ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

gamma-H2AX 및 53BP1 면역형광 현미경의 전반적인 목표는 다양한 조직에서 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 분석하는 것입니다. 이 방법은 종양 세포에서 유전적 불안정성이 어떻게 발생하는지와 같은 암 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 DNA 이중 문자열 절단을 시각화할 수 있고 복구 프로세스를 분석할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Susanne Brendel입니다. 0.9% 염화나트륨에 밀리리터당 헤파린의 200 국제 단위가 함유된 항응고제 원액으로 시작하여 용액을 준비하는 것으로 실험을 시작합니다. 혈액 또는 골수 샘플을 채취하기 전에 각 수집 튜브에 2ml의 항응고제 원액을 채웁니다.

다음으로, 82.91g의 염화암모늄, 7.91g의 중탄산암모늄 및 2밀리리터의 0.5몰 에틸렌디아메네테트라세딕산 용액을 가진 적혈구용 10X 용해 용액을 총 1리터의 이중 증류수에 용해시켜 pH 8.0으로 준비합니다. 그런 다음 마이크로타이터 튜브에 360mg의 파라포름알데히드(PFA)에 1몰 수산화칼륨 용액 8.3마이크로리터를 첨가하여 고정 용액을 준비합니다. 튜브의 인산염 완충 식염수(PBS)를 튜브의 1밀리리터 표시까지 채우고 섭씨 95도의 가열 블록에서 튜브를 가열하여 1밀리리터의 36% PFA 용액을 얻습니다.

1mL의 36% PFA 용액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그리고 8ml의 PBS를 첨가하여 9ml의 4% PFA 원액을 얻을 수 있습니다. 4% PFA 원액을 분취하고 세포 고정에 사용할 때까지 섭씨 음의 18도에서 보관합니다.

다음으로, 50 μl의 Octoxynol 9에서 50 ml의 PBS를 첨가하여 투과 용액을 준비하여 약 0.1 %의 Octoxynol 9 용액을 얻는다. 마지막으로, 단백질 차단제와 PBS를 혼합하여 5% 및 2% 차단 용액을 준비합니다. 혈액 또는 골수 샘플을 준비하려면 2ml의 항응고제 원액으로 채워진 튜브를 회수합니다.

정맥 천자 또는 골수 천자에 의해 멸균 상태에서 튜브당 7ml의 혈액 또는 골수를 각각 추출합니다. 샘플을 실온에서 밤새 보관하십시오. 하룻밤 보관 후 헤파린화된 혈액 검체를 PBS로 1:1로 희석하고 헤파린화된 골수 검체를 PBS로 1:3의 비율로 희석합니다.

세포를 피펫 안팎으로 두 번 당겨 부드럽게 매달아 놓습니다. 다음으로, 한 부피의 밀도 구배 매체를 새 튜브에 추가합니다. 밀도 구배 배지 위에 희석된 혈액 또는 골수를 부드럽게 겹쳐 놓고 두 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.

튜브를 실온에서 30분 동안 원심분리하고 400G.피펫으로 상부 플라즈마 층을 뽑습니다. 그런 다음 밀도 구배 매질 위의 층에서 단핵 세포를 조심스럽게 수확합니다. 단핵 세포를 새 튜브로 옮기고 최소 3부피의 PBS를 추가합니다.

세포를 피펫 안팎으로 두 번 당겨 부드럽게 매달아 놓습니다. 튜브를 원심분리기합니다. 탈수 후 상층액을 제거합니다.

적혈구에 대해 섭씨 4도 1x 용해 용액 10ml를 추가합니다. 세포를 피펫 안팎으로 두 번 끌어당겨 부드럽게 다시 현탁시키고 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 PBS 30ml를 넣고 튜브를 원심분리합니다.

CD34 양성 세포의 분리를 위해 CD34 마이크로 비드 및 세포 분리 컬럼을 사용합니다. 환자 샘플의 단핵 세포를 가진 2개의 사이토 스핀을 각 제제에 대해 5개의 세포를 1배로 10배씩 원심분리하여 준비합니다. 200마이크로리터의 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정합니다.

고정 후 셰이커에서 각각 5분 동안 30ml의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 0.1 % Octoxynol 9로 10 분 동안 세포를 투과시킵니다. 실험실 셰이커에서 30ml의 5% 차단 용액으로 세포를 각각 5분씩 3회 부드럽게 세척합니다.

30ml의 신선한 5% 차단 용액으로 세포를 1시간 동안 차단합니다. 0.1% Octoxynol 9에 4% 파라포름알데히드로 세포의 고정 및 투과화는 gamma-H2AX 및 53BP1 병소를 뚜렷하게 보존합니다. 한 가지 세포 제제는 마우스 단클론 항 감마 H2AX 항체로, 다른 한 가지 세포 제제는 마우스 단클론 항 감마 H2AX 항체 및 다클론 토끼 항-53BP1 항체로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

입증된 항감마-H2AX 및 항-53BP1 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 배양 후, 실험실 셰이커에서 매 5분마다 30ml의 2% 차단 용액으로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 다음으로, 2% 차단 용액에서 500분의 1로 희석된 Alexa 488 공액 염소 항마우스 2차 항체로 세포의 첫 번째 제제를 배양합니다.

Alexa 488 접합 염소 항-마우스 2차 항체와 Alexa 555 복합 당나귀 항-토끼 2차 항체로 2차 정제된 세포를 500분의 1 희석하여 2% 차단 용액으로 배양합니다. 실험실용 셰이커에서 30ml의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. PBS를 제거하고 장착 매체로 셀을 장착합니다.

기포가 끼지 않도록 장착 매체 위에 커버 슬립을 조심스럽게 끼웁니다. 형광 현미경으로 세포를 분석하기 전에 장착 매체가 굳을 때까지 최소 3시간을 기다립니다. 마지막으로, 100배 대물렌즈에서 이미징하는 동안 DAPI, Alexa 488 및 Cy3용 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 세포핵의 gamma-H2AX 및 53BP1 병소를 분석합니다.

세포 내 gamma-H2AX foci 분석은 섬유아세포의 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 gamma-H2AX foci가 뚜렷한 형광 점으로 나타날 때 G0, G1 단계 및 G2 단계에서 가장 정확합니다. 이와는 대조적으로, S기 동안 세포의 gamma-H2AX foci 분석은 복제 과정에 의해 야기된 분산된 범핵 gamma-H2AX 반점으로 인해 복잡합니다. 조사된 조직에서 DNA 이중 가닥 절단의 정량화를 위해 gamma-H2AX의 면역형광 염색을 사용했으며, 조사된 림프구의 gamma-H2AX 병소 수치가 방사선 조사량에 비례한다는 것을 밝혔습니다.

급성 골수성 백혈병 환자의 CD34 양성 세포에서 gamma-H2AX와 53BP1 병소의 동시 국소화는 DNA 이중 가닥 절단 부위에서 53BP1 매개 비상동 말단 결합 복구 메커니즘의 촉진을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 DNA 이중 가닥 절단을 분석하기 위해 gamma-H2AX 및 53BP1 면역형광 현미경 검사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 DNA 손상 반응의 변화를 분석하기 위해 종양 세포에서 인 관련 ATM, ATR, 체크포인트 키나아제 1, 체크포인트 키나아제 2 및 TP53의 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.