Name: ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 γH2AX와 53BP1 면역형광 현미경법으로 DNA 이중가닥 파손의 형성과 수리 과정을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 세포의 유전적 불안정성 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

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프로젝트는 독일 호세 카레라스 백혈병 재단 (DJCLS 14 R/2017)에 의해 지원 되었다.

여기에서 설명한 모든 방법을 의료 학부 임 하이델베르크 대학 윤리 위원회 II에 의해 승인 되었습니다. 모든 개인에서 동의 얻어 작성.
 1. 재료의 준비 <ol><li>응고 제 재고 솔루션: 0.9% 염화 나트륨에에서 mL 당 200 I.U. 덤플링의 항 응 혈 약 재고 솔루션을 준비. 컬렉션 튜브의 각 채우기 (볼륨 그릴 9 mL) 혈액 또는 골 수 샘플의 철수 하기 전에 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와.</li>
	<li>적혈구 세포 솔루션: 레드 셀 염화 암모늄 82.91 g, 7.91 g 염화 중 탄산염, 그리고 pH 8.0에서 에이전트를 용 해 하 여 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 성 해결책의 2 mL에 lysis 솔루션 x 10 준비 1의 전체 볼륨에 대 한 이중 증 류 물 L.</li>
	<li>고정 솔루션: 추가 8.3 µ L 360 mg paraformaldehyde (PFA) 결정 튜브에서에 1 M 수산화 칼륨 해결책의. 튜브 및 열 36 %PFA 솔루션의 1 mL를 95 ° C에가 열 블록에 튜브의 1 mL 마크를 버퍼링 하는 인산 염 분 (PBS)로 튜브를 채우십시오. 15 mL의 용량을 가진 튜브를 1 mL 36 %PFA 솔루션을 전송 합니다. 8 mL PBS 1 mL 36 %PFA 솔루션 4 %PFA 재고 솔루션의 9 mL를 추가 합니다. 셀의 고정을 위한 4 %PFA 재고 솔루션 및 저장소까지-18 ° C에서 사용 하는 약 수. 
	주의: 1) 수산화 칼륨 해결책은 부식성 이다. 눈과 피부 보호를 알고 있어야 합니다. 2) PFA 발암 성 이다입니다. 피부 접촉 및 흡입 하지 마십시오. 준비는 후드 아래 고정 솔루션.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션: 추가 50 µ L Octoxinol 9 ~ 50 mL PBS 약 0.1%의 솔루션을 Octoxinol 9.</li>
	<li>차단 솔루션: 5%와 2 %6에서 PBS와 저장소 단백질 블로킹 제를 혼합 하 여 차단 하는 솔루션 준비 &#8211; 8 ° c.</li>
</ol> 2. 샘플의 준비 <ol><li>섬유 아 세포 세포 배양에서: 셀 라인 NHDF 습도 5%에서의 인간의 섬유 아 세포를 배양 10% 태아 종 아리 혈 청, 4mm 보충 RPMI 1640 매체에서 37 ° C에서 CO 2 분위기 글루타민, 그리고 1% 페니실린/스입니다.
	<ol><li>준비는 현미경 슬라이드의 점착 섬유 아 세포 <ol><li>플라스 크 (75 cm 2 성장 지역) 기 하 급수적으로 성장 하는 NHDF 섬유 아 세포에서에서 매체를 제거 합니다. 플라스 크에 10 mL PBS를 추가 합니다. 수동으로 1 분에 대 한 플라스 크를 흔들어 부착 섬유 아 세포를 부드럽게 씻어</li>
			<li>는 PBS를 제거 하 고 플라스 크에 트립 신 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 부착 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 있도록 플라스 크를 흔들어. 플라스 크에서는 트립 신을 제거 합니다. 37 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 넣어 ° c.</li>
			<li>는 인큐베이터에서 플라스 크 고 플라스 크에 10 mL RPMI 1640 매체를 추가. 매체는 섬유 아 세포를 분산 여러 번 위아래 플라스틱.</li>
			<li>각 현미경 슬라이드의 두 필드에 분산 된 섬유 아 세포의 0.3 mL를 플라스틱 하 고 슬라이드 하는 섬유 아 세포 준수 24 h에 대 한 인큐베이터에 슬라이드를 넣어. ΓH2AX 및 섬유 아 세포의 핵에서 53BP1의 immunostaining에 대 한 이동 단계 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>환자 샘플 <ol><li>혈액 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 혈액을 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 분리 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 단 세포 휴식 G0/G1 단계.</li>
		<li>골 수 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션 (단계 1.1)의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 골 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 단 세포 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 휴식 G0/G1 단계 분리. CD34 microbeads를 사용 하 고 셀 CD34 + 세포의 고립에 대 한 분리 열.</li>
		<li>조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 단 세포의 고립 
		참고: 단 세포 밀도 그라데이션 원심 17 , , 18 19에 의해 혈액과 골 수 샘플에서 격리 됩니다.
		<li>Dilute PBS와 1: 1의 비율로 heparinized 혈액 샘플 및 PBS와 1: 3의 비율로 heparinized 골 수 샘플 <ol>. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 중단.</li>
			<li>신선한 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 희석된 혈액 또는 골 수 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어. 두 레이어 혼합에 아닙니다 돌.</li>
			<li>원심 관 실 온에서 30 분 동안 하 고 400 x g. 피펫으로와 위 플라즈마 레이어를 그립니다. 다음 신중 하 게 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어 단 셀 수확. 단 세포 신선한 튜브로 전송.</li>
			<li>튜브에 단 세포를 PBS의 적어도 3 개의 볼륨을 추가합니다. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 부드럽게 세포를 일시 중단 합니다. 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심</li>
			<li>스핀 후는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C, 적혈구 세포 솔루션 x 1의 10 mL을 추가. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 resuspend 고 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다음 4 ° C에서 30 mL PBS를 추가 하 고 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심</li>
		</ol></li> <li>준비는 cytospins의 <ol><li>(즉, γH2AX 면역 형광 염색 법에 대 한 하나의 cytospin 및 γH2AX 및 53BP1에 대 한 하나의 cytospin 환자 샘플의 단 세포와 두 cytospins 준비 면역 형광 염색 결합) 원심 분리 (300 x g, 10 분) ( 그림 3 및 4) 각 준비에 대 한 10 5 셀 x 1.0의 의해.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX 및 53BP1 면역 형광 염색 <ol><li>고정 및 permeabilization: 4%의 200 µ L 셀 해결 PFA 10 분. 고정, 후 30 mL PBS의 각 실험실 통에 5 분을 세 번 셀을 부드럽게 씻어. 다음 세포를 permeabilize 0.1%의 200 µ L을 10 분에 대 한 Octoxinol 9 씻어 셀 부드럽게 각 실험실 통에 5 분 30 mL 5% 차단 솔루션의와 세 번. 1 헤에 대 한 솔루션을 차단 하는 신선한 5%의 30 mL에서 세포를 차단</li>
	<li>항 체를 가진 외피 <ol><li>품 어 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 한 준비와 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 다른 준비를 하 고 4에서 하룻밤 polyclonal 토끼 안티-53BP1 항 체 (1: 500) ° c.</li>
		<li>인큐베이션 세척 세포 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 2% 차단 솔루션의 30 mL로 3 시간 후.</li>
		<li>차단 솔루션을 제거 하 고 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 2 차 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 첫 번째 준비와 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 이차 항 체 (셀의 두 번째 준비 품 어 1: 500)와 Alexa555 활용 된 당나귀 안티 토끼 2 차 항 체 (1: 500) 실 온에서 1 h.</li>
	</ol></li> <li>장착 매체: 셀으로 슬라이드를 그릇에 넣고 셀 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 30 mL의 PBS로 3 회 세척. PBS를 제거 하 고 장착 매체 4, 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 셀을 탑재. 조심 스럽게 넣어 장착 매체 위에 coverslip 없음 기포는 포함 된. 형광 현미경으로 세포를 분석 하기 전에 장착 매체의 강화에 대 한 적어도 3 h 기다립니다.</li>
</ol> 4. ΓH2AX 및 53BP1의 분석 Foci <ol><li>형광 현미경 검사 법: 100 X 목표에 이미징 동안 DAPI, 알 렉 사 488, Cy3 필터를 갖춘 형광 현미경으로 세포 핵에서 γH2AX 및 53BP1 foci 분석 확대입니다. 카메라와 함께 이미지를 기록 하 고 적절 한 이미징 소프트웨어로 이미지 처리.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
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<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
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<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
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<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
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<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법의 γH2AX와 53BP1 형성 및 연구 분야의 넓은 스펙트럼에서 DSB의 수리 분석을 위한 유용한 방법입니다. 실험의 결과 좌우 하는 중요 한 매개 변수는 세포 주기, 고정 및 permeabilization 세포, 항 체, 그리고 하드웨어의 선택과 형광 현미경의 소프트웨어 사용 하는 에이전트의 단계.
ΓH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 정상 섬유 아 세포 세포 라인 NHDF의 기 하 급수적으로 성장 하 여 시연 했다. ΓH2AX foci G0/G1에 고유한 형광 점으로 등장 및 S 단계 (그림 5)에서 분산 된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 비해 g 2 단계. G0/G1에 뚜렷한 γH2AX foci 단계 그리고 G2 단계 표시 과도 그리고/또한 제정 DNA 손상 반복적인 세포 주기 통로; 중 획득 수 있습니다. 반대로, S 단계에서 분산된 얼룩만 정도 발생 하 고 아마도 ...

DNA는 지속적으로 내 생에 의해 손상 (예를 들어, 복제 스트레스, 반응성 산소 종, DNA의 본질적인 불안정성) 및 외 인 (예, 화학 기, 방사선) 소스 (그림 1)1,2 ,,34. DNA 손상, 중 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 특히 심각한 병 변 그리고 세포 죽음 또는 발암을 일으킬 수 있습니다. 약 50 DSB는 세포와 세포 주기5당 발생할 수 있습니다. 포유류 세포, 동종 재결합 (HR) 및 nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 개발 DSB (그림 2)의 복구에 대 한 주요 경로. 인사 늦게 S/g 2 단계에서 발생 하 고 그대로 동생을 사용 하 여 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 템플릿으로 chromatid. 비교에서는, NHEJ 기본적인 쌍을 추가 또는 깨진된 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다 및 잠재적으로 돌연변이 세포 주기입니다. 또한, 대체 최종 합류 NHEJ 결핍6,7시 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘으로 약혼 수 있습니다.
DSB 각 DSB 주위 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에서 히스톤 H2AX의 인 산화를 유도. 형성 핵 foci γH2AX foci 이름이 되며 면역 형광 검사 현미경 검사 법8감지. ΓH2AX 추가 DSB 반응 단백질의 신규 모집을 촉진 하 고 개장 하는 chromatin, DNA 수리, 및 신호 변환9에 관여. 각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 정량화는 가능,이 암 세포 선 및 환자 표본10,11, 에서 입증 되었습니다. 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1) DSB 수리 중재에 또 다른 주요 단백질 이다. 그것은 DSB 반응 단백질, 검사점 신호, 그리고 DSB 끝15synapsis의 채용에 관여. 또한, 53BP1 DSB 복구 경로 선택에서 중요 한 역할을 하고있다. 그것은 시간 동안 방해16NHEJ 향해 DSB의 수리를 트리거합니다. ΓH2AX 및 DSB 수리에 53BP1의 진정한 기능을 고려 하면 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해의 동시 분석 형성 및 DSB의 복구의 정확한 분석을 위한 유용한 방법 있을 수 있습니다.
이 원고는 세포 핵에 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 수행 하기 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 특히, 기술은 셀 라인 NHDF, 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포와 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서의 정상적인 fibroblasts에 적용 됩니다. 방법의 세부 정보는 제시 결과의 맥락에서 지적 했다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>세포 배양을 위한 매체</td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparin 5,000 IU / mL</td></tr><tr><td>염화나트륨 용액 0.9 %</td> <td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>항응고제 원액</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td>의 구성 요소 <td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>단핵 세포 분리를위한 배지</td></tr><tr><td>트립신 용액 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>세포 배양에서 섬유 아세포의 해리를위한 효소</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ 골수성 전구 세포의 분리</td></tr><tr><td>진단 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; 탁상용 원심분리기&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytospin 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뚜껑</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>마이크로 튜브 없이 작업하기 위한 뚜껑</td></tr><tr><td>사이토 용기</td><td>헤레우스</td><td>75003416</td><td>2개의 원뿔형 구멍이 있는 사이토 용기</td></tr><tr><td>클립 캐리어</td><td>헤레우스</td><td>75003414</td><td>사이토 용기와 슬라이드를 고정하기 위한 캐리어</td></tr><tr><td>지지 인서트</td><td>헤레우스</td><td>75003417</td><td>지지 인서트 클립 캐리어 트리</td></tr><tr><td>톤 X-100 (옥톡시놀 9)</td><td>을 들고 Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>세포막의 투과화를 위한 세제</td></tr><tr><td>수산화칼륨 용액 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>파라포름알데히드 용액 준비에 필요</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>고정제</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td>균형 잡힌 염 용액</td></tr><tr><td>화학 차단제</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>차단제</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항-&감마; H2AX 항체 (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>1차 항체 &gamma; H2AX</td></tr><tr><td>Polyclonal rabbit anti-53BP1 항체 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse 항체</td> 검출을 위한 1차 항체 <td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>DNA 염색을위한 DAPI 포함</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>쿨 큐브 1 CCD 카메라</td><td>메타 시스템</td><td>H-0310-010-MS</td><td>디지털 기록을위한 카메라 시스템</td></tr><tr><td>Isis 소프트웨어</td><td>메타 시스템</td><td>해당</td><td>현미경 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

Γh2ax와 53bp1 형성 및 dna 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 심각한 DNA 병 변. 형성 및 DSB의 수리 분석은 게놈 무결성, genotoxicity, 방사선 생물학, 노화, 암, 및 신약 개발 등 연구 분야의 넓은 스펙트럼에 관련. 응답에서 DSB, 히스톤 H2AX 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 개별 핵 foci 감지를 형성 하는 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에 phosphorylated은. 또한, 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1)은 또 다른 중요 한 DSB 반응 단백질 nonhomologous 끝 동종 재결합 하면서 가입 하 여 DSB의 복구를 추진. ΓH2AX와 53BP1의 특정 기능에 따라 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 결합 된 분석 DSB의 상세한 분석에 대 한 합리적인 접근 있을 수 있습니다. 이 원고는 단계별 프로토콜을 기술을 수행 하기 위한 조직적 노트와 보충을 제공 한다. 특히, γH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 셀 라인 NHDF의 정상적인 fibroblasts에 시연입니다. 또한, biomarker는으로 γH2AX foci의 값은 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포에 그려져 있습니다. 마지막으로, 유전자 불안정성의 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 조사.

셀에 γH2AX foci의 분석 G0/G1 단계 그리고 G2 단계 γH2AX foci (그림 5A) 고유한 형광 점으로 표시 하는 때에 가장 정확 하다. 반면, S 단계 세포에 γH2AX foci의 분석 복제 프로세스 (그림 5B)에 의해 발생 하는 분산된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 의해 복잡 합니다.
셀의 고정 4% 수행한 PFA (10 분) 및 0.1% permeabilization Octoxinol 9 (10 분). 메탄올은 고정 및 permeabilization, 사용할 수 있습니다 그러나, 메탄올 수 있습니다 세포 핵을 꽤 심각 휴식과 γH2AX 포커스 4 %PFA 0.1% 처리 하 여 얻은 γH2AX foci에 비해 뚜렷한 나타나지 않을 수 있습니다...

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

gamma-H2AX 및 53BP1 면역형광 현미경의 전반적인 목표는 다양한 조직에서 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 분석하는 것입니다. 이 방법은 종양 세포에서 유전적 불안정성이 어떻게 발생하는지와 같은 암 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 DNA 이중 문자열 절단을 시각화할 수 있고 복구 프로세스를 분석할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Susanne Brendel입니다. 0.9% 염화나트륨에 밀리리터당 헤파린의 200 국제 단위가 함유된 항응고제 원액으로 시작하여 용액을 준비하는 것으로 실험을 시작합니다. 혈액 또는 골수 샘플을 채취하기 전에 각 수집 튜브에 2ml의 항응고제 원액을 채웁니다.다음으로, 82.91g의 염화암모늄, 7.91g의 중탄산암모늄 및 2밀리리터의 0.5몰 에틸렌디아메네테트라세딕산 용액을 가진 적혈구용 10X 용해 용액을 총 1리터의 이중 증류수에 용해시켜 pH 8.0으로 준비합니다. 그런 다음 마이크로타이터 튜브에 360mg의 파라포름알데히드(PFA)에 1몰 수산화칼륨 용액 8.3마이크로리터를 첨가하여 고정 용액을 준비합니다. 튜브의 인산염 완충 식염수(PBS)를 튜브의 1밀리리터 표시까지 채우고 섭씨 95도의 가열 블록에서 튜브를 가열하여 1밀리리터의 36% PFA 용액을 얻습니다.1mL의 36% PFA 용액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그리고 8ml의 PBS를 첨가하여 9ml의 4% PFA 원액을 얻을 수 있습니다. 4% PFA 원액을 분취하고 세포 고정에 사용할 때까지 섭씨 음의 18도에서 보관합니다.다음으로, 50 μl의 Octoxynol 9에서 50 ml의 PBS를 첨가하여 투과 용액을 준비하여 약 0.1 %의 Octoxynol 9 용액을 얻는다. 마지막으로, 단백질 차단제와 PBS를 혼합하여 5% 및 2% 차단 용액을 준비합니다. 혈액 또는 골수 샘플을 준비하려면 2ml의 항응고제 원액으로 채워진 튜브를 회수합니다.정맥 천자 또는 골수 천자에 의해 멸균 상태에서 튜브당 7ml의 혈액 또는 골수를 각각 추출합니다. 샘플을 실온에서 밤새 보관하십시오. 하룻밤 보관 후 헤파린화된 혈액 검체를 PBS로 1:1로 희석하고 헤파린화된 골수 검체를 PBS로 1:3의 비율로 희석합니다.세포를 피펫 안팎으로 두 번 당겨 부드럽게 매달아 놓습니다. 다음으로, 한 부피의 밀도 구배 매체를 새 튜브에 추가합니다. 밀도 구배 배지 위에 희석된 혈액 또는 골수를 부드럽게 겹쳐 놓고 두 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.튜브를 실온에서 30분 동안 원심분리하고 400G.피펫으로 상부 플라즈마 층을 뽑습니다. 그런 다음 밀도 구배 매질 위의 층에서 단핵 세포를 조심스럽게 수확합니다. 단핵 세포를 새 튜브로 옮기고 최소 3부피의 PBS를 추가합니다.세포를 피펫 안팎으로 두 번 당겨 부드럽게 매달아 놓습니다. 튜브를 원심분리기합니다. 탈수 후 상층액을 제거합니다.적혈구에 대해 섭씨 4도 1x 용해 용액 10ml를 추가합니다. 세포를 피펫 안팎으로 두 번 끌어당겨 부드럽게 다시 현탁시키고 튜브를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 PBS 30ml를 넣고 튜브를 원심분리합니다.CD34 양성 세포의 분리를 위해 CD34 마이크로 비드 및 세포 분리 컬럼을 사용합니다. 환자 샘플의 단핵 세포를 가진 2개의 사이토 스핀을 각 제제에 대해 5개의 세포를 1배로 10배씩 원심분리하여 준비합니다. 200마이크로리터의 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정합니다.고정 후 셰이커에서 각각 5분 동안 30ml의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 0.1 % Octoxynol 9로 10 분 동안 세포를 투과시킵니다. 실험실 셰이커에서 30ml의 5% 차단 용액으로 세포를 각각 5분씩 3회 부드럽게 세척합니다.30ml의 신선한 5% 차단 용액으로 세포를 1시간 동안 차단합니다. 0.1% Octoxynol 9에 4% 파라포름알데히드로 세포의 고정 및 투과화는 gamma-H2AX 및 53BP1 병소를 뚜렷하게 보존합니다. 한 가지 세포 제제는 마우스 단클론 항 감마 H2AX 항체로, 다른 한 가지 세포 제제는 마우스 단클론 항 감마 H2AX 항체 및 다클론 토끼 항-53BP1 항체로 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.입증된 항감마-H2AX 및 항-53BP1 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 배양 후, 실험실 셰이커에서 매 5분마다 30ml의 2% 차단 용액으로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 다음으로, 2% 차단 용액에서 500분의 1로 희석된 Alexa 488 공액 염소 항마우스 2차 항체로 세포의 첫 번째 제제를 배양합니다.Alexa 488 접합 염소 항-마우스 2차 항체와 Alexa 555 복합 당나귀 항-토끼 2차 항체로 2차 정제된 세포를 500분의 1 희석하여 2% 차단 용액으로 배양합니다. 실험실용 셰이커에서 30ml의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. PBS를 제거하고 장착 매체로 셀을 장착합니다.기포가 끼지 않도록 장착 매체 위에 커버 슬립을 조심스럽게 끼웁니다. 형광 현미경으로 세포를 분석하기 전에 장착 매체가 굳을 때까지 최소 3시간을 기다립니다. 마지막으로, 100배 대물렌즈에서 이미징하는 동안 DAPI, Alexa 488 및 Cy3용 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 세포핵의 gamma-H2AX 및 53BP1 병소를 분석합니다.세포 내 gamma-H2AX foci 분석은 섬유아세포의 대표적인 이미지에서 볼 수 있듯이 gamma-H2AX foci가 뚜렷한 형광 점으로 나타날 때 G0, G1 단계 및 G2 단계에서 가장 정확합니다. 이와는 대조적으로, S기 동안 세포의 gamma-H2AX foci 분석은 복제 과정에 의해 야기된 분산된 범핵 gamma-H2AX 반점으로 인해 복잡합니다. 조사된 조직에서 DNA 이중 가닥 절단의 정량화를 위해 gamma-H2AX의 면역형광 염색을 사용했으며, 조사된 림프구의 gamma-H2AX 병소 수치가 방사선 조사량에 비례한다는 것을 밝혔습니다.급성 골수성 백혈병 환자의 CD34 양성 세포에서 gamma-H2AX와 53BP1 병소의 동시 국소화는 DNA 이중 가닥 절단 부위에서 53BP1 매개 비상동 말단 결합 복구 메커니즘의 촉진을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 DNA 이중 가닥 절단을 분석하기 위해 gamma-H2AX 및 53BP1 면역형광 현미경 검사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 DNA 손상 반응의 변화를 분석하기 위해 종양 세포에서 인 관련 ATM, ATR, 체크포인트 키나아제 1, 체크포인트 키나아제 2 및 TP53의 면역 블로팅과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

이 비디오에서는 인간 단핵 세포의 DNA 이중 가닥 절단 부위에 국한된 특정 DNA 손상 반응 단백질을 검출하는 면역형광 현미경 검사 기술에 대해 설명합니다. 단백질은 특정 1차 항체에 의해 인식되며, 이 항체는 다시 현미경 시각화 중에 형광을 발하는 형광단 표지된 2차 항체에 결합하여 단백질을 세포핵 내에서 뚜렷한 형광 병소로 시각화할 수 있습니다.

DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.

인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

배우세요 γH2AX와 53BP1 면역형광 현미경법으로 DNA 이중가닥 파손의 형성과 수리 과정을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 종양 세포의 유전적 불안정성 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

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