Name: 이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 이온화 방사선에 의한 DNA 이중가닥 절단 표지자인 γH2AX의 핵 내 공간적 분포를 면역형광 및 공초점 현미경으로 분석하는 방법을. 이 기법은 방사선 생물학 연구에 필수적입니다.

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원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 (주)에 대한 CRC에 의해 투자 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 (CRC) 프로그램에 따라 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.

셀 준비 <ol><li> 인간 erythroleukemic K562 세포는 37 humidified 5 % CO 2 환경에서 10 % (V / V) 태아 소 혈청 20 MG / ML gentamicin과 보충 RPMI - 1640 배지 ° C.에 재배 </li><li> 이전 얼룩에 약 18시간 37 새로운 미디어 및 반환에 resuspend 호수 (PBS)를 버퍼 인산과 함께 기하 급수적으로 성장 세포 (5 × 10 5 세포 / ML에 최적) 씻어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 5 분 약 1,500 rpm으로 원심 분리하여 두 번 PBS로 세포를 씻어 신선한 미디어 resuspend. </li><li> 세포를 카운트하고 약 5 × 10 5 세포 / ML에 세포 밀도를 조정합니다. </li></ol> 전지는 자동화된 방법 (예 : Sysmex 또는 5-20 미크론 사이의 필터 크기 쿨터 카운터) 또는 trypan 파랑 제외 방법과 혈구계를 사용하여 어느 계산하실 수 있습니다. 세포의 수가 초과 (&gt; 800 세포 / cm 2) 비 균일한 얼룩이 발생할 수 있습니다. 조사 및 immunofluorescence 염색법 <ol><li> 적절한 라벨과 cytospin 클립, 필터 카드 및 슬라이드 조립. </li></ol> 조립하면 cytospin 장치 필터 카드에 구멍이 유입 경로와 일치하는지 확인. <ol start="2"><li> γ - 방사선 또는 X - 레이 (이 예제의 2Gy)로 세포를 노출. </li></ol> 조사 기간 동안 foci의 형성을 방지하기 위해, 이전과 조사 중에 5~10분 위해 얼음에 세포를 유지. 다음 조사는 37 세포를 품어 ° C, 5 %를 소요 시간 (최대 γH2AX 수준 30 분 1 시간,이 예제에서는 1 시간)에 대한 CO 2. <ol start="3"><li> 신선한 PBS에서 원심 분리하고 resuspend에 의해 감기에 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 5 분 500 RPM 각 cytospin 퍼널 및 스핀에 세포 현탁액의 100-150 μL를 분배. </li><li> cytospins에서 슬라이드를 분리하고 전지가 적당히 약 15 분 동안 건조 공기 수 있습니다. </li></ol> 세포 형태는 분해 수 있으므로 세포가 완전히 건조시키지 마십시오. <ol start="6"><li> 소수성 펜으로 세포 주위에 원을 그립니다. </li><li> 실온 (RT)에서 5 분 4 % paraformaldehyde로 세포를 수정. </li></ol> 우리의 경험에서, paraformaldehyde로 고정이 에탄올이나 메탄올로 고정하는 우수합니다. 긴 고정 시간 (15-20분)가 자기편 세포의 최적의 고정에 필요한 반면, 서스펜션 전지는 RT에서 5 분 동안 고정이 필요합니다. 우리는 얼룩 즉시 일반적으로 높은 배경 형광 결과 -20 ° C에서 고정 슬라이드를 저장하는보다 더 나은 결과를 산출 찾으십시오. <ol start="8"><li> 오분 각 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.1 % 5 분 RT에서 트리톤 - X 100 세포 Permeabilize. </li></ol> 트윈 - 80에 비해 우리는 일반적으로 트라이 튼 - X 100 permeabilized 세포에서 더 나은 신호를 관찰합니다. 세포 종류에 따라 그것은 permeabilisation 시간을 변경해야 할 수 있습니다. 자기편 세포에서 15 분 permeabilization이 필요한 반면, 예를 들어, K562 세포에서 RT에서 5 분 permeabilization은 충분합니다. <ol start="10"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> RT 30 분 (3 * 10 분)에 대한 1 % BSA의 세포를 차단합니다. </li></ol> 우리는 혈청 (보조 항체와 동일한 종류에서 파생)와 PBS의 소 혈청 알부민을 사용하여 차단 효율성을 비교. BSA는 혈청에 비해 이차 항체가 아닌 특정 바인딩을 최소화에보다 효율적되었습니다. 우리는 하루 4 차단, 다른 차단 시간을 비교 ° C 3에 비해 X 십분 3 실온에서 X 이십분 차단 단계, 3 X 10 분 동안 차단하는 것이 최적이라고 판단. <ol start="12"><li> 각 슬라이드 : 기본 항체의 50 μL (500 1% BSA에 희석 1) 추가합니다. </li></ol> 감소 배경 얼룩 60 분 결과에 대한 RT에서 일차 항체와 배양 4에서 하룻밤 배양에 비해 ° C. <ol start="13"><li> 다른 마커를 얼룩이 동시에 종 (이 예제의 경우 예를 들어 마우스 방지 γH2AX와 토끼 안티 methylated H3K4)에 제기 항체를 사용합니다. </li><li> 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT 90 분 기본 항체와 부화. </li></ol> 모든 incubations은 humidified 얼룩의 여물 수행됩니다. <ol start="15"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL 추가 (1 : 1000 1 % BSA로 희석) 이차 항체를 각각의 슬라이드. </li></ol> 같은 슬라이드에 다른 마커에 대한 얼룩하기​​ 위해서는 D와 보조 항체를 사용하여ifferent 종의 특이성 (기본 항체에 따라)과 형광 방출 파장 (예 : 안티 - 마우스 알렉사 488 (녹색)이 예제에서 안티 - 토끼 알렉사 - 546 (적색)). <ol start="17"><li> 250 RPM에서 락을 플랫폼에서 RT에서 60 분 세포를 품어. </li></ol> 이것은 페이딩 및 이차 항체의 건조 방지하기 어두운 습한 챔버에서 세포를 부화하는 것이 좋습니다. <ol start="18"><li> 오분 각 세포에게 PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 각 슬라이드 (PBS에 희석 1:500) TOPRO - 3의 50 μL를 추가합니다. </li><li> 배 5 분 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드에서 초과 수분을 제거하고 방지 페이드 솔루션을 추가합니다. </li></ol> 그것은 완전히 방지 페이드 솔루션을 추가하기 전에 세포를 건조하지 않는 것이 좋습니다. <ol start="22"><li> Coverslip, 손톱 바니와 인감 및 실온에서 어둠 속에서 야간 슬라이드를 두십시오. </li></ol> 그것은 공촛점 특정 coverslips # 1.5 (0.16-19 미크론 두꺼운)와 투명 매니큐어를 사용하는 것이 좋습니다. 슬라이드에 coverslip을 배치하는 동안주의가 공기 거품의 형성을 피하기 위해 이동해야합니다. 이미지 수집 <ol><li> 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 현미경은 표준 GFP (녹색, 488 NM), PI (적색 543 NM)와 (블루 633 NM)까지 적색 레이저를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. </li></ol> 이미지 더 공간적 해상도를 공개 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. γH2AX foci의 크기가 0.5 μicrons보다 낮을 수 있기 때문에, 그것은 Z - 축을 따라 최소한 0.5 μicron 단계 크기의 이미지를 얻기위한 권장합니다. 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈 중 높거나 낮은 배율에 비해 선호합니다. 계산 foci를위한 이미징 많은 세포에 대한 그것은 스캔 8 속도와 1024 X 1024 픽셀의 이미지 크기를 사용하는 것이 바람직합니다. 그것이 2048 X 2048 픽셀의 이미지 크기와 함께 6 스캔 속도를 사용하는 것이 좋습니다 다른 핵 단백질 사이의 공간적 관계를 설명합니다. 여러 채널의 영상은 라인 스캔 인수는 프레임 스캔에 비해 좋습니다 때. 이것은 표백 방지하고 더 나은 해상도 이루어진다. 연속 스캔은 채널 사이를 통해 출혈을 방지하는 데 사용됩니다. Foci의 계산 이미지 분석 및 foci의 카운트는 다양한 소프트웨어 패키지를 (Metamorph, 이미지 - J와 Imaris를 inlcuding)를 사용하여 수행할 수 있습니다. Metamorph를 사용하여 foci의 계산에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. <ol><li> 직접 파일 메뉴에서 또는 빌드 번호 스택 옵션을 사용하여 오픈 γH2AX 이미지 스택. </li><li> 메뉴를 처리하는 이동하여 스택 연산을 선택했습니다. </li><li> 최대 투영을 선택하고 포함하는 비행기를 선택하고 확인을 누릅니다. </li><li> γH2AX 티파니로 결과 이​​미지를 저장합니다. 파일과 TOPRO - 3 (블루) 이미지를 엽니다. </li><li> 지역으로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주변 지역을 그립니다. </li><li> γH2AX TIFF 이미지를 클릭하고 프로세스 메뉴로 이동하여 형태학의 필터를 선택합니다. </li><li> 최상위 모자를 선택하고 원본 이미지로 γH2AX 이미지를 선택합니다. </li><li> 적용 최상위 햇 필터 및 결과 이​​미지는 foci 강도에 적은 소음 및 감소 변화와 바이너리 이미지 것입니다. </li></ol> 최상층의 가치를 선택할 때주의해야합니다. 최적의 값은 이전과 필터를 적용한 후에 이미지를 시각적으로 비교하여 얻을 수 있습니다. <ol start="9"><li> 프로세스 메뉴로 이동 및 임계값 이미지를 선택합니다. </li><li> 포함 임계값을 선택하고 아래와 높은 임계값 값을 선택합니다. </li></ol> 그것은 일반적으로 foci 번호에 영향을 문턱 값입니다. 임계값 값을 선택할 때 따라서, 많은 관심이 필요합니다. 이것은 최고의 γ - 방사선보다 낮은이 쥐 세포에 노출 서로 다른 임계값 값을 사용하여 계산 foci 번호로 달성하고 수동 계산 (눈으로)와 foci 번호를 비교할 수 있습니다. 최적의 임계값은 배경의 포함을 최소화하고 foci의 포함을 극대화 하나입니다. <ol start="11"><li> TOPRO - 3 이미지를 선택하고 지역 메뉴로 이동하여 전송 영역 옵션을 선택합니다. TOPRPO - 3으로 원본 이미지와 최상위 모자로 목적지를 선택하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 일단 핵 지역은 측정 메뉴로 이동하여 통합 Morphometry 분석을 선택 최상위 햇 이미지로 전송됩니다. </li><li> 지역으로 팝업 창을 선택 원본 이미지 톱 - 모자와 측정에. </li><li> 모든 영역을 측정 선택하고 최상층의 이미지에 해당 핵의 모든 foci 번호를 얻기 위해 측정을 클릭하십시오. </li><li> 각 지역에서 foci 번호는 로그 데이터 옵션을 사용하여 MS - Excel 파일에 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 3D이미지의 재건 Metamorph를 사용하여 스택에서 3D 이미지를 생성하려면 : <ol><li> 스택 메뉴로 이동 및 3D 재건을 선택합니다. </li><li> 회전 각도 (예 : 160 °, 320 °)를 선택합니다. </li><li> 3D 재건 유형 최대를 선택합니다. </li><li> 회전 비행기 (가로 또는 세로)을 선택할 수 있습니다. </li><li> Z - 보정 거리를 선택할 수 있습니다. </li></ol> 그것은 (최적 0.5 μicrons됩니다) Z - 거리 지정된 사용자를 사용하는 것이 바람직합니다. <ol start="6"><li> 3D 재건을 만드는 확인을 선택할 수 있습니다. </li></ol> 라인 스캔 분석 Metamorph를 사용하여 라인 스캔 분석 : <ol><li> 하나의 비행기 이미지 또는 스택 파일 중 하나를 엽니다. </li><li> 측정 도구 막대 명령으로 이동하여 라인 스캔 분석을 선택합니다. </li><li> 세포를 통해 선을 그릴이 자동으로 라인의 경로를 따라 각 마커의 형광 강도와 거리를 보여줄 것입니다. </li></ol> 다양한 염색질 마커의 공간적 관계를 명료하게하다하려면, 예를 들어, γH2AX foci와 히스톤 methylation, 그건이 마커의 밀도와 가난한 높은 지역에 걸쳐있는 라인을 그릴 것이 바람직합니다. 대표 데이터 이 예제의 목적을 위해 우리는 적극적으로 euchromatin을 속기의 epigenetic 결정자에게 DSBs의 공간적 분포를 평가하기 위해 γH2AX foci과 H3K4me하는 항체를 사용합니다. 마찬가지로 2Gy와 함께 조사에 따라 그림 1에 나타난 γH2AX foci 모두 H3K4me 얼룩과 TOPRO - 3 얼룩 DNA (밝은 스테인드 DNA 영역이 heterochromatin 나타내는 있습니다)에 대한 재미 있었다 지역에서 주로 형성했다. <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 이온화 방사선에 대한 응답으로 euchromatin에서 주로 그림 1. γH2AX foci 양식. 인간 erythroleukemic K562 세포에서 γH2AX foci (녹색)의 (A) Immunofluorescence 시각화 1 시간 γ - 방사선 후 (2 쥐). γH2AX foci가 적극적으로 euchromatin (적색)을 해독 대표, H3K4me 관련하여 표시됩니다. DNA는 TOPRO - 3 (파란색)과 함께 표시됩니다. 통합 이미지 (청색, 적색, 녹색)이 heterochromatic 지역에서 제외 γH2AX foci을 보여줍니다. 라인 스캔 분석 (형광 강도 대 거리)는 하나의 평면에있는 마커의 상대 분포를 나타냅니다. (B) 병합된 이미지의 3D 재구성 다른 비행기의 조각은 위에서 설명한.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Bonner, W. M. Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp, I. liakis, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td><td>배양 배지</td><td>Invitrogen</td><td>22400071</td><td>10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&amp;rsquo;-2-Ethanesulfonic Acid가 첨가된 pH 7.4의 RPMI-1640 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 BSA (1%)를 사용한다. 1차 및 2차 항체는 BSA에 희석하여 사용한다.</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 및 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 제외)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>생존 세포와 사멸 세포를 구분하는 데 사용된다.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포 투과화를 위해 Triton X-100 (0.1%)을 사용한다.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>세포 고정을 위해 Paraformaldehyde (4%)를 사용한다.</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX 항체</td><td>1차 항체</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>1% BSA에서 1차 항체 희석 (1:500).</td></tr><tr><td>HistoneH3 (Mono-methyl K4)</td><td>1차 항체</td><td>Abcam</td><td>AB8895</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>1% BSA에서 2차 항체 희석 (1:500).</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA 염색약</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>TOPRO3는 흡수/방출 파장이 642/661 nm인 DNA 염료이다. 공초점 현미경에 405 nm 레이저가 장착된 경우 DAPI를 사용할 수 있다.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>퇴색 방지 용액</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>이 글리세롤 기반 마운팅 용액은 굴절률이 일치하는 오일 기반 렌즈와 함께 사용해야 한다.</td></tr><tr><td>Polylysine 슬라이드</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (22x50mm)</td><td>커버슬립</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td><td>배양 플라스크</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 4</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 카드</td><td></td><td>Shandon, Inc.</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar, glass</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>염색 트라프</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td></td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td><td>감마 조사기</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>공초점 현미경</td><td></td><td></td><td>488 nm, 543 nm 및 633 nm의 3가지 레이저가 장착되어 있다.</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이온화 방사선 다음 γh2ax의 공간적 분포 평가

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)에 초기 분자 응답은 히스톤 H2AX 1,2의 터미널 SQEY의 모티브 내에서 빼앗아 - 139 잔기의 인산화입니다. H2AX 이러한 인산화은 phosphatidyl - inosito 3 키나제 (PI3K) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA - 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련 (ATR) 3 중재입니다. γH2AX이라고 H2AX의 phosphorylated 양식, immunofluorecence 현미경 3 쉽게 시각 아르 이산 foci를 형성 DSB의 사이트에서 염색질의 인접 지역으로 확산됩니다. γH2AX foci의 분석 및 quantitation 널리 특히 이온화 방사선에 대한 응답과 화합물 및 세포 독성 화합물 4를 수정 각종 방사선의 효능을 평가 DSB 형성 및 수리를 평가하는 데 사용되었습니다. DSBs이 드 노보 마커의 절묘한 특이성과 감도 감안할 때, 그것은 염색질의 맥락에서 DNA 손상과 복구의 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 예를 들어, 방사선 생물학의 중심 패러다임은 핵 DNA가 방사선 민감도와 관련하여 중요한 목표는 것입니다. 사실, 현장에서 일반적인 합의는 크게 DNA 손상 및 수리를위한 단일 템플릿으로 염색질을 볼 수있다. 그러나, DSBs의 분자 마커, euchromatin과 heterochromatin의 γ - 방사선 유발 γH2AX foci 형성의 차이로 γH2AX의 사용과 5-7 관찰되었습니다. 최근, 우리는 항체의 패널을 사용하거나 모노, 제정 heterochromatin 및 transcriptional 입을와 라이신 4 epigenetic 인쇄물 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 아르 디 또는 리신 9 트라이 - methylated 히스톤 H3 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) ), 단단히 이온화 방사선 8 다음 γH2AX의 공간적 분포를 조사하기 위해 적극적으로 euchromatic 지역을 해독하는 상호. 염색질 생물학에 관한 일반적인 아이디어에 따라, 우리의 연구 결과는 γH2AX 형성과 적극적인 전사 구 사이에 밀접한 상관 관계를 지적했다. 여기는 다른 epigenetic 마커, 이미지 분석 및 3D 모델링과 함께 공동 지방화에 특히 초점, 비 점착 성의 세포에 γH2AX foci의 감지 및 quantitation위한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

DNA 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 초기 분자적 반응은 히스톤...의 말단 SQEY 모티프 내 Ser-139 잔기의 인산화입니다.

안녕하세요, 저는 Baker IDI Heart and Diabetes Institute에서 박사 과정을 밟고 있는 Raja Ti입니다. 저는 신경 세포의 DNA 손상과 염색질 응축을 나타내는 Eastern modification의 3D 일러스트레이션에 포함된 단계들을 안내해 드리겠습니다. DNA는 핵 구역 주변으로 감겨 있습니다.각 뉴클레오솜은 네 가지 서로 다른 유형의 히스톤인 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성됩니다. DNA 절단이 형성되면 이는 H2AX의 인산화로 표시됩니다. 이러한 H2AX의 인산화는 주로 H3K4의 메틸화로 표시되는 염색질에서 일어납니다. 이제 인산화된 H2AX와 메틸화된 H3K4로 면역 표지된 세포 내 수식의 3D 일러스트레이션을 살펴보겠습니다.시작하겠습니다. 먼저 세포 현탁액의 E 코스를 15 ml Falcon 튜브에 넣습니다. PB scentation을 이용하여 1,500 G에서 두 번 세척하고 재현탁합니다.방사선이 세포 사건에 미치는 즉각적인 영향을 확인하기 위해 신선한 배지에 현탁합니다. 방사선 조사 전과 조사 중에 세포를 안구 위에 5분에서 10분 동안 유지합니다. 세포를 감마선 또는 X선에 노출시킵니다. 방사선 조사 후, 세포 현탁액 3 mL를 6개의 각 GU에 분주합니다.피크 γH2AX 분석용 웰 플레이트에서 세포를 37°C로 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 비부착성 세포를 유리 슬라이드 위에 올리기 위해 사이토스핀(Cytospin) 장치를 사용합니다. 사이토스핀 클립을 조립할 때, 필터 카드가 깔때기와 완전히 일치하는지 확인하십시오.각 사이토스핀 챔버에 50 µL의 세포 현탁액을 분주하십시오. 사이토스핀 챔버를 사이토스핀 원심분리기에 장착하고 500 RPM에서 5분 동안 원심분리하십시오. 사이토스핀 챔버를 제거하고 필터 카드에서 슬라이드를 분리하십시오. 세포가 공기 중에서 너무 오래 건조되지 않도록 주의하십시오. 이는 형광 염색의 배경색에 영향을 줄 수 있습니다.액체 차단 핀을 사용하여 각 도말 주변에 원을 그린 후, 실온에서 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 세포를 고정합니다. 에탄올이나 오일과 비교했을 때, 4% 파라포름알데히드에서 더 우수한 고정 효과가 관찰되었습니다. Triton X 100을 사용하여 실온에서 5분 동안 세포를 투과화한 후 슬라이드를 세척합니다.Twin 80과 비교했을 때, Triton X 100을 사용한 세포에서 더 나은 신호를 관찰하였습니다. PP S3로 세포를 각각 5분씩 3회 관찰하십시오. 다른 블로킹 제제 및 시간과 비교했을 때, 실온에서 1% BSA로 세포를 10분 동안 블로킹하고 이를 3회 반복하십시오.BSA는 1차 항체의 비특이적 결합을 최소화하는 데 가장 효율적이었습니다. 당사는 1% BSA가 포함된 용액으로 1:500으로 희석한 두 종류의 1차 항체를 사용하였으며, 각 슬라이드당 약 50 µL의 1차 항체를 처리하였습니다. 1차 항체를 상온에서 60분 동안 배양하는 것이 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하는 것보다 배경 염색을 줄여줍니다. PBS로 세포를 5분 동안 세 번 세척합니다.Alexa Fluor 488은 좋은 항-마우스(anti-mouse) 항체이며, Alexa Fluor 546은 항-토끼(anti-rabbit) 항체입니다. 서로 다른 마커를 동시에 염색하기 위해 2차 항체를 사용하였습니다. 서로 다른 종에서 생성된 항체를 사용하십시오.각 슬라이드에 희석된 2차 항체를 약 50 µL씩 추가합니다. 세포를 상온에서 90분 동안 배양합니다. 세포와 항체가 마르는 것을 방지하기 위해 습윤 챔버(moist chamber)에서 배양하는 것을 권장합니다. PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다.PBS에 1:500으로 희석한 topo three 50 µL를 각 슬라이드에 첨가했습니다. PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다. 슬라이드의 과잉 수분을 제거하고 Antifa 용액을 첨가합니다.Antifa 용액을 첨가하기 전에 세포를 완전히 건조시키지 않는 것이 좋습니다. 슬라이드 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의해야 합니다.슬라이드를 어둡고 습한 챔버에 하룻밤 동안 보관하십시오. 세포의 건조를 방지하기 위해 슬라이드를 매니큐어로 밀봉하십시오. 공초점 현미경으로 획득한 이미지를 통해 확인하십시오.더 나은 공간 해상도를 얻기 위해 이미지 획득 과정에서 헬륨 레이저가 사용되었습니다. 더 높거나 낮은 배율의 렌즈보다 63배 오일 몰입 대물렌즈가 선호되었습니다. 3배 또는 4배의 줌 배율을 적용하면 더 해상도가 높은 이미지를 생성할 수 있습니다.많은 세포로부터 FO 회계를 수행할 때는 스캔 속도를 8로, 이미지 크기를 1024 × 1024 픽셀로 설정하는 것이 바람직합니다. 다중 채널 이미징 시에는 프레임 스캔보다 순차적 라인 스캔 획득 방식이 권장됩니다. 시료의 광퇴색을 방지하기 위해, 노이즈와 신호 포화를 줄이도록 검출기 게인(gain)과 증폭기 오프셋(offset)을 조정합니다.Kama HX X four의 크기가 0.5 µm보다 작을 수 있으므로, 최소 0.5 µm의 해상도로 이미지를 획득하는 것을 권장합니다. mark first 및 mark lost 패턴을 사용하는 제트 시리즈 패턴에서는 제트 축을 따른 스텝 크기 이미지가 필요합니다. 서로 다른 단백질 간의 공간적 관계를 나타내기 위해서는 metamor first를 사용하여 이미지 크기 2048 x 2048 픽셀, 스캔 속도 6으로 설정하는 것이 권장됩니다.두 번째로, 다양한 공초점 현미경에서 획득한 이미지로부터 계수할 수 있습니다. 파일 메뉴에서 직접 또는 빌 번호를 사용하여 gamma hgx 이미지 태그를 엽니다. 프로세스 메뉴로 이동하여 Stack arithmetic을 선택하십시오.최대 투영(maximum projection)을 선택하고 포함할 평면을 선택하십시오. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 이제 top hat을 선택하고 Gamma H two X 이미지를 소스 이미지로 선택한 후 적용하십시오.Top hat 필터와 그 결과 이미지는 노이즈가 적고 초점 강도의 변동이 감소된 이진 이미지(binary image)가 됩니다. Regions로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주변에 영역을 그립니다. Process 메뉴로 이동하여 임계값 이미지(threshold image)를 생성합니다.포함 임계값(inclusion threshold)을 선택하고 하한값과 상한값을 설정하십시오. 일반적으로 네 가지 수치에 영향을 주는 것은 임계값입니다. 최적의 임계값은 배경의 포함은 최소화하고 포자(foray)의 포함은 최대화하는 값입니다.이는 서로 다른 임계값을 사용하여 foray 수를 계산함으로써 가장 효과적으로 달성할 수 있습니다. 그런 다음 육안으로 계산한 foray 수와 비교하십시오. DPI 이미지를 선택하고 regions 메뉴로 이동하여 transfer regions 옵션을 선택하십시오.이제 계수를 위해 그에 상응하는 포레이(foray) 이미지와 핵 이미지가 준비되었습니다. 대부분의 핵 영역은 탑햇(top hat)으로 전송됩니다. 측정(measure) 메뉴로 이동하여 통합 영역 분석(integrated ary analysis) 또는 IMA를 선택하십시오. 모든 영역 측정(Measure all regions)을 선택하고 측정(measure)을 클릭하여 FTE 수치를 얻으십시오.이제 Log 데이터 옵션을 사용하여 각 지역의 FTE 수치를 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 이전에 생성한 각 채널별 제트 프로젝터 이미지를 엽니다. display로 이동하여 color align을 선택하십시오.세 가지 채널 모두에 대한 이미지를 생성하기 위해 각 채널의 해당 소스 이미지를 선택하십시오. 핵 내 서로 다른 마커의 공간적 위치를 나타내기 위해 라인 스캔 분석을 수행합니다. 측정 도구 모음 명령으로 이동하여 라인 스캔 분석을 선택하고 세포를 가로지르는 선을 그리십시오.이렇게 하면 라인을 따라 각 채널의 형광 강도를 보여주는 그래프가 생성되며, 이는 서로 다른 마커 간의 거리를 나타냅니다. 스택에서 3D 이미지를 생성하려면 스택 메뉴로 이동하여 3D reconstruction을 선택하십시오. 3D reconstruction 유형으로 maximum을 선택하십시오.회전 평면을 선택하고, 제트 보정 거리를 선택하십시오. 일반적으로 사용자가 확인을 클릭하여 3D 재구성을 생성합니다. 이것으로 면역형광 염색 및 이미지 분석 프로토콜을 마칩니다.요약하자면, 면역형광 공초점 현미경은 세포 핵 내의 서로 다른 C 마커와 gamma H2AX 포커스를 3차원으로 시각화하기 위한 두 가지 기술입니다. 시청해주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

이 프로토콜은 말초 혈액 림프구에 대한 γ-H2AX 포시 분석의 슬라이드 준비 및 자동 채점을 제공합니다. 분석의 방법 및 민감도를 설명하기 위해, 격리된 림프구는 시험관내에서조사되었다. DNA DSB 검출의 이 자동화된 방법은 빠르고 높은 처리량 생물학 도시법 응용에 유용합니다.

인간 말초 혈액 림프구의 γ-H2AX 포시 분석에 대한 자동화된 현미경 채점 방법

이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.

인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

학습하세요 이온화 방사선에 의한 DNA 이중가닥 절단 표지자인 γH2AX의 핵 내 공간적 분포를 면역형광 및 공초점 현미경으로 분석하는 방법을. 이 기법은 방사선 생물학 연구에 필수적입니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

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