이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

안녕하세요, 저는 Baker IDI Heart and Diabetes Institute에서 박사 과정을 밟고 있는 Raja Ti입니다. 새로운 심장 세포에서 DNA 손상과 색채 응축을 표시한 동양 변형의 3D 일러스트레이션과 관련된 단계를 안내해 드리겠습니다. DNA는 핵 지역을 감싸고 있습니다.

각 뉴클레오솜은 H 2 A, H 2 b, H 3 및 H 4 radi의 4 가지 유형의 히스톤으로 구성됩니다. DNA의 형성은 H, 2, X의 PHO로 표시되며, H, 2X의 포는 주로 크레아틴에서 발생하며, 이는 H3, K4의 메틸화로 표시됩니다. 이제 pho layer H two X 및 methylated H Three K four를 사용하여 세포 면역 라벨의 변형에 대한 3D 그림을 살펴보겠습니다.

시작하자. 우리는 세포 현탁액의 E 과정을 15mil에 배치하는 것으로 시작합니다. Falcon 튜브 S는 한 번의 50G와 Resus에서 PB 향으로 두 번 세척합니다.

새로운 Media를 일시 중단하여 세포 이벤트에 대한 방사선의 즉각적인 효과를 확인합니다. 방사선 투여 전과 방사선 투여 중에 5분에서 10분 동안 세포를 눈에 고정시키십시오. 세포를 감마선 또는 X선에 노출 방사선 치료 후 3ml의 세포 현탁액을 6개의 GU당

피크 감마 H 2 X를 위한 웰 플레이트는 섭씨 37도에서 30분에서 1시간 사이에 세포를 배양합니다. 우리는 Cytosine mission을 사용하여 비부착성 세포를 유리 슬라이드에 배치합니다. 사이토신 클립을 조립할 때 전체 필터 코드가 깔때기와 일치하는지 확인하십시오.

하나의 50 마이크로 리터를 분배하고,이 세포 현탁액을 각 시토신 최종 위치에 면봉으로 닦아 사이토신 임무에 사이토신 클립하고 5 분 동안 500 RPM으로 회전시킵니다. 사이토신 클립을 제거하고 필터 카드에서 슬라이드를 분리합니다. 플루오레세인 염색의 배경에 영향을 줄 수 있으므로 세포를 너무 오래 공기 중에서 건조시키지 마십시오.

액체 차단 핀을 사용하여 각 도말 주위에 원을 그리고 실온에서 5분 동안 4% 파라폼 헤드로 셀을 고정합니다. 에탄올 또는 ol과 비교했을 때, 4%파라폼 헤드에서 더 나은 고정이 관찰되었다. Triton X 100이 포함된 PPS 퍼메 셀로 실온에서 5분 동안 바람 미끄러집니다.

트윈 80과 비교했을 때, Triton X 100의 세포에서 더 나은 신호를 관찰했습니다. PP S3가 있는 셀을 각각 5분 동안 관찰합니다. 실온에서 10분 동안 1인 BSA의 세포를 차단하고 다른 차단제 및 횟수와 비교할 때 이를 3회 반복합니다.

BSA가 가장 효율적이었습니다: 1차 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해, 우리는 각 슬라이드에 약 50마이크로리터의 1차 항체에서 1% BSA로 500분의 1로 희석된 2개의 1차 항체를 사용했습니다. 실온에서 1차 항체를 60분 동안 배양하면 섭씨 4도에서 하룻밤 배양하는 것에 비해 배경 염색이 줄어듭니다. PBS로 5분 동안 세포를 세 번 세척합니다.

알렉사 층 4 88, 좋은 안티 마우스 및 알렉사 층 5 46 단어 안티 토끼. 2차 항체를 사용하여 서로 다른 마커를 동시에 유지했습니다. 다른 종에서 사육된 항체를 사용하십시오.

각 슬라이드에 약 50마이크로리터의 희석된 2차 항체를 추가합니다. 실온에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 축축한 챔버에서 세포를 배양하는 것이 좋으며, 이는 세포와 항체가 PB S3로 세척 슬라이드를 건조시키는 것을 방지하므로 각각 5분 동안 수행합니다.

PBS에서 topo 3의 500분의 1 희석액 50마이크로리터를 각 슬라이드에 첨가했습니다. PBS로 슬라이드를 5분 동안 각각 3회씩 세척합니다. 슬라이드에서 과도한 수분을 제거하고 안티파 용액을 추가합니다.

Antifa 용액을 추가하기 전에 세포를 완전히 건조시키지 않는 것이 좋습니다. 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓습니다. 기포가 형성되지 않도록 K를 취해야 합니다.

어둡고 습한 챔버에서 밤새 슬라이드를 두십시오. 세포의 건조를 방지하기 위해 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 이미지는 컨포칼 현미경을 획득했습니다.

더 나은 공간 해상도는 사라지고 이미지 획득에 헬륨 레이저가 사용되었습니다. 63 오일 배출 물체는 두 개의 렌즈가 더 높거나 낮은 배율 렌즈보다 선호됩니다. 확대/축소 비율이 3 또는 4이면 더 나은 해상도의 이미지가 생성됩니다.

많은 셀에서 FO 계산을 위해서는 1024 픽셀 셀에 대해 8의 스캔 속도, 1024의 이미지 크기를 사용하는 것이 바람직합니다. 다중 채널을 이미징할 때는 프레임 스캔에 비해 순차적 라인 스캔 획득이 권장됩니다. 표본 표백을 방지하기 위해 검출기 게인과 증폭기 오프셋을 조정하여 마우스와 신호 포화도를 줄입니다.

Kama HX X four의 크기는 0.5μm보다 작을 수 있으므로 0.5μm 이상의 이미지를 획득하는 것이 좋습니다. 제트 축 이미지를 따른 단계 크기는 마크 먼저 및 마크 손실 패턴을 사용하는 제트 시리즈 패턴에 필요합니다. 서로 다른 단백질 간의 공간적 관계를 설명하기 위해 이미지 크기가 2048인 스캔 속도 6을 사용하고 메타모어를 먼저 사용하여 2 48픽셀을 사용하는 것이 좋습니다.

두 번째는 다양한 컨포칼 현미경에서 얻은 이미지에서 계산할 수 있습니다. 파일 메뉴에서 직접 또는 지폐 번호를 사용하여 감마 hgx 이미지 태그를 엽니다. 태그. 프로세스 메뉴로 이동하여 스택 산술을 선택합니다.

최대 투영을 선택하고 포함할 계획을 선택합니다. 그리고 확인을 클릭합니다. 이제 top hat을 선택하고 Gamma H two X 이미지를 소스 이미지가 적용되도록 선택합니다.

Top hat 필터 및 결과 이미지는 노이즈가 적고 초점 강도의 변동이 적은 이진 이미지입니다. 영역으로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주위에 영역을 그립니다. 프로세스, 메뉴 및 판매 임계 값 이미지로 이동합니다.

포함 임계값을 선택하고 더 낮은 임계값과 더 높은 임계값을 설정합니다. 일반적으로 4개의 숫자에 영향을 미치는 임계값입니다. 최적 임계값은 배경 포함을 최소화하고 진출 포함을 최대화하는 임계값입니다.

이는 서로 다른 임계값을 사용하여 진출 횟수를 계산하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 진출 횟수를 육안 계산과 비교합니다. DPI 이미지를 선택하고 영역 메뉴로 이동하여 전송 영역 옵션을 선택합니다.

이제 우리는 계수할 준비가 된 해당 진입 및 핵 이미지를 갖게 되었습니다. 대부분의 핵 지역은 탑햇으로 이전됩니다. 측정으로 이동하여 메뉴를 선택하고 통합 분석 또는 IMA를 선택하여 모든 영역 측정을 선택하고 측정을 클릭하여 FTE 번호를 얻습니다.

이제 로그 데이터 옵션을 사용하여 각 지역의 FTE 번호를 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 각 채널에 대해 이전에 생성된 제트 프로젝터 이미지를 엽니다. 디스플레이로 이동하여 색상 정렬을 선택합니다.

각 채널에 대한 각각의 소스 이미지를 선택하여 세 채널 모두에 대한 이미지 이미지를 만듭니다. 라인 스캔 분석은 핵 내 다양한 마커의 공간적 위치를 설명하기 위해 수행됩니다. 도구 모음 측정 명령으로 이동하여 셀 전체의 라인 스캔 분석 드라이 라인을 선택합니다.

이것은 선을 따라 각 채널의 형광 강도를 보여주는 그래프를 생성하고 서로에 대한 서로 다른 마커의 거리를 나타냅니다. 스택에서 3D 이미지를 만들려면 스택 메뉴로 이동하여 3D 재구성을 선택합니다. 3D 재구성 유형 최대값을 선택합니다.

회전 계획을 선택하고 제트 교정 거리를 선택하십시오. 일반적으로 사용자는 3D 재구성을 만들기 위해 확인을 클릭합니다. 이것으로 Immuno fluor 및 staining 및 이미지 분석을 위한 프로토콜이 마무리되었습니다.

요약하면, 면역형광 컨포칼 현미경은 세포핵에서 서로 다른 C 마커와 감마 H 두 X foy의 3차원 시각화를 위한 두 가지 기술입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.