내 분 비 방해 다중 전극 어레이 사용 하 여 척추 신경 네트워크 기능 개발에 화합물의 효과의 평가

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 비스페놀과 같은 내분비 교란 화합물이 다중 전극 어레이에 구축된 척추 동물 신경 네트워크의 네트워크 스파이킹 활동에 미치는 영향을 테스트하는 것입니다. 이 방법은 배아 뇌의 네트워크 활동 발달에 대한 환경 독소의 작용 메커니즘과 같은 발달 신경 생물학 및 환경 독성학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 평균 발사 속도, 총 스파이크 수, 스파이크 진폭 및 동기화와 같은 뉴런 네트워크 매개변수에 미치는 영향을 이제 연구할 수 있다는 것입니다.

이전 연구에서는 EDC가 뉴런 네트워크의 직접적인 출력인 단어와 행동에 영향을 미친다는 것을 보여주었으며, 이제 우리의 프로토콜은 이러한 네트워크에 대한 EDC의 영향을 이해하는 것을 목표로 합니다. 뉴런 도금 당일, 섭씨 20도의 마이너스 냉동고에서 세포외 기질이 담긴 바이알을 꺼내 70% 에탄올을 분사하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 얼음 위에서 세포외 기질을 반드시 해동하십시오.

ECM은 섭씨 0도 이상에서 중합되므로 실온에서 해동하지 마십시오. BSL2 후드에서 작업하여 100마이크로리터 분취액에 300마이크로리터의 저온 신경기저 배지를 첨가하여 세포외 기질을 25%로 희석합니다. 그런 다음 P200 피펫을 사용하여 전극을 건드리지 않도록 주의하면서 100마이크로리터의 25% 세포외 매트릭스 용액을 다중 전극 어레이의 중앙에 추가합니다.

즉시 ECM을 제거하여 표면에 박막을 남깁니다. 다중 전극 어레이를 덮고 뉴런을 플레이트링할 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. E7 난자의 외피를 70% 에탄올로 살균하여 병아리 뉴런 분리를 시작합니다.

이 시점부터는 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 모든 기기가 70% 에탄올로 멸균되고 용액이 멸균되었는지 확인하십시오. 박리 후드를 사용하는 것이 도움이 되지만 신속하게 수행된다면 해부에 절대적으로 필요한 것은 아닙니다.

그런 다음 배아를 채취하여 목을 베인 후 눈 주위를 자르고 안구를 제거합니다. 그런 다음 Dumont 넘버 5 파인 펜셉과 스프링 가위를 사용하여 복부 쪽을 절개하고 피부의 바깥 층을 제거하여 전뇌와 시신경을 노출시킵니다. 껍질 멤브레인을 조심스럽게 벗겨내고 제거합니다.

전뇌를 HBSS가 들어있는 다른 페트리 접시에 옮기고 스프링 가위로 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 전뇌 조각을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 전뇌 조각이 원심분리기 튜브 바닥으로 가라앉은 후 HBSS를 최대한 제거합니다.

다음으로, 예열된 0.5%트립신 EDTA 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 조각을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 1ml의 neurobasal 배지를 넣고 조직 조각을 바닥으로 가라앉힙니다.

배지를 제거하고 세척을 반복한 후 2ml의 neurobasal 배지를 넣고 더 이상 조직 조각이 보이지 않을 때까지 부드럽게 분쇄합니다. 재부유 세포를 neurobasal medium으로 1에서 10까지 희석합니다. trypan blue dye와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.

계수 후, 해리된 세포를 ECM 코팅된 다중 전극 어레이에 제곱 밀리미터당 2, 200개의 세포 밀도로 플레이트합니다. 다음 날, 처리된 다중 전극 어레이에 neurobasal 배지의 10마이크로몰 BPA를 추가합니다. 획득 당일에는 배양 배지를 새로운 neurobasal 배지로 교체하고 기록하기 전에 최소 2시간 동안 어레이를 CO2 incubator에 다시 넣습니다.

기록 소프트웨어를 시작하고 온도 아이콘을 클릭하여 다중 전극 어레이의 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 왼쪽 창 패널에서 streams를 선택하고 muse 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 획득 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 처리 및 스파이크 감지기 추가를 선택하고 팝업 창에서 확인을 클릭합니다.

STD에 의한 스파이크 감지기 6이 파일 이름 아래에 나타납니다. 그런 다음 스파이크 감지기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 처리 및 버스트 감지기 추가를 선택한 다음 팝업 창에서 확인을 클릭합니다. 버스트 감지기 ISI가 뮤즈 아이콘 아래에 나타납니다.

그런 다음 burst detector를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 add processing 및 neural statistics compiler를 선택합니다. 팝업 창에서 File Header(파일 헤더), Aggregated Well Statistics(집계된 웰 통계) 및 Syncchrony(동기화)가 선택되어 있는지 확인하고 OK(확인)를 클릭합니다. 통계 컴파일러가 아래에 나타납니다. 화면 하단의 시계 아이콘을 클릭하고 설정 섹션의 정보를 변경하여 5.1분마다 기록하고 5분 동안 기록하도록 합니다.

이 작업은 즉시 시작되고 한 번 실행됩니다. 인큐베이터에서 다중 전극 어레이를 회수한 후 기록 장치에 놓고 제자리에 고정합니다. 예약 녹화 섹션에서 녹화 시작을 클릭하여 네트워크 활동 녹화를 시작합니다.

일반적으로 5분의 녹음 시간이면 충분하지만 최대 10분의 더 긴 녹음을 얻을 수 있습니다. 기록 후 다중 전극 어레이를 인큐베이터로 되돌립니다. BPA를 처리한 E7 병아리 전뇌 배양에서는 대조군 배양과 비교할 때 평균 스파이크 수가 현저히 낮습니다.

BPA를 처리한 E7 병아리 전뇌 배양액의 평균 동조 지수는 대조군 배양과 비교했을 때 현저히 낮습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 스파이크 활동을 기록하는 동안에도 항상 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 항간질제 및 항우울제와 같은 잠재적 약물이 네트워크 활동에 미치는 영향을 작용 기전을 이해하기 위한 단계로 평가할 수 있습니다. 많은 EDC는 발달 과정에서 뇌에 미묘한 영향을 미치며, 이는 행동의 변화로 나타납니다. 동작은 기본 네트워크 활동의 직접적인 출력입니다.

우리의 프로토콜은 네트워크 활동에 대한 이러한 화합물의 영향을 해부하는 것을 목표로 합니다.