트워크 활동 발달에 대한 환경 독소의 작용 메커니즘과 같은 발달 신경 생물학 및 환경 독성학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 평균 발사 속도, 총 스파이크 수, 스파이크 진폭 및 동기화와 같은 뉴런 네트워크 매개변수에 미치는 영향을 이제 연구할 수 있다는 것입니다.이전 연구에서는 EDC가 뉴런 네트워크의 직접적인 출력인 단어와 행동에 영향을 미친다는 것을 보여주었으며, 이제 우리의 프로토콜은 이러한 네트워크에 대한 EDC의 영향을 이해하는 것을 목표로 합니다. 뉴런 도금 당일, 섭씨 20도의 마이너스 냉동고에서 세포외 기질이 담긴 바이알을 꺼내 70% 에탄올을 분사하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 얼음 위에서 세포외 기질을 반드시 해동하십시오.ECM은 섭씨 0도 이상에서 중합되므로 실온에서 해동하지 마십시오. BSL2 후드에서 작업하여 100마이크로리터 분취액에 300마이크로리터의 저온 신경기저 배지를 첨가하여 세포외 기질을 25%로 희석합니다. 그런 다음 P200 피펫을 사용하여 전극을 건드리지 않도록 주의하면서 100마이크로리터의 25% 세포외 매트릭스 용액을 다중 전극 어레이의 중앙에 추가합니다.즉시 ECM을 제거하여 표면에 박막을 남깁니다. 다중 전극 어레이를 덮고 뉴런을 플레이트링할 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. E7 난자의 외피를 70% 에탄올로 살균하여 병아리 뉴런 분리를 시작합니다.이 시점부터는 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 모든 기기가 70% 에탄올로 멸균되고 용액이 멸균되었는지 확인하십시오. 박리 후드를 사용하는 것이 도움이 되지만 신속하게 수행된다면 해부에 절대적으로 필요한 것은 아닙니다.그런 다음 배아를 채취하여 목을 베인 후 눈 주위를 자르고 안구를 제거합니다. 그런 다음 Dumont 넘버 5 파인 펜셉과 스프링 가위를 사용하여 복부 쪽을 절개하고 피부의 바깥 층을 제거하여 전뇌와 시신경을 노출시킵니다. 껍질 멤브레인을 조심스럽게 벗겨내고 제거합니다.전뇌를 HBSS가 들어있는 다른 페트리 접시에 옮기고 스프링 가위로 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 전뇌 조각을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 전뇌 조각이 원심분리기 튜브 바닥으로 가라앉은 후 HBSS를 최대한 제거합니다.다음으로, 예열된 0.5%트립신 EDTA 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 조각을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 1ml의 neurobasal 배지를 넣고 조직 조각을 바닥으로 가라앉힙니다.배지를 제거하고 세척을 반복한 후 2ml의 neurobasal 배지를 넣고 더 이상 조직 조각이 보이지 않을 때까지 부드럽게 분쇄합니다. 재부유 세포를 neurobasal medium으로 1에서 10까지 희석합니다. trypan blue dye와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.계수 후, 해리된 세포를 ECM 코팅된 다중 전극 어레이에 제곱 밀리미터당 2, 200개의 세포 밀도로 플레이트합니다. 다음 날, 처리된 다중 전극 어레이에 neurobasal 배지의 10마이크로몰 BPA를 추가합니다. 획득 당일에는 배양 배지를 새로운 neurobasal 배지로 교체하고 기록하기 전에 최소 2시간 동안 어레이를 CO2 incubator에 다시 넣습니다.기록 소프트웨어를 시작하고 온도 아이콘을 클릭하여 다중 전극 어레이의 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 왼쪽 창 패널에서 streams를 선택하고 muse 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 획득 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 처리 및 스파이크 감지기 추가를 선택하고 팝업 창에서 확인을 클릭합니다.STD에 의한 스파이크 감지기 6이 파일 이름 아래에 나타납니다. 그런 다음 스파이크 감지기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 처리 및 버스트 감지기 추가를 선택한 다음 팝업 창에서 확인을 클릭합니다. 버스트 감지기 ISI가 뮤즈 아이콘 아래에 나타납니다.그런 다음 burst detector를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 add processing 및 neural statistics compiler를 선택합니다. 팝업 창에서 File Header(파일 헤더), Aggregated Well Statistics(집계된 웰 통계) 및 Syncchrony(동기화)가 선택되어 있는지 확인하고 OK(확인)를 클릭합니다. 통계 컴파일러가 아래에 나타납니다. 화면 하단의 시계 아이콘을 클릭하고 설정 섹션의 정보를 변경하여 5.1분마다 기록하고 5분 동안 기록하도록 합니다.이 작업은 즉시 시작되고 한 번 실행됩니다. 인큐베이터에서 다중 전극 어레이를 회수한 후 기록 장치에 놓고 제자리에 고정합니다. 예약 녹화 섹션에서 녹화 시작을 클릭하여 네트워크 활동 녹화를 시작합니다.일반적으로 5분의 녹음 시간이면 충분하지만 최대 10분의 더 긴 녹음을 얻을 수 있습니다. 기록 후 다중 전극 어레이를 인큐베이터로 되돌립니다. BPA를 처리한 E7 병아리 전뇌 배양에서는 대조군 배양과 비교할 때 평균 스파이크 수가 현저히 낮습니다.BPA를 처리한 E7 병아리 전뇌 배양액의 평균 동조 지수는 대조군 배양과 비교했을 때 현저히 낮습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 스파이크 활동을 기록하는 동안에도 항상 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 항간질제 및 항우울제와 같은 잠재적 약물이 네트워크 활동에 미치는 영향을 작용 기전을 이해하기 위한 단계로 평가할 수 있습니다. 많은 EDC는 발달 과정에서 뇌에 미묘한 영향을 미치며, 이는 행동의 변화로 나타납니다. 동작은 기본 네트워크 활동의 직접적인 출력입니다.우리의 프로토콜은 네트워크 활동에 대한 이러한 화합물의 영향을 해부하는 것을 목표로 합니다.

assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

이 비디오는 초기 단계의 병아리 배아의 전뇌에서 뉴런을 분리하고 미세 전극 어레이에서 배양하여 뉴런 네트워크를 형성하는 방법을 보여줍니다.

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

이 비디오는 쥐의 척수 절편에서 신경 네트워크 활동을 연구하기 위한 미세 전극 어레이 기반 분석을 보여줍니다. 먼저, 슬라이스의 표재성 등쪽 뿔(SDH)의 전기생리학적 활성을 기록합니다. 그런 다음, 탈분극을 연장하기 위해 칼륨 채널 억제제가 도입되어 뉴런 네트워크 전반에 걸쳐 동기 리듬 활성을 일으킵니다.

microelectrode array-based assessment of neuronal networks in mouse spinal cord slices(쥐 척수 절편에서 신경 네트워크에 대한 Microelectrode Array-based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices)

이 비디오는 다중 전극 어레이(MEA)를 사용하여 초기 배아 병아리 신경 세포 배양에 대한 독소의 영향을 연구하는 방법을 보여줍니다. MEA는 뉴런 네트워크에서 뉴런의 동기 활동을 모니터링함으로써 독소 노출에 대한 반응으로 뉴런 네트워크의 기능적 역학을 캡처합니다. 독소 노출 시 동기화율 감소와 발화율이 감소하는 것은 신경 네트워크 성숙과 기능에 해로운 영향을 미친다는 점을 강조합니다.

다전극 배열을 사용한 병아리 배아 신경망 발달에 대한 독소의 영향 평가

다른 전극 코팅은 전기 화학적, 화학적, 기계적 특성 변화를 신경 기록 성능에 영향을 미친다. 체외에서 전극의 비교 그러나 생체 반응의 비교는 일반적으로 전극 / 신경 세포의 거리에서 동물 사이의 변화에 의해 복잡하고, 비교적 간단하다. 이 문서에서는 신경 기록 전극을 비교하는 강력한 방법을 제공한다.

신경 기록 전극의 체계적인 전기 및 전기 생리 평가를위한 방법

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

학습하세요 다중 전극 어레이를 사용하여 병아리 배아 척추 신경 네트워크에서 비스페놀 A의 효과를 평가하는 방법을. 이 기술은 발달 신경생물학 및 환경 독성학 연구에 활용됩니다.

내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

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