Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

초기 배아가 들어 있는 수정 닭고기 달걀을 가져 가십시오.

껍질을 소독하고 조심스럽게 엽니다.

배아를 제거합니다. 헤드를 해부하고 완충액이 들어 있는 배양 플레이트로 옮깁니다. 안구를 제거합니다.

개를 하고 피부층을 제거하여 전뇌와 중뇌를 노출시킵니다.

내부 막층과 혈관을 제거합니다. 전뇌를 해부하고 완충액이 있는 배양판으로 옮깁니다.

조직을 더 작은 조각으로 자르고 원추형 튜브로 옮깁니다. 조각이 가라앉으면 버퍼를 제거합니다.

단백질 분해 효소 용액을 추가합니다. 배양하여 조직의 세포외 기질을 소화하고 뉴런을 느슨하게 합니다.

효소가 풍부한 배지를 제거하고 신경기저 배지로 세척하여 남아 있는 효소를 제거합니다.

신경기저 배지를 추가합니다. 조직을 기계적으로 해리시켜 신경 현탁액을 얻습니다.

세포외 매트릭스로 코팅된 다중 전극 어레이 시스템에 이러한 뉴런을 시드합니다. 신경기저 배지를 추가하고 배양합니다.

뉴런은 돌출부를 부착하고 확장하여 뉴런 네트워크를 형성합니다.

뉴런 도금 당일, 섭씨 -20도의 냉동실에서 세포외 기질 한 병을 꺼냅니다. 70% 에탄올을 뿌리고 얼음 위에 놓습니다. 얼음 위에서 세포외 기질을 해동하십시오. ECM은 섭씨 0도 이상에서 중합되므로 실온에서 해동하지 마십시오.

BSL-2 후드에서 작업하여 100마이크로리터 분취량에 300마이크로리터의 차가운 신경기저 배지를 추가하여 세포외 기질을 25%로 희석합니다. 그런 다음 P200 피펫을 사용하여 전극에 닿지 않도록 주의하면서 100마이크로리터의 25% 세포외 기질 용액을 다중 전극 어레이 중앙에 추가합니다. 즉시 ECM을 제거하고 표면에 얇은 필름을 남깁니다.

다중 전극 어레이를 덮고 뉴런을 도금할 준비가 될 때까지 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. E7 계란의 외부 껍질을 70% 에탄올로 멸균하여 병아리 뉴런 분리를 시작합니다. 이 시점부터는 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 모든 기구가 70% 에탄올로 멸균되고 용액이 멸균되었는지 확인하십시오. 해부 후드를 사용하는 것이 도움이 되지만 신속하게 수행되는 경우 해부에 절대적으로 필요한 것은 아닙니다.

그런 다음 배아를 채취하여 목을 베은 후 눈 주위를 자르고 안구를 제거합니다. 그런 다음 Dumont 5번 가는 집게와 스프링 가위를 사용하여 복부 쪽을 절개하고 피부의 바깥층을 제거하여 전뇌와 시신경 덮개를 노출시킵니다. 껍질 막을 조심스럽게 껍질을 벗기고 제거합니다.

전뇌를 HBS가 들어 있는 다른 페트리 접시에 옮기고 스프링 가위로 약 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 멸균 이송 피펫을 사용하여 전뇌 조각을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 전뇌 조각이 원심분리기 튜브 바닥으로 가라앉은 후 가능한 한 많은 HBS를 제거합니다.

다음으로, 예열된 0.5% 트립신-EDTA 1밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 조각을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 신경기저 배지 1밀리리터를 넣고 조직 조각을 바닥으로 가라앉히십시오. 배지를 제거하고 세척을 반복한 후 신경기저 배지 2밀리리터를 넣고 더 이상 조직 조각이 보이지 않을 때까지 부드럽게 분쇄합니다.

재현탁된 세포를 신경기저 배지로 1 내지 10으로 희석하고 트리판 블루 염료와 혈구계를 사용하여 생존 세포를 계수합니다. 계수 후, 평방 밀리미터당 2,200개의 세포의 밀도로 ECM으로 코팅된 다중 전극 어레이에 관련 세포를 도금합니다.