Name: Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 틸라피아 호수 바이러스(TiLV) 검출을 위한 RT-PCR 및 실시간 정량 PCR 방법을. 간 조직에서 RNA 추출 및 cDNA 합성 후 바이러스 정량 분석을 수행합니다. 이 프로토콜은 양어장 질병 관리와 식량 안보에 필수적인 신뢰할 수 있는 진단 도구를 제공합니다.

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우리는 그들의 지원에 대 한 수의 세균 학 연구소, Vetsuisse 교수, 베른 대학에 감사입니다. 이 작품은 pn 수 여 Vetsuisse 교수, 120% 모델 자금에 의해 베른 대학에서 초기 경력 연구원의 학술 진흥 및 성 평등을 위한 위원회에 의해 투자 되었다. WS 및 홍보는에서 지원 센터 고급 연구를 위한 농업 및 식품, 고급 연구, Kasetsart 대학, 방콕, 태국 등 교육 연구 진흥 및 국가 연구 대학 프로젝트의 태국, 오피스 연구소 고 등 교육 위원회, 교육 과학기술부, 태국. 우리는 그녀의 내레이션에 대 한 박사 Kwanrawee Sirikanchana Piyawatchara Sikarin 비디오 편집을 위한 감사 하 고 싶습니다.

이 연구의 동물 사용 프로토콜 허가 번호 ACKU 59-수 의사-016 Kasetsart 대학 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
참고: 확장 된 사항은 시 약 및 장비가이 프로토콜에 대 한 제안에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
1. 조직 샘플 컬렉션
<ol><li>정 향 오일 (볼륨에 따라 물고기의 크기와 농도의 제품, 보통 이상의 3 mL/L)의 과다를 사용 하 여 물고기 안락사 95% (v/v) 에탄올 알코올 버너를 사용 하 여 장비를 소독 하는 장비를 레코딩하여 뒤에 집게와 메이 요가 위 1-4를 담가. 참고: Tricaine methanesulfonate (MS-222) 정 향 기름 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>찾아 간 작은 조각 (약 20-100 mg)을 잘라 또는 후부 tilapia 물고기의 앞쪽에서 점액을 제거 하 고 샘플 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 커버 유리 또는 외과 블레이드를 사용 하 여 점액의 200 µ L를 수집.</li>
	<li>프로세스 샘플 즉시, RNA 안정화 솔루션에에서 저장 하거나 추가 사용까지-80 ° C로 이동. 참고: RNA 작업에 가장 큰 작업 준비 그대로 RNA 분자 이며 그들을 유지 하는 모든 후속 보정을 통해 손상 되지 않은. RNA 백본 innately DNA 보다 손상에 더 과민 하다. 추출 및 조직 세포에서 총 RNA의 격리 필요로 조심 실험실 기술; 오염을 방지 하기 위해 RNase RNase 무료 물, 시 약, 장비, 플라스틱 도자기, 유리, 작업 공간을 사용 하 여 장갑을 끼고 고 pipetting에 대 한 필터 팁을 사용 하 여 모든 규정을 가져가 라.</li>
</ol>2. Guanidium 안산-페 놀-클로 프롬 RNA 추출
<ol><li>섹션 1에서에서 조직 샘플을 포함 하는 관으로 페 놀 및 guanidine isothiocyanate를 포함 하는 monophasic 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 주의:이 솔루션은 매우 독성이 고 보호 장비와 적절 한 보호 안경, 의류, 안전 장갑 착용 하 여 층 류 두건에 관리와 처리 해야 합니다.</li>
	<li>갈기는 조직 유 봉 균질 화기까지 균질를 사용 하 여 조직 샘플. 참고: 샘플 수 또한 될 무 균 세라믹 구슬 함께 전원 균질 화기를 사용 하 여. 조직 샘플은 다음 단계를 진행 하기 전에 완전히 무 균을 확인 하거나 프로토콜 여기 중지 하 고 추가 사용까지-80 ° C에서 완전 무 균된 샘플을 저장.</li>
	<li>단계 구분에 대 한 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 주의 클로 프롬 잠재적인 마약 이며 매우 위험한. 그것은 층 류 두건 보호 장비 뿐만 아니라 적절 한 보호 안경, 의류, 안전 장갑 입고 관리와 함께 처리 되어야 합니다. 적은 독성으로 대체, 1-브로 모-3-chloropropane 사용할 수 있습니다. 참고: 확장 볼륨을 위 또는 아래로 적절 한. 예를 들어 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 500 µ L를 사용 하는 경우에 다음만 추가 100 µ L 클로 프롬의이 단계에서.<ol>
<li>샘플 15 반전 하 여 잘 혼합 s.</li>
		<li>실 온 (RT)에서 3 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 × g 에서 15 분 및 4 ° c.에 대 한 원심 분리기 참고: 낮은 유기 단계, 흰색 interphase 및 RNA를 포함 하는 위 수성 단계에는 명확 하 게 구분을 하 고 있어야 합니다. 이 상위 단계는 일반적으로 무색 하지만 종류와 무 균된 조직의 금액에 따라 밝은 분홍색 외관을 가질 수 있습니다.</li>
	<li>Interphase는 방해 하지 않고 신선한 microcentrifuge 튜브 위 수성 층 (약 500 µ L) 전송. 참고: 전체 수성 단계 전송, 유기와 수성 단계를 포함 하는 RNA의 어떤 잠재적인 오염을 방지 하기 위해 작은 금액을 두고 또는 interphase 하려고 하지 마십시오.</li>
	<li>RNA 침전을 100% 소 프로 파 놀의 1 볼륨을 추가 합니다.<ol>
<li>선택적으로, 아주 적은 양의 조직 사용한 경우 다음 추가 1 µ L (5-10 µ g) RNase 무료 glycogen의 효율적 RNA 강 수를 홍보 하는 각 샘플을. 이 단계 2.8에서에서 RNA 펠 릿의 식별을 도움이 됩니다. 참고: 있는 glycogen RNA의 운반대로 작동 하 고 튜브의 측면에 집착에서 RNA의 소량을 방지할 것 이다.</li>
		<li>믹스 전도 의해 잘 여러 번 튜브합니다.</li>
		<li>-20 ° c.에 하룻밤 2 h에 대 한 샘플 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 샘플</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브의 하단에 RNA 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 되 고 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>75% 에탄올 (v/v)의 1 mL을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA 샘플을 혼합.</li>
	<li>10000 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 참고: 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다 그리고 75% 에탄올에 RNA 펠 릿으로 구성 된 샘플 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 될 수 있다.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브의 하단에 RNA 펠 릿을 꺼내 려 하지 감시 되 고 상쾌한을 삭제 합니다.<ol>
<li>필요에 따라 반복 단계 2.9-2.11 70% 에탄올 (v/v)를 사용 하 여. 철저 하 게 어떤 소금 최소화 RNA 펠 릿을 세척 또는 방해 오염 이성 민감한 다운스트림 응용 프로그램을 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 나머지 에탄올 밖으로 그리고 5 ~ 10 분 보다는 더 이상에 대 한 실 온에서 RNA 펠 릿 건조 합니다. 참고:-건조 펠 릿을 다시 중단 어려울 것 이다.</li>
	<li>30-60 µ L RNase 무료 물, RNA 펠 릿을 solubilize를 55-60 ° C에 미리 예 열을 추가 합니다.</li>
	<li>즉시 사용 하거나 나중에 사용-80 ° C에 게 얼음에 RNA를 놓습니다.</li>
</ol>3. 계량 마이크로 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 농도
<ol><li>RNA는 분 광 광도 계의 설정을 전환 합니다.</li>
	<li>RNase 무료 물 1-2 µ L를 사용 하 여 빈으로.</li>
	<li>각 RNA 샘플의 1-2 µ L를 사용 하 여 RNA 수량 평가.</li>
	<li>230에서 판독 기록 nm, 260 nm와 280 nm 각 샘플에 대 한.</li>
	<li>200 RNA 희석 ng / µ L RNase 무료 물을 사용 하 여.</li>
</ol>4. 총 RNA를 사용 하 여 보완 DNA (cDNA)의 합성
<ol><li>프로토콜 2, 2 µ M 올리고 (dT), 0.5 m m dNTPs 혼합물에서에서 총 RNA의 1 µ g을 혼합 하 고 nuclease 무료 물으로 10 µ L를 최종 볼륨을가지고. 이 위해, RT-마스터-혼합 샘플 및 컨트롤 수에 따라 테스트를 준비 합니다. 참고: 컨트롤은 마이너스-역전사 샘플 (-RT) 어떤 점에서 RT 효소 nuclease 무료 물으로 대체 됩니다 (단계 4.3 참조)와 아무 템플릿 컨트롤 (NTC) 어떤 점에서 nuclease 무료 물 RNA 서식 파일 대신 마스터 믹스에 추가 됩니다.<ol>
<li>잘 뒤에 간단한 원심 pipetting으로 샘플을 믹스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 분 2 분 부 화 뒤에 얼음에 65 ° C에서 샘플을 품 어.<ol>
<li>짧게 원심 튜브의 하단에 있는 액체의 모두 수집 하도록 샘플.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x 역전사 버퍼, 100 U 역전사 추가 각 샘플의 최종 볼륨 20 µ L nuclease 무료 물을 사용 하 여.<ol>
<li>잘 뒤에 간단한 원심 pipetting으로 샘플을 믹스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>42 ° C 60 분 5 분 85 ° c에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>물 nuclease 무료의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 원하는 농도에 합성된 cDNA를 희석 즉각적인 사용을 위해 얼음에는 cDNA를 장소 또는 나중에 사용-20 ° C에서 그것을 저장.</li>
</ol>5. TiLV 기존의 PCR
<ol><li>CDNA, 샘플 및 컨트롤, 템플릿 설립된 뇌관 쌍 선택의 DNA 중 합 효소와 함께 표 1에 자세히 설명 중 하나를 사용 하 여 PCR 반응에 대 한 프로토콜 섹션 4에서에서 생성 된 사용 합니다. 참고: 추가 없음-템플릿 컨트롤 (NTC) nuclease 무료 물이 PCR 반응에 대 한 cDNA를 대체 하 여 여기 포함 되어야 합니다. 긍정적인 통제, 가능 하다 면, 또한 이전 확인된 TiLV 긍정적인 샘플 구성 포함 되어야 합니다 또는 적절 한 TiLV cDNA 조각 한 플라스 미드에 복제 합니다.</li>
	<li>샘플 및 컨트롤을 테스트할 수 및 사용 중인 DNA 중 합 효소 시스템의 지침에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 이 믹스는 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관, dNTPs, MgCl2 와 선택 된 DNA 중 합 효소, 버퍼 함께 포함 되어야 합니다.</li>
	<li>선택 된 DNA 중 합 효소의 지침에 따라 마스터-믹스의 볼륨을 지정 된 cDNA 샘플 및 제어 샘플의 제안된 금액 결합 되어 있습니다. 참고: 반응 초과 x 0.5 준비는 자주 도움이 이후 마스터-믹스의 일부 pipetting 동안 손실 됩니다.</li>
	<li>자전거 사용된 DNA 중 합 효소 시스템의 지침에 따라 조건 및 사용 (표 1) 프라이 머에 대 한 적절 한 어 닐 링 온도 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 일반적으로, 이러한 프로그램 30 95 ° C에서 변성의 30-40 주기 다음 2-5 분 동안 95 ° C에서 초기 변성을 포함 한다 s, 30 s 및 30에 대 한 72 ° C에서 신장에 대 한 권장된 온도에서 어 닐 링 s, 72 ° C 5-10에 최종 신장 뒤 분입니다.</li>
	<li>각 PCR 반응 및 예상된 PCR 제품의 크기에 따라 1-2 %agarose 젤의 우물에는 적절 한 DNA 사다리의 5-15 µ L을 로드 합니다. 젤 전기 이동 법에 의해 증폭 된 DNA를 분리 하 고 자외선을 사용 하 여 젤 설명서 기계에서 젤 ethidium 평범한 사람 (EthBr)의 예상된 크기 (표 1) DNA 밴드의 시각화를 용이 하 게 하 여 얼룩. 주의: EtBr은 독성; 그것은 치료와 함께 적절 한 보호복 및 안전 장갑을 착용 하 여 처리 되어야 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>대상 TiLV 게놈 세그먼트</td>
			<td colspan="3">앞으로 뇌관 5'-3 '</td>
			<td colspan="3">반전 뇌관 5'-3 '</td>
			<td>PCR 제품 크기 (bp)</td>
			<td>Tm ° C</td>
			<td>원래 참조</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC</td>
			<td colspan="3">GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT</td>
			<td>1641</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT</td>
			<td colspan="3">AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG</td>
			<td>1000</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT</td>
			<td colspan="3">TTACCATATATATAGTGAAGGC</td>
			<td>1445</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">GTCCAGGGCGGTATGTATTG</td>
			<td colspan="3">CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">GTTGGGCACAAGGCATCCTA</td>
			<td colspan="3">TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT</td>
			<td>250</td>
			<td>56</td>
			<td>Eyngor 그 외 여러분, 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">TATGCAGTACTTTCCCTGCC</td>
			<td colspan="3">TTGCTCTGAGCAAGAGTACC</td>
			<td>491</td>
			<td>57</td>
			<td>Eyngor 그 외 여러분, 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA</td>
			<td colspan="3">CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT</td>
			<td>1352</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG</td>
			<td colspan="3">GAGCTAAGGGAACGGCTATTG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG</td>
			<td colspan="3">ACCGTCCTGTTTCTGAATGG</td>
			<td>358</td>
			<td>60</td>
			<td>니콜 슨 외., 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA</td>
			<td colspan="3">GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT</td>
			<td>1250</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td>524</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC</td>
			<td colspan="3">CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG</td>
			<td>1087</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC</td>
			<td colspan="3">CGTTCTGCACTGGGTTACA</td>
			<td>696</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="3">CCAAATTTTACCTCTCGCAT</td>
			<td colspan="3">TCAAGCACTTAAAACTGTACC</td>
			<td>1027</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="3">CCCACACGACAGGACATATAG</td>
			<td colspan="3">GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA</td>
			<td>948</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">CTCTCTTTGCATTGCATACCGT</td>
			<td colspan="3">GACCAATTATCCCTGCTTTCA</td>
			<td>704</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC</td>
			<td colspan="3">TTCCATCGACTGCTCCTAGA</td>
			<td>486</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="3">ACCTCATCTACACTAACATTTCCA</td>
			<td colspan="3">TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT</td>
			<td>637</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="3">CTTAAGGGCCATCCTGTCATC</td>
			<td colspan="3">TGGCTCAAATCCCAACACTAA</td>
			<td>476</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">TTGGTGATGTCACGATGGATA</td>
			<td colspan="3">AGTTCTATCGCCAGCCATGT</td>
			<td>351</td>
			<td>60</td>
			<td>니콜 슨 외., 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC</td>
			<td colspan="3">TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA</td>
			<td>530</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">GATATCCTCCACATGACCCTTC</td>
			<td colspan="3">GTACGTCACTTTGTGCCATTAC</td>
			<td>261</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="3">AACCCTACTAACACCAAATATAGCT</td>
			<td colspan="3">CTTTCCCTCTGACACCCTGT</td>
			<td>450</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong 그 외 여러분, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="3">TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT</td>
			<td colspan="3">CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT</td>
			<td>276</td>
			<td>62</td>
			<td>Mugimba 그 외 여러분, 2018</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 끝점 PCR를 사용 하 여 TiLV cDNA의 증폭에 대 한 게시 된 뇌관 쌍. 굵게 표시 된 설정 뇌관 그림 3A 및 3B에 표시 하는 대표적인 결과 생성 하 사용 되었다.
6. TiLV 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)
<ol><li>적절 한 TiLV를 포함 하는 플라스 미드를 사용 하 여 pTiLV32, 같은 표준으로 게놈 세그먼트 3 cDNA 중복 또는 triplicated 10 직렬 희석 시리즈 준비.</li>
	<li>모든 샘플, 표준 및 컨트롤에 대 한 정량 마스터-믹스를 준비, 복제 또는 triplicate nuclease 무료 물 0.4 µ L, 앞으로 뇌관의 0.3 µ L, 역방향 뇌관의 0.3 µ L, SYBR 녹색 x 2의 5 µ L을 이용 하는 반응에서 수행 해야 하는 계정에 Dna 중 합 효소 반응 당 마스터 믹스입니다.<ol>
<li>10 µ M 및 뇌관 정보 및 표준 pTiLV의 농도에 프라이 머를 다음과 같이 사용. 뇌관을 앞으로: TiLV 112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3') 반전 뇌관: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3') 표준 pTiLV:10 pg / µ l 참고: 샘플 및 컨트롤의 총 수는 10 triplicates에서 수행 될 경우이 정량 마스터-믹스 12 µ L nuclease 무료 물, 9 µ L 앞으로 뇌관, 9 µ L 역 뇌관 및 SYBR 녹색 DNA 중 합 효소 마스터-믹스의 150 µ L에과 동일한. 상업적으로 보편적인 SYBR 녹색 DNA x 2 구입 중 합 효소 마스터-믹스 포함 모든 필요한 구성 요소 정량 반응에 대 한 즉, SYBR 녹색 나 염색, 핫 스타트 Taq DNA 중 합 효소, dNTPs, MgCl2 고 수동 참조 염료. 빛에서 SYBR 녹색 마스터 믹스를 보호 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정량 Pcr 스트립 튜브 또는 96 잘 접시 사용에서 정량 Pcr 기계와 호환으로 정량 마스터-믹스의 6 µ L을 분배.</li>
	<li>튜브 또는 96 잘 접시의 우물에 cDNA 템플릿, 컨트롤 또는 순차적으로 희석된 TiLV 표준의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 튜브를 닫거나 사용에서 정량 Pcr 기계에 대 한 호환 플레이트 커버 96 잘 접시를 봉인<ol>
<li>부드럽게 터치 하는 혼합 솔루션 및 정량 튜브 또는 96 잘 접시 모든 혈관의 바닥에 액체를 수집 하는 원심 분리기를 사용 하 여 스핀 정량 튜브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실시간 열 cycler에 튜브 또는 접시를 놓습니다.<ol>
<li>95 ° C의 40 주기 다음 3 분 동안 95 ° C에서 초기 변성을 수행 하기 위해 정량 thermocycler 프로그램 10 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 뇌관 어 닐 링 및 신장, 녹는 곡선 단계 65 ° c 95 ° C를 0.5 ° C의 증가 함께 끝나는 s / 5 s입니다.</li>
		<li>SYBR fluorophore 염료로 다음 샘플 형식으로 알 수 없는 선택 선택한 샘플 이름 상자에 이름을 삽입 합니다.</li>
		<li>실시간 정량 Pcr 기계의 뚜껑을 열고 할당 된 우물에 정량 스트립을 놓습니다 다음 뚜껑을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택한 조건 실시간 정량 분석을 수행 합니다. 기계는 뚜껑 원하는 온도 도달 하면 실행을 시작 합니다. 반응의 진행 상황을 모니터링할 각 확장 단계 후에 각 샘플의 형광을 수집 합니다. 참고: 정량 Pcr 기계 및 관련된 소프트웨어 자동으로 분석 결과의 모든 매개 변수를 계산 하 고 실시간으로 증폭 곡선 표시, 표준 곡선과 용융 곡선은 정량 사이클의 끝에 생성 됩니다.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 데이터 분석 및 곡선 녹는 첫 함으로써 수집을 수행 하 고 표준은 amplicon에 대 한 예상된 온도에서 균일 한 피크를가지고.<ol>
<li>샘플의 증폭 곡선을 평가 하 고 표준 및 설정 영역에서 임계값은 cDNAs의 증폭 율은 모든 샘플에서 동일 했다. 이것은 일반적으로 소프트웨어에 의해 자동으로 수행 하지만 신중 하 게 검사 되어야 한다.</li>
		<li>표준 곡선을 사용 하 여 TiLV 사본의 수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

TiLV 이스라엘14 2014에 처음 알려졌다 고 그 이후로, 그것은 이집트, 콜롬비아, 인도, 말레이시아, 우간다, 탄자니아, 태국15,,1618, 를 포함 한 여러 나라에서 발견 되었습니다. 35 , 48. 세계 인식, 특히, tilapia 생산 국가에 더 많은 관심에 배치 바이러스 및 다양 한 제한 및 정부 기관에서 대책 시도 TiLV의 확산을 방지 하기 위해 구현 되었습니다. 여기, tilapia 조직, 샘플 수집, RNA 격리, cDNA 합성, PCR과 정량 분석 실험에서에서 TiLV 검색에 대 한 상세한 프로토콜 설명 되었습니다. 특정 토론을 보증 하는 경우 이러한 방법에 다양 한 측면을 확인 하 고 있습니다. TiLV는 물고기는 다양 한 크기9,12,,1415,49 와 지금까지 농장된 하이브리드 tilapia (o.를 포함 한 tilapia의 종에서 발견 되었습니다. 오 균 x niloticus)11,14, 나 일 틸 라 피아 (O. niloticus)9,10,,1415,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 와 붉은 틸 라 피아 (Oreochromis sp.)16,33,,4851, 뿐만 아니라 야생 나 일 틸 라 피아9,12, 블랙으로 tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, 오 균 과 T. simonis intermedia14 그리고 아주 최근에 TiLV 야생 잉어 (Barbonymus에서에서 확인 된 schwanenfeldii)52. 내부 장기 (길, 비장, 간, 심장, 머리 신장) 또는 점액37 에서 조직 샘플 나이, 크기 또는 종에 건강으로 죽어가는 tilapia에서 수집 하 고 RNA 격리에 대 한 처리 수 있습니다. 설명 된 총 RNA 추출 프로토콜 여기 chaotropic 변성 에이전트를은 페 놀 및 guanidinium 안산의 monophasic 솔루션을 사용 합니다. 조직에는 클로 프롬 및 위 수성 단계는 interphase, 낮은 유기 단계를 포함 하는 분명 RNA 생성 되는 어떤 점에서 단계 분리를 달성 하기 위해 원심 분리의 추가 의해 다음이 솔루션에 직접 무 균. RNA는 소 프로 파 놀 강 수, 오염 물질의 제거에 복구 된 RNA의 세척에 의해 다음에 의해 수성 단계에서 격리 됩니다. 이 방법론에 의해 RNA의 격리 Piotr Chomczynski와 니콜 Sacchi에 의해 개척 되었다 고 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출53,54로 불렸다. 사용할 RNA 추출 시 약의이 종류를 상업적으로 구입한 하 또는 실험실에서 수 있습니다 (자세한 내용은 재료의 표 참조). 이 프로토콜은 실리 카 기반 정화 등 열 기반 메서드는 보다 약간 이상 하지만 일반적으로, 더 비용 효과적 이며 더 많은 RNA를 생성.
이 프로토콜에서 RNA A260 값을 사용 하 여 측정 설명 했다 분 광 광도 학 값 RNA 품질을 나타낼 수 있다 그것에 의하여 (A260/A280 = 1.9-2.1). 이 메서드는 샘플 순도의 좋은 표시를 줄 것 이다, 하는 동안 그것은 절대적으로 추출 된 RNA의 품질에 대 한 알릴 수 없습니다. 제대로 되는지 확인 하려면 RNA 그대로 또는 부분적으로 저하, 샘플 수 점에서 18S 스테인드는 EtBr의 번짐 agarose 젤 전기 이동 법으로 분리 되며 28S rRNA 밴드 RNA 저하를 나타냅니다. RNA 품질의 더 검증 랩 온 칩 악기를 사용 하 여 포함할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 DNase와 순화 된 RNA를 소화 하는 것이 중요 오염 제거 하려면 호스트 게놈 DNA를 다운스트림 응용 프로그램에 따라 잘못 된 결과가 발생할 수 있습니다. RNA 추출 절차의 끝에 추가 DNaseI 처리를 수행할 수도 있습니다 경우 호스트 gDNA 여전히 대부분 RNA 샘플을 오염 이다, ( 재료의 표참조).
보완 DNA 합성 전체 정량 결과 크게 영향을 미칠 수 있습니다 하 고 변화를 발생 시킬 수 있는 방법의 한 측면 이다. 단일 구성 요소 설정의 구성 하 고 여기에 주 창 하는 cDNA 프로토콜 올리고 (dT)를 사용 하 고 따라서만 polyA 꼬리를 포함 하는 mRNAs를 transcribes. 그것은 정확 하 게 반전 녹음 방송 반응 및 cDNA의이 모드에서 사용 하는 구성 요소의 합성은 성공적으로 입증 TiLV 탐지32에 대 한 사용자 정의 컨트롤을 수 있습니다. 이 설정 대신 포함 하는 상업적으로 구입 마스터 믹스 반전 녹음 방송 반응에 필요한 모든 구성 요소 이며 매우 신속 하 고 일반적인 다단계, pipetting 및 멀티 온도 프로토콜 없이 간단. 그것은 처리를 최소화 하 고 모든 샘플에서 균일성을 촉진 하기 때문에 이것은 유리입니다. 같은 마스터-믹스 자주 등 모두 oligo(dT) 인구에 RNAs의 전체 길이에서 시퀀스의 대표적인 cDNA 복사본을 생성 하는 다른 적용 가능한 RNA 서식 파일을 만드는 무작위 뇌관 (바이러스 및 tilapia mRNA 호스트)와 이론, 모든 원하는 RNA 종 다음 기존의 PCR 또는 이러한 샘플에서 정량으로 측정할 수 있습니다. 이 다양성은 주요 활용 2 단계 RT-PCR 접근; 그것은 많은 다른 실험에 사용할 수 있는 장기 수영장을 제공 합니다. 결과에 원스텝 RT-PCR 접근 표현 하고있다 어떤 점에서 시퀀스 특정 뇌관 (표 1) 사용 되 고 고 RT PCR 한 튜브에서 수행 했다 (소재 목록 참조). 일반적으로, 순서 특정 한 뇌관 임의의 뇌관을 사용 하 여 보다 구체적인 대상 RNA의 높은 RT 효율성에 대 한 허용 하지만 특정 대상 RNA는 유일 하 게 같은 cDNA 샘플 ( 를 참조 하는 특정 실험실의 유일한 목적은 될 수 있는 양이 정해질 수 있는 자료의 테이블 cDNA 합성 제품 제안을 위해).
그러나 기존의 RT-PCR 나타납니다 일반적으로 사용 되는 TiLV 진단9,13,14,15,,1617,18, 에서 지금까지 33 , 35 , 48 , 55. 실시간 정량 검출 및 정량화 물고기 조직 또는 점액32,37TiLV의 작은 금액에 대 한 더 강력한 도구에 표시 되었습니다. 일반적으로, 정량은 높은 감도, 특이성, 좋은 재현성, 넓은 동적 범위 및 속도21바이러스학 임상 진단 실험실에서 널리 이용 된다. 정량은 처음 기존의 RT-PCR 보다 구현 비용이 있을 수 있습니다, 그것은 많은 중요 한 이점을 기존의 PCR; 제공지 않습니다. 그것은 보다 빠른 설정-주위 시간 샘플에서 결과를 하 고 어떤 게시물-PCR는 단계를 필요 하지 않습니다. 이 후자의 포인트 실험실 오염에 대 한 최소한의 위험이 발생 시와 같은 높은 처리량 상황에 더 쉽게 적용할 수 있습니다 의미 합니다. 또한, 그것은 본질적으로 기존의 RT-PCR의 중요 한 하위 임상 감염21낮은 바이러스 부하를 감지 하는 보다 더 민감한. 이것은 중첩 된 PCR 방법은 반전 녹음 방송 필요로 해야, 두 개의 추가 PCR 반응 그리고 분석 agarose 젤 전기 이동 법. 이러한 많은 단계 시간을 많이 하 고 오류 또는 오염의 기회를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 그것의 높은 감도 때문에 실시간 정량 세심 한 실험 설계 및 정확한 결과56,57를 생성 하기 위한 정량화 기법에 대 한 철저 한 이해를 요구 한다.
DNA 바인딩 fluorophore, SYBR 녹색 내가이 프로토콜에서 입증 되었습니다. 난다 DNA 바인딩 dsDNA 염료 이며 따라서 분석 결과의 특이성 뇌관, 가양성58를 생성할 수 있습니다 집합에 완전히 거짓말. 따라서, 녹는 곡선 분석 끝에 각 PCR 수행 dsDNA PCR 반응의 특히 중요 한 부분 이므로 그 하나만 PCR amplicon 올바른 T의 확인 하는 동안m 생산 (이 또한 의해 달성 되어야 젤 전기 이동 법 새로운 분석 구현 되는 경우). DNA 파편의 Tm 다양 한 길이, GC 구성, 시퀀스, 스트랜드 complementarity 기능에 따라 달라 집니다, 그리고에 뿐만 아니라 집중 버퍼 구성 요소 및 PCR 강화. 실험실 뇌관 이합체 또는 다른 원치 않는 PCR 제품의 존재를 공개 하지 않았다 그러나 경우이 다른 샘플 및 실험적인 체제과 관찰, 분석 결과 이어야 한다 2에서 표시 된 대표 결과에 녹는 곡선 분석 다시 최적화. 고급 정량 기술 같은 녹는 곡선 단계를 필요로 하지 않는 하 고 실제로, 종이 작성 되었습니다이 방법을 기반으로 TaqMan부터 TiLV RT-정량 개발 되었습니다 2 개의 뇌관 및 높은 TiLV 특정34만들기 검색을 활용 하 여.
의심의 여지가, 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 위한 뇌관 분석 결과의 성공에 필수적 이며 여기에 뇌관32시간 공개적으로 사용 가능한 TiLV 게놈 데이터에 따라 설계 되었습니다. 그러나, RNA 바이러스는 잘 알려진 높은 돌연변이 비율을 전시 하 고 가능한 긴장 ISAV59에 대 한 관찰로 현재 진단 테스트를 탈출 한다. 그것은 어려울 것 이다 항상 보편적인 팬-TiLV RT 생성 하와 같은 바이러스 종류-정량 분석 결과 같은 분석 실험만 지속적으로 향상 됩니다 광범위 한 위치 및 시간 기간에서 더 많은 TiLV 게놈 데이터를 사용할 수 있게 하는 경우.
마지막으로, 중복 실행 또는 가능 하다 면, 둘 다 내부에서 반응 triplicate 인터 정량 분석 실험을 필수적 이다. Ct 값이 매우 높은 경우, 복제의 사용은 특히 PCR 반응 안정적이 고 재현 가능한가 확인 하는 것이 중요. 일반적으로 데이터를 복제 하는 경우 반응 다릅니다 이상 0.5 사이클, 반응과 반복 해야 경우 Ct 값 > 0.5 사이클에서 일관 되 게 복제, 분석 결과 다시 최적화 해야 합니다. 통합된 정량 pipetting 로봇의 사용은 대단히이 문제와 도움이 됩니다 하지만 그것은 고급 도구입니다. 어떤 실험을 포함 한 적절 하 고 적절 한 컨트롤으로 이러한 분석 실험 인가 해야 진단 실험실에서 특히 강력한 분자 분석 실험의 발달에 매우 중요입니다. 컨트롤 내 생 tilapia 하우스키핑 유전자의 검출 뿐만 아니라 포지티브 (긍정적인 TiLV 샘플, 표준 TiLV 플라스 미드)와 부정적인 컨트롤 (NTC와-RT) 샘플을 포함 해야 합니다. 이러한 통제 과소평가 될 수 없다 고 제대로 각 단계 분석 결과의 품질을 이해 하 고 제대로 결과 해석 하는 각 분석 결과에 포함 되어야 합니다.

글로벌 1 인당 물고기 공급 2014 년에서 20 kg의 새로운 기록을 도달 하 고 이것은 양식 업에 활발 한 성장 때문. 양식 전세계 급성장 동물 식품 생산 부문 중 하나 이며 인구1보다 더 빨리 성장 하 고 유일한 동물 식품 생산 부문. Tilapiine cichilds 6.4 백만 톤 (MT)의 총 세계 생산 및 201529.8 십억 미국 달러의 추정된 가치 전세계 농장 2 차로 가장 중요 한 민물 생선으로 구성 됩니다. Tilapia의 톱 10 생산자는 중국 (1.78 MT), 인도네시아 (1.12 MT)와 이집트 (0.88 MT), 방글라데시, 베트남, 필리핀, 브라질, 태국, 콜롬비아, 우간다2뒤. 글로벌 tilapia 생산 약 7.3 될 것으로 예상 된다 20303몬태나. 뿐만 아니라 단백질4 의 저렴 한 소스 뿐만 아니라 때문에 그들은 물과 기후 조건5,6의 다양 한 범위에서 용량에 번 식 하기 쉽기 때문에 tilapia 같은 중요 한 글로벌 식품 소스 되고있다. 그냥 몇 년 전, 몇 가지 상업적으로 중요 한 질병 tilapia 농업을 위협 했지만이 사실이 더 이상 믿어 졌다. Tilapia 호수 바이러스 질환 (TiLVD) 이라고 하는 신흥 바이러스 성 질병은 첫번째 이제까지 중요 한 질병 전염병 tilapia에서 발견 하 고 전체 산업은 위험에. 이 질병은 심각한 사회 경제적 결과 이며 아시아와 남미 아프리카7, 사람들의 수백만 위한 식량 안보에 직접적인 위협. 2018의 시작, 동물 건강 (OIE)에 대 한 세계 기구 보고 8 국가8 를 다루는 3 개의 대륙에 그리고이 병원 체 정보 카드는 TiLV,이 질병의 etiological 대리인 공식적으로 발견 되었습니다 했다 거기 업데이트 우간다9, 인도네시아10, 대만11 및 페루12탄자니아에 TiLV의 더 보고 되었습니다. TiLV은 다양 한 연상 독감 이나 전염 성 연어 빈혈증 바이러스 (ISAV)13등 다른 orthomyoxoviruses 특성을 포함 하기 때문에 orthomyxo 같은 바이러스를 되도록 설명 소설 단일 가닥 RNA 바이러스. 그것은 먼저 갈릴리 호수, 이스라엘14야생 및 농장 tilapia의 대규모 손실의 여파에 확인 되었다. 그 후, 비슷한 질병 발생 추천 여름 mortalities 및 TiLV 감염 연관 사망률 증후군 나 일 틸 라 피아 (Oreochromis niloticus) 이집트15 에 나 일에 빨간색 하이브리드 tilapia 보도 했다 한 달 (Oreochromis 종) 태국16, 각각. 수생 동물 바이러스의 검출은 역사적으로 성장 및 세포 배양에서 바이러스의 분리에 의해 수행 됩니다. 다양 한 셀 라인 전파 및 TiLV 포함, E-11 셀 독 사 물고기 (Ophiocephalus striatus)17,18에서 파생 된 OmB Oreochromis 에서 발생 하는 TmB의 격리에 대 한 테스트 mossambicus18, OnlB 및 OnlL 나 일 틸 라 피아 (O. niloticus)19에서 발생. 바이러스 문화는 추가 실험에 대 한 자료를 제공 한다는 이점이 있다, 그러나 그것은 cytopathic 효과 (CPE)의 형성을 관찰 하기 위해 적어도 4-7 일을 요구 하 고 결정적인 다른 시세 바이러스는 더 적합 하는 단점이 있다 복제는 전파 될 수 있습니다 하 고 유사한 CPE 생산.
지난 몇 십년에 세포 배양, 혈 청 학 및 항 원 탐지 및 신속 하 고 더 민감한 핵 산 기반 탐지 테스트20, 교체 등 전통, 수시로 시간이 걸리는 진단 방법 멀리 이동이 되었습니다. 21. 이것은 많은 정량 분석 실험 개발 되었습니다 다양 한 수생 동물의 바이러스 성 질병에 대 한 중요 한 진단 방법으로와 같은 ISAV22,23, 바이러스 haemorrhagic septicaemia 바이러스 (VHSV)24에 대 한 사실에 의해 분명 하다 ,25, betanodavirus26,27 salmonid alphavirus28, 물고기 iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30및 Lymphocystis 질병 바이러스 (LCDV)31 . 진단 및 병원 체 감시에 대 한 강력한 방법 긴급 TiLV의 확산을 줄일 필요가 있습니다. 이러한 방법을 임상 증상을 개발 하기 전에 감염의 조기 발견 및 낮은 바이러스 부하의 검출을 허용 해야 합니다. 날짜 하려면, RT-PCR14,32를 포함 하 여 다른 PCR 프로토콜 중첩된 RT-PCR18, 세미 중첩된 RT-PCR33, 그리고 실시간 정량32,34 개발 되었습니다 TiLV의 검출에 대 한 물고기의 조직에서 TiLV 검색 취약 셀 라인에서 실시간 정량 및 바이러스 격리의 비교 계시 실시간 정량 바이러스 격리32보다 1000 배 더 과민 했다. 각 게시 된 PCR 프로토콜은 TiLV의 검출을 위한 다른 감도 보고, 대부분 분석 매우 민감한 7.5 복사본33, 7 복사본18 또는 당 2 부32 바이러스의 검출 한계는 반응입니다.
이 방법 문서의 목표는, 자세히, tilapia 조직 컬렉션, 총 RNA 추출, cDNA 합성 시작 TiLV 탐지 분석 실험을 수행 하는 방법을 설명 하 고 TiLV 특정 PCR 분석 실험을 기반으로. 특히, 기존의 RT-PCR와 또한 SYBR 녹색 기반 실시간 정량의 포괄적인 프로토콜 TiLV를 감지 하는 것을 목표로 하는 과학자의 넓은 범위에 호소를 설명 있다. 전 덜 민감 하지만 일반적으로 더 싼 검색 옵션. 후자 정량 PCR 기계 등 더 비싼 시 약, 더 정교한 인프라를 필요로 하지만 그것은 양적, 신속 하 고 매우 중요 한, 그것은 사용할 수 있는 TiLV에서의 검출에 대 한 하위 임상 의미의 이점이 있다 물고기를 감염. RT-PCR 및 RT-정량 Pcr 프로토콜 TiLV 및 포함된 결과 강조 감도의 명료한 지리적 격리와 여기에서 설명 하는 분석 실험의 재현성 두 다른 실험실에서 수행 했다.

<table><tbody><tr><td>조직 수집</td><td></td><td></td><td>Step 1</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>클로브 오일의 대안.&nbsp; Step 1.1</td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 솔루션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; AM7020</td><td>즉시 처리할 수 없는 경우 조직을 보관하기 위해 단계 1.3</td></tr><tr><td><강한>RNA 추출</강한></td><td></td><td></td><td>단계 2</td></tr><tr><td>TRI시약</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td>Step 2.1</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>15596026</td><td>Step 2.1</td></tr><tr><td>GENEzol</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td>Step 2.1</td></tr><tr><td>Trisure</td><td>Bioline</td><td>BIO-38032</td><td>Step 2.1</td></tr><tr><td>Homemade solution</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L&nbsp; (400 mM) 암모늄 티오시아네이트 8.20 g/L&nbsp; (100 mM) 아세트산 나트륨 380 mL/L&nbsp; (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-퀴놀리놀, pH 5.0 4oC 에서 최대 2년 동안 보관 Step 2.1</td></tr><tr><td>MagNA Lyser Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td>아래에 자세히 설명된 조직 용해 기계와 함께 사용되는 대체 조직 균질화 방법 단계 2.2</td></tr><tr><td>용해 매트릭스 D, 2 mL 튜브</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116913050</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2432</td><td>단계 2.3</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>RCI Labscan</td><td>AR1027E-G2.5L</td><td>단계 2.3</td></tr><tr><td>1-브로모-3-클로로프로판</td><td>시그마-알드리치</td><td>B9673</td><td>클로로포름 단계 2.3</td></tr><tr><td>이소프로판올(GC) &ge; 99.8 %</td><td>시그마-알드리치</td><td>59300</td><td>단계 2.6</td></tr><tr><td>이소프로판올 (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.09634.2500</td><td>Step 2.6</td></tr><tr><td>글리코겐, 분자 생물학 등급 (예 : Sigma, cat. no. G1767)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td><td>R0551</td><td>RNA 침전을 최대화하기 위해 조직 시작 물질이 작은 경우 유용한 단계 선택적</td></tr><tr><td>에탄올 (순도 (GC) &ge; 99.9 %</td> <td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td> <td>1.00983</td><td>2.9 단계</td></tr><tr><td>에탄올 (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td><td>Merck (EMSURE)</td><td>1.00983.2500</td><td>단계 2.9</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td>단계 2.13</td></tr><tr><td>핵분해효소가 없는 물</td><td>Multicell</td><td>809-115-CL</td><td>단계 2.13</td></tr><tr><td>Ambion TURBO DNA가 없는 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM1907</td><td>RNA 추출 프로토콜의 끝에서 수행할 수 있습니다 optional</td></tr><tr><td>cDNA 합성</td><td></td><td></td><td>Step 4</td></tr><tr><td>Viva cDNA Synthesis Kit</td><td>Vivantis</td><td>cDSK01</td><td>Step 4.1 & 4.3</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td><td>Toyobo</td><td>A1172K</td><td>대안 옵션&nbsp; 토론 보기</td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td>대체 옵션&nbsp; AffinityScript</td></tr><tr><td>다중 온도 역 전사 효소 토론 참조&nbsp;</td><td>애질런트 테크놀로지</td><td>스 600107</td><td>대안&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR</td><td></td><td></td><td>단계 5</td></tr><tr><td>DNA 중합효소 시스템:</td><td></td><td></td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - 플래티넘 II 핫스타트 그린 PCR 마스터 믹스 (2X)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific(인비트로젠)&nbsp;</td><td>14001012a</td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - GoTaq Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>별도 PCR 혼합물 성분:</td><td></td><td></td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>10mM dNTP Mix</td><td>Vivantis</td><td>NP2409</td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>25mM MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td>Step 5.2</td></tr><tr><td>KCl을 사용한 10X Taq 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00348114</td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Vivantis</td><td>PL1202</td><td>단계 5.2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AB1454</td><td>그림 3B</td></tr><tr><td>Gel 전기영동:</td><td></td><td></td><td>5.1-5.4단계에서 PCR 산물의 시각화를 위해</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide 용액 (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17898</td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td><td></td><td></td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - Tris</td><td>Vivantis</td><td>PR0612-1KG</td><td>단계 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - 아세트산(빙차) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td><td>Merck KGaA (EMSURE)</td><td>1.00063.2500</td><td>단계 5.5</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; - 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0729</td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td></td><td>Agarose Vivantis</td><td>PC0701-100G</td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td>DNA ladders and markers</td><td>Vivantis</td><td>NL1405</td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td>DNA gel loading dye (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Step 5.5</td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td>Step 6</td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A25779</td><td>예시: 그림 4-6B 단계 6.2</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>1725120 비디오 및 그림 4-6A에서 예시됨 단계 6.2</td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기 유봉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1110</td><td>프로토콜 2</td></tr><tr><td>MagNA Lyser 기기</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td>위에 설명된 용해 비드와 함께 사용되는 프로토콜 2에 대한 대체 조직 균질화 옵션 단계 2.2</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>5427R</td><td>프로토콜 2 단계&nbsp; 2.4, 2.7 & 2.10</td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5418R</td><td></td></tr><tr><td>히트 박스</td><td>Labnet</td><td>AccuBlock 디지털 건조 배스</td><td>프로토콜 2 단계 2.13</td></tr><tr><td>마이크로볼륨 분광광도계&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>Nanodrop 2000</td><td>프로토콜 3 단계 3.1 - 3.4</td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>BIO-RAD</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td>프로토콜 5 단계 5.4</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>BIO-RAD</td><td>PowerPac HC</td><td>프로토콜 5 단계 5.5</td></tr><tr><td>수평 겔 전기영동</td><td>BIO-RAD</td><td>Mini ReadySub-Cell GT 세포 #1704487edu</td><td>프로토콜 5 단계 5.5</td></tr><tr><td>미니 마이크로원심분리기</td><td>Corning</td><td>LSE 6766</td><td>프로토콜 4, 5 & 6 단계에서 PCR 반응 튜브를 빠르게 스핀다운하는 데 유용 6.5.1</td></tr><tr><td>마이크로원심분리기</td><td>LioFuge</td><td>LM-60</td><td>Step 6.5.1</td></tr><tr><td>qPCR 기계 및 소프트웨어</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td><td>Protocol 6 Step 6.6-6.8</td></tr><tr><td>qPCR machine and 소프트웨어</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX96 CFX Manager 소프트웨어가 있는 터치 실시간 PCR 검출 시스템</td><강력한>일반 재료&nbsp;<td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo 가위</td><td></td><td></td><td>단계 1.1-1.2</td></tr><tr><td>겸자</td><td></td><td></td><td>단계 1.1-1.2</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Rainin</td><td>Pipette-Lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 장벽 피펫 팁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z333328, Z333336, Z333344</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 rt-pcr 및 sybr의 탐지 rt 정량 그린

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

이 방법의 목표 tilapia 조직에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)의 빠르고, 과민 하 고 특정 검색을 용이 하 게 하는 것입니다. 이 프로토콜의 일부로 감시 프로그램, 생물 측정 그리고 TiLV 기초 연구 실험실에서 사용할 수 있습니다. 바이러스 진단의 황금 표준 일반적으로 바이러스 격리를 리버스 전사 연쇄 반응 (RT-PCR) 추가 확인 등 보완 기술 다음을 포함 한다. 이 성가신, 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 하며 일반적으로 무 겁 게 바이러스에 감염 된 조직 샘플. RT-양적 (q) PCR 바이러스의 검출에의 사용 그것의 양적 성격, 높은 감도, 특이성, 확장성 및 결과에 그것의 급속 한 시간 때문에 유리 하다. PCR의 전체 방법 탐지는 tilapia 기관 단면, 총 ribonucleic 산 (RNA) 추출에서 guanidium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션, RNA 정량화, 뒤에 2 단계 PCR를 사용 하 여 설명 하는 TiLV에 대 한 접근을 기반으로 여기, 프로토콜을 수 반하는, 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA) 합성 및 기존의 PCR 또는 양적 식별을 통해 정량 SYBR 녹색을 사용 하 여 TiLV의 감지 나 염료. 기존의 PCR PCR 게시물 단계 필요 하 고 단순히 바이러스의 존재에 대해 알릴 것 이다. 후자의 접근 방식을 조금 2 부 다운 TiLV의 절대 정량화에 대 한 고 따라서 하위 임상의 경우에서 TiLV 진단에 매우 유용. 두 개의 PCR 방법, 2 개의 실험실에서 대표 결과 대 한 자세한 설명 및 둘 다의 중요 한 매개 변수에 대 한 철저 한 토론 연구자와 diagnosticians 그들의 가장 적합 하 고 해당 찾을 수 있도록 포함 되었습니다. TiLV 검출의 방법입니다.

이 프로토콜 tilapia 조직 RT PCR 방법론을 사용 하 여에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)를 진단 한다. 전체 메서드 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 기존의 PCR 또는 양이 많은 PCR dsDNA 염료를 형광 바인딩 바인딩을 사용 하 여 TiLV의 탐지를 조직 해 부에서 설명 되어 있습니다.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

모두를 환영합니다. 내 이름은 승리 수라체퐁입니다. 저는 태국 카셋스타트 대학의 수의학 및 면역학 학부 조교수입니다.저와 제 팀은 틸라피아에서 새로운 바이러스 성 질병을 전문으로하고 있습니다. 우리는 지금 틸라피아에서 높은 사망을 일으키는 틸라피아 호수 바이러스에 일하고 있습니다. 틸라피아는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 어종이기 때문에 백만 명에게 단백질 공급원을 제공하고 식량 안보에 중요한 역할을 합니다.그래서 틸라피아 호수 바이러스의 최근 발발은 많은 과학자들이이 문제에 대한 해결책을 찾기 위해 노력하도록 유도 사회 경제적 영향을 야기. 지금까지 우리는 바이러스를 검출하기 위해 매우 민감하고 빠르며 정확한 방법이 필요합니다. 이 비디오에서는 샘플 수집, 샘플 인구 및 실시간 PCR 분석에서 시작하여 물고기 조직에서 틸라피아 호수 바이러스를 감지하는 단계별로 보여줍니다.첫째, 물고기를 안락사시키기 위해 물에 천 오일의 과다 복용을 용해합니다. 죽은 물고기를 트레이에 놓고 95%에탄올을 사용하여 장비를 소독한 다음 알코올 버너로 태워버로 태워버를 타십시오. 천천히 간을 수집하기 위해, 위쪽으로 낮은 복부에서 물고기를 엽니 다 잘라.간 부분을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집합니다. RNA 추출의 첫 번째 부분은 라미나르 플로우 후드에서 수행되어야하며 보호 장비를 착용해야합니다. RNA 추출 시약 1밀리리터를 튜브에 넣습니다.조직 페일을 사용하여 간을 균질성으로 분쇄합니다. 튜브에 200 마이크로리터의 클로로폼을 넣습니다. 그런 다음 튜브를 여러 번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.실온에서 3분간 따로 둡니다. 12, 000 RCF에서 섭씨 4도에서 원심분리기는 15분 동안. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 수집합니다.무색 위 수성 상의 500 마이크로리터를 새로운 튜브로 부드럽게 옮기십시오. 튜브에 이소프로판놀 의 한 볼륨을 추가합니다. RNA를 침전시키기 위해 2 시간 또는 하룻밤까지 영하 20도에서 가열하십시오.인큐베이션 후 동일한 원심분리기 상태에서 용액을 원심분리합니다. 원심분리기에서 튜브를 수집한 다음 상체를 폐기하십시오. RNA 펠릿은 화살표에 의해 뾰족한 것으로 볼 수 있다.RNA 펠릿을 세척하고 여러 번 반전하기 위해 튜브에 75 %의 에탄올 1 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 4도, 10, 000 RCF에서 15분 동안 원심분리기. 원심분리기에서 튜브를 수집한 다음 상체를 폐기하십시오.자동 파이프를 사용하여 남은 에탄올을 꺼내고 실온에서 5~10분 동안 공기 건조를 드립니다. RNA 펠릿을 용해시키기 위해 섭씨 55~60도까지 미리 데워진 30~60마이크로리터 RNase 프리 워터를 추가합니다. RNA 용액의 1~ 2마이크로리터를 사용하여 마이크로 볼륨 분광계를 사용하여 농도를 측정합니다.결과는 화면에 표시됩니다. RNase 무료 물을 사용하여 마이크로리터 당 200 나노그램으로 농도를 희석시킵니다. 다음과 같이 나열된 화학 물질 및 조건을 사용하여 cDNA 합성을 수행하십시오.열순환기를 사용하여 RNA를 제안된 조건으로 cDNA로 변환합니다. 다음은 실시간 PCR을 사용하여 TiLV 부하를 결정하는 데 사용되는 화학 물질 및 조건입니다. qPCR 마스터 믹스6밀리리터를 흰색 qPCR 스트립 튜브의 각 바이알에 분배합니다.그 후, cDNA 샘플의 4밀리리터가 우물에 적재된다. 이 단계에서 는 샘플에서 샘플로의 오염을 피하기 위해 모든 우물에서 새 파이프 팁을 변경해야합니다. 투명 qPCR 스트립 캡으로 qPCR 스트립을 단단히 밀봉하십시오.스트립 끝에서 가볍게 움직여 용액을 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 마이크로 원심 분리기를 사용하여 아래로 회전하여 혈관 의 바닥에있는 모든 액체를 수집합니다. 비디오에 표시된 대로 두 단계 조건을 사용하여 사용할 96 웰 플레이트에서 우물을 선택합니다.염료를 위한 식물로 사이버 녹색을 선택합니다. 알 수 없는 것을 샘플 유형으로 선택하고 샘플 이름 상자에 이름을 삽입합니다. 실시간 PCR 기계의 뚜껑을 열고 qPCR 스트립을 할당된 양에 배치합니다.그런 다음 뚜껑을 닫습니다. 선택한 조건으로 컴퓨터를 실행합니다. 뚜껑이 원하는 온도에 도달한 후 기기가 시작하고 실행됩니다.qPCR 조건이 끝나면 증폭 곡선이 표시됩니다. 여기서 속도 화살표는 임계값 수준이 지수 단계와 선형 단계 사이에 끊어지는 위치를 지적하여 CT 값을 생성합니다. 그런 다음 CT 값을 바이러스 로그 카피 번호로 추정하여 표준 곡선을 사용하여 남아 있는 여러 바이러스를 계산합니다.녹는 피크는 또한 qPCR에 의해 검출된 바이러스가 실제로, 용융 피크가 일반적으로 섭씨 79.5도에서 80.5도 사이인 TiLV인지 여부를 확인하기 위하여 표시됩니다. 그래서 우리는이 방법이 제어를 구현하고 TiLV 감염의 확산을 제한 할 수 있습니다 전 세계의 농민과 조직에 대한 중요한 도구가 될 수 있기를 바랍니다.

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환경

이 비디오는 실시간 역전사 PCR을 사용하여 바이러스 감염을 감지하는 정량적 방법을 보여줍니다. 역전사 단계는 RNA를 cDNA로 변환한 다음 PCR 주기를 통해 증폭합니다. 샘플에 바이러스 RNA가 존재한다는 것은 PCR에서 얻은 DNA의 증폭 및 해리 곡선을 분석하여 확인합니다.

바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

반전 녹음 방송 (실시간 정량)와 함께 하는 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 분석은 RNA 바이러스 감염의 수준을 측정 하 널리 사용 되었습니다. 여기는 직접 실시간 정량 분석 결과, 뎅기열 바이러스를 포함 하 여 여러 RNA 바이러스의 정량화에 대 한 개발 하는 RNA 정화 단계를 필요 하지 않는 선물이.

실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 감염 된 세포의 문화 상쾌한에 뎅 그 열 바이러스 RNA를 측정

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

우리는 기존의 RT-PCR 기술에 비해 상대적으로 짧은 기간 동안 간단한 악기를 사용하여 틸라피아 물고기에서 TiLV의 검출을위한 RT-LAMP 분석법을 제시한다. 이 프로토콜은 특히 개발도상국에서 TiLVD의 전염병 확산을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

먹이에서 물고기를 먹는 물고기 폴리 염화 비 페닐 (PCB) 이성체의 순 영양 전달 효율의 실험실 추정하는 기술이 제시된다. 필드로 실험 결과의 적용 가능성을 극대화하기 위해 물고기를 먹는 물고기는 일반적으로 현장에서 먹을 수 있습니다 먹이 물고기를 공급해야한다.

호수 송어에 PCB의 동족체의 순 영양 전송 효율의 실험실 평가 (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) 먹이에서

레이크 부영양화 중요한 영양소 소스를 식별하고 제어 할 필요성을 만들어 전세계 수질 문제이다. 침전물 코어에서 인 방출 비율의 실험실 판정 내부 인 로딩의 역할을 결정하고 관리 결정을 안내하기위한 유용한 방법이다.

호수 퇴적물에서 실험실 결정 인 플럭스 내부 인 로딩의 측정으로

학습하세요 틸라피아 호수 바이러스(TiLV) 검출을 위한 RT-PCR 및 실시간 정량 PCR 방법을. 간 조직에서 RNA 추출 및 cDNA 합성 후 바이러스 정량 분석을 수행합니다. 이 프로토콜은 양어장 질병 관리와 식량 안보에 필수적인 신뢰할 수 있는 진단 도구를 제공합니다.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

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