DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

이 기술의 전반적인 목표는 핵 내 면역염색으로 시각화된 DNA 변형의 공간 분포 및 신호 강도를 평가하기 위한 계산 도구를 제공하는 것입니다. 이 방법은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 서로 다른 모델 시스템에서 핵 국소화 및 DNA 변형의 상대적 수준을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 봇 신호 크기와 분포로 DNA 변형을 측정한다는 것입니다.

이 기술의 함의의 한개는 각종 생물학 체계에 있는 DNA 변형의 잠재적인 기능적인 줄에 우리의 이해를 촉진한다는 것입니다. 이 기술은 또한 면역조직화학으로 검출할 수 있는 다른 항원결정기의 컴퓨터 분석을 추가로 응용할 수 있습니다. 시작하려면 컨포칼 현미경 이미지의 LSM 형식 파일을 엽니다.

이미지 처리를 선택한 다음 분석할 이미지를 선택합니다. 샘플 간의 강도 프로파일을 비교할 때 직접 비교를 위해 레이저 출력과 게인이 일치해야 합니다. 그런 다음 모두 표시를 클릭하여 모든 그래픽 컨트롤을 표시한 다음 그래픽 탭을 선택하고 사각형 도구를 선택하여 관심 핵이 포함된 영역을 선택합니다.

그런 다음 영역 잘라내기 명령을 사용하여 관심 영역을 분리합니다. 이제 새 이름과 LSM 또는 CZI 형식으로 이미지를 저장하고 Zen Blue 소프트웨어에서 파일을 다시 엽니다. Zen Blue에서 ZEN 데스크를 연 다음 Zen Black에서 ZEN으로 보내기 명령을 사용하여 Zen Blue에서 파일을 엽니다.

그런 다음 2.5d라고 표시된 탭을 활성화하여 2.5d에서 이미지를 시각화할 수 있습니다. 모두 표시를 클릭하여 모든 그래픽 컨트롤을 표시하고 네 개의 회색 막대를 사용하여 설정을 변경합니다. 막대는 확대/축소, 회전, 축 기울기 및 축척 막대의 확장 및 수축을 제어합니다.

개별 피크를 가장 잘 시각화할 수 있는 렌더링 모드를 선택한 다음 백분율을 변경하여 먼 거리를 변경합니다. 백분율이 낮을수록 각 개별 피크가 더 잘 정의됩니다. 이제 2.5d 이미지를 저장하기 전에 2.5d 플롯 아래의 회색 화살표를 클릭하여 파일 목록과 그래픽 도구를 숨 깁니다.

그런 다음 키보드의 print screen 키를 사용하여 플롯을 스크린샷으로 저장합니다. 소프트웨어에서 이미지 처리 옵션을 열고 관심 있는 파일을 엽니다. 그런 다음 프로필 탭을 선택하고 모두 표시 탭을 선택하여 모든 서식 옵션에 액세스합니다.

프로필 탭에서 테이블 옵션과 화살표 버튼을 선택합니다. 이제 마우스를 사용하여 시작점을 선택하고 연속적인 수의 셀 위에 선을 그리면 이 선을 따라 있는 셀에 대한 강도 플롯이 강도 측정 테이블과 함께 생성됩니다. 이 표는 또한 빨강, 녹색 및 파랑 형광에 대해 픽셀 강도가 빨간색인 거리를 제공합니다.

단위는 미크론입니다. 이 데이터를 내보내려면 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 테이블 저장을 선택한 다음 텍스트 파일로 저장합니다. 강도 프로필을 저장하려면 내보내기 옵션을 선택하고 팝업 창에서 태그가 지정된 이미지 파일, 이미지 창의 형식 및 내용, 단일 창, 데이터의 두 가지 옵션을 토글합니다.

그런 다음 지시에 따라 파일을 저장합니다. 이제 필요한 각 강도 프로파일에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 소프트웨어에서 이미지 처리를 선택하고 관심 있는 이미지 파일을 선택합니다.

그런 다음 공동 국소화 분석을 위해 coloc이라고 표시된 탭을 선택하고 모두 표시를 선택하여 모든 서식 옵션에 액세스합니다. 화면 아래쪽에 있는 4개의 탭에서 공동 현지화를 선택하고 테이블 및 이미지 옵션을 선택합니다. 그런 다음 탭 상단에 있는 세 번째 아이콘을 선택하고 팝업 텍스트로 식별되는 닫힌 besier를 선택합니다.

이 도구를 사용하여 단일 핵을 둘러쌉니다. 그러면 값이 표에 나타나고 빨간색 형광 대 녹색 형광에 대한 산점도가 생성됩니다. 이 플롯의 축은 움직일 수 있으며 이는 감지의 게이팅을 제어합니다.

핵 내의 모든 픽셀 강도는 양의 신호로 간주되어야 합니다. DNA 변형의 수준은 핵에 따라 다르기 때문에 약한 신호를 고려하기 위해 데이터를 게이트하지 않습니다. 여기서 강조해야 할 점은 배경 값이 분석에 포함되어야 하는지 여부에 대해 논쟁의 여지가 있다는 것입니다.

중요한 것은 중첩 계수가 두 채널 간의 신호 강도 차이와 무관하다는 것입니다. 사람 상관 계수는 신호 간의 선형 관계를 가정합니다. 이제 데이터 세트를 완성하기 위해 핵을 둘러싸는 이 과정을 반복합니다.

그런 다음 데이터를 내보내려면 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 옵션에 따라 데이터를 저장합니다. 공동 지역화 이미지를 저장하려면 태그가 지정된 이미지 파일, 이미지 창의 형식 및 내용, 단일 창, 데이터, 두 가지 옵션과 함께 내보내기 명령을 사용한 다음 옵션에 따라 파일을 저장합니다. 5개의 메틸 시토신(methyl cytosine)의 산화된 유도체 2개의 공간 분포는 기술된 프로토콜을 사용하여 haphadic 전구 세포를 구별하는 데 있어 조사되었습니다.

빨간색과 녹색 신호는 두 가지 뚜렷한 DNA 변형을 나타냅니다. 신호는 제한된 중복으로 잘 정의되어 있습니다. 예상과 일치하게, 두 신호 강도와 해당 셀의 프로파일은 서로 강하게 일치하지 않습니다.

뚜렷한 패턴은 5개의 메틸 시토신의 탭 의존적 산화가 특정 염색질 영역에서 다른 산화 유도체를 생성할 수 있음을 시사합니다. 두 DNA 변형에 대한 유사한 비교가 Daoy 수모세포종 세포와 BXD 뇌실막종 세포에서 이루어졌습니다. 두 세포 계통 모두 소아 뇌종양에서 유래했습니다.

정량화는 BXD 세포가 Daoy 세포에 비해 두 신호 모두 현저히 낮은 수준을 나타내는 것으로 나타났습니다. 다음으로 5MC의 산화된 유도체의 공동 국소화를 미분화 hiPSC에서 검사했습니다. 간 내배엽 분화 및 hiPSC 유도 후 24시간 이내.

이 분석에서 신호 공동 국소화는 분화 유도에 따라 크게 변화했는데, 이는 미분화 세포에서 5개의 CAC 크기가 감소한 것에 기인할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 2.5d 명암 플롯 및 프로파일을 생성하는 방법과 공동 국소화 데이터를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에 설명된 이미지 분석 및 시각화 도구는 후성유전학 연구에 기여하며, 서로 다른 실험 그룹에서 서로 다른 DNA 변형의 신호를 비교적 빠르게 비교할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 과다 노출을 피하고 현미경 검사 중에 다른 실험 그룹에 대해 동일한 설정을 사용하는 것이 중요합니다. 마운트의 기포와 불충분한 침수로 인해 국부적으로 형광 손실이 발생할 수 있으므로 스캐닝 영역을 육안으로 검사하는 것이 중요합니다.

이 절차는 핵을 분할하고 Zen Blue를 사용하여 관심 영역을 생성함으로써 더욱 자동화할 수 있습니다. 이 영역을 Zen Black으로 가져와 여러 핵에 대한 공동 국소화 분석을 수행할 수 있습니다.