Name: 물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 ddTRAP 분석법을 통해 디지털 중합효소 연쇄반응을 이용한 텔로머라스 활성 정량 측정 방법을 익히세요. 이 기술은 96개 샘플을 동시 처리하여 통계적 신뢰성을 높이고 암 연구에 활용됩니다.

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저자는 국립 보건부 (NIH)의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다 (R00-CA197672-01A1). 작은 세포 폐암 라인 (SHP77 및 H82)은 UT 사우스 웨스턴 메디컬 센터에서 존 미 나와 아디가 르 다에서 관대 한 선물 이었다.

1. 버퍼 준비 및 저장
<ol><li>1x 주식의 50 mL를 준비 rnase-무료 NP-40 용 해 완충 액 (10mm 트리 스-HCl [pH 8.0] 1 mm mgcl 2mm ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 1% 【 vol/vol 】 40, 진단을, 5mm×5mm β ・ 0.1 mm 4 ~ 10% 150 플 루 오 르 benzenesulfonyl 히드로 클로 라 이드 (AEBSF)). 이 버퍼는 향후 사용을 위해-20°c에서 저장 및 저장할 수 있습니다. 세포의 최적의 용 해를 얻기 위해 동결/동결 해제 주기를 피하십시오.</li>
	<li>10 배 스톡 50 mL를 준비 합니다 RNase-프리 트랩 확장 버퍼 (200 mM 트리 스-HCl [pH 8.0] 15mm MgCl2, 630 밀리미터 KCl, 0.5% [vol/Vol] 트윈 20 및 10mm 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르) n, n, n ', 네 스 트 라 아세트산 (egta)). 이 완충 액은 1 mL의 알리 쿠 트에 들어 있으며 추후 사용을 위해-20°c에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포 용 해
<ol><li>
세포의 제조
	<ol>
<li>NP-40 용 해 완충 액의 냉동 분 취를 해 동. 동결 된 후, 얼음에 용 해 완충 액을 놓습니다. NP-40 용 해 완충 액에 phenylmethylsulfonyl 불 화물 (PMSF 프로 테아 제 억제제)을 첨가 하 여 0.2 mM의 최종 농도에 도달 한다. 참고: 이것은 세포를 일차 직전에 수행 해야 합니다.</li>
		<li>수집 된 셀 펠 릿에서 여분의 액체를 제거 하 여 건조 세포 펠 렛을 확인 합니다. 셀 펠 릿은 갓 수집 했거나 이전에 냉동 (-80 ° c 또는 액체 N2에서 냉동 한경우)에는 이러한 솔루션이 다운스트림 절차를 방해할 수 있으므로 이전 원심 분리에서 남은 솔루션을 포함 하지 않아야 합니다.</li>
		<li>양성 및 음성 대조로 사용 하기 위해 텔로 및 텔로 세포 주 (BJ 섬유 아 세포, IMR-90 또는 U2OS) 모두를 성장, 수집 및 동결 합니다. 분석을 수행할 때마다 새로운 제어 용 해물을 사용 하 여 검사 재현성을 보장 합니다. 주: 텔로 세포의 큰 배양이 성장 하 고 동결 이전에 인용 되는 것은 세포 주의 장기 배양 중에 도입 될 수 있는 임의의 조직 배양 관련 아티팩트를 제거 하 여 재현 가능한 결과를 보장 하도록 하는 것이 좋다 음성 대조 군 샘플.</li>
		<li>얼음에 셀 펠 릿을 놓습니다. 세포가 동결 된 경우, 얼음에 잠시 해 동 할 수 있습니다. 참고: ddTRAP에 대 한 일반적인 셀 펠 릿 크기는 50만과 100만 셀 사이입니다. 더 작은 세포 펠 릿은 또한 필요 하다 면 사용 될 수 있지만, 세포 수는/이상적으로 알고 있어야 합니다. DdTRAP은 BCA 단백질 분석을 사용 하는 단백질 입력에 기초 하 여 수행 될 수도 있습니다 (일반적으로 입력은 1 µ g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포의 lysing
	<ol>
<li>NP-40 용 해 완충 액에서 세포를 분해 한다. 25000 셀/µ L의 버퍼의 셀 동등성을 유지 합니다. 예를 들어 40 µ의 NP-40 용 해 완충 액에서 100만 세포를 함유 하는 펠 렛을 lyse. 세포를 열기 위해 분해 하기 위해 분해 물을 부드럽게 삐. 거품을 하지 않도록 하십시오.</li>
		<li>세포가 얼음에 30 분간 분해 되도록 하십시오. 세포 파편의 다발이 형성 되는 것을 막기 위하여 용 해물에 부드럽게 소용돌이를 확인 하십시오. 이것은 10 분 마다 수행 될 수 있고 파쇄 물이 균질 화 된 혼합물을 유지 하는 것을 의미 한다.</li>
		<li>세포 용 해물 (25000 세포/µ L) 1:20을 NP-40 용 해 완충 액에 희석 하 여 새로운 세포 동등성 1250 세포/µ L을 제조 하였다. 예를 들어, 세포 용 해물 5 µ L을 용 해 완충 액의 95 µ L에 희석 시킨다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 텔로 확장 반응
<ol><li>텔로 확장 반응 (반응 당)을 위한 마스터 믹스 (표 1)를 준비 한다. 참고: 세포 용 해 동안 확장 반응 마스터 믹스를 준비 하 고 얼음에 저장 하는 것이 가장 좋습니다.<ol>
<li>확장 마스터의 pipet 48 µ L은 각 PCR 튜브에 혼합 됩니다.</li>
		<li>희석 된 (1250 세포/µ L) 파쇄 물의 2 µ L을 확장 반응에 첨가 한다. 총 볼륨은 이제 50 µ L 50 셀/µ L의 최종 셀 동등성을 가져야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>텔로 확장 반응을 수행 한다 (표 2).</li>
	<li>텔로 연장 제품을 최대 3 ~ 5 일 동안 4°c에 보관 하십시오. 그러나 처음 24 시간 내에 확장 제품을 사용 하는 것이 최적 입니다.</li>
</ol>4. 액 적 디지털 PCR 설정
<ol><li>DdTRAP (반응 당)에 대 한 마스터 믹스 (표 3)를 준비 합니다. 참고: 시 약이 실 온에 있으면 그들 또는 마스터 믹스를 얼음 위에 두지 마십시오. 얼음에 믹스를 배치 하면 점도가 증가 하 고 불량 한 방울 형성으로 이어질 수 있습니다. DdPCR 수퍼 믹스의 DNA 중 합 효소는 뜨거운 시작 이며 실 온에서 안정적 이어야 합니다. 상기 ddPCR 슈퍼 믹스는-20°c에서 초기 해 동 후 4°c에서 보관할 수 있다.<ol>
<li>Pet 19.8의 ddPCR 마스터의 µ L을 각 PCR 튜브에 섞어 줍니다.</li>
		<li>각 튜브에 확장 반응의 2.2 µ L을 추가 합니다. 총 볼륨이 이제 22 µ L이 되어야 한다는 점에 유의 하십시오. 참고: ddTRAP에 필요한 총 샘플 양은 20 µ L (셀 동등성 100 셀)입니다. 추가 볼륨은 pipet 오류 또는 샘플 손실에 대 한 예방 조치입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액 적 생성 카트리지를 설치 합니다. 참고: 카트리지에 레이블이 지정 된 세 개의 다른 웰 열이 포함 되어 있습니다.<ol>
<li>Μ 단계 4.1.2에 따라 제조 된 반응의 20 리터를 샘플 웰 (중 웰)을 카트리지에 로드 한다. 샘플을 파이 펫 팅 할 때 기포를 피하십시오. 참고: 거품이 있는 경우 카트리지의 측면을 가볍게 눌러 이러한 거품이 용액의 상단에 오게 합니다.</li>
		<li>부하 70 µ L 액 적 생성 오일의 오일에 잘 (왼쪽 잘). 참고: 오염을 방지 하기 위해 별도의 파이 펫 세트와 ddPCR 액 적 생성 단계에 대 한 팁을 엄격 하 게 사용 하십시오. 카트리지를 로드 하는 순서가 중요 합니다. 오일이 무 겁 고 미세 유체 챔버를 채우고 불량 한 액 적 형성으로 이어질 수 있으므로 샘플은 오일을 로딩 하기 전에 로드 해야 합니다. 실행할 수 있는 최소 샘플 수는 8 개입니다. 카트리지의 모든 웰은 빈 우물이 방울 발생기에서 방울 발생의 정지로 이어질 것으로 샘플과 함께 로드 해야 합니다. 카트리지 내에서 8 개의 웰을 모두 로드 하는 데 적합 한 샘플을 사용할 수 없는 경우 µ의 ddTRAP 마스터 믹스 20 개 (단계 4.1)를 나머지 카트리지에 로드할 수 있습니다.</li>
		<li>카트리지 끝까지 테더 링 하 여 가스 켓을 제자리에 고정 합니다. 참고: 가스 켓의 부족 또는 부적절 한 배치는 발전기가 방울을 생성 하는 것을 방지 합니다.</li>
		<li>적재 및 조립 된 카트리지를 액 적 발생기에 넣습니다. 참고: 카트리지는 발전기의 자석으로 인식 되므로 카트리지가 올바르게 배치 될 때 사용자에 게 알립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액 적이 생성 되 고 사이클이 완료 되 면 카트리지를 꺼냅니다 (~ 60~90s).<ol>
<li>카트리지에서 가스 켓을 부드럽게 제거 합니다. 새로 생성 된 물방울 (오른쪽)을 멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여 96-well PCR 플레이트에 넣습니다. 참고: 새로 생성 된 액 적 에멀젼의 대략적인 부피는 40-43 µ L 이어야 합니다.</li>
		<li>모든 샘플이 PCR 단계 동안 증발을 방지 하기 위해 96-웰 플레이트에 로드 되 면 알루미늄 호 일 PCR 격판덮개 물개를 가진 격판덮개를 열 밀봉 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>96-웰 플레이트를 써 모 사이 클론에 넣고 다음과 같은 PCR 반응을 수행 한다 (표 4). 참고: 온도 단계 사이의 모든 램프 속도는 반응을 제대로가 열 하기 위해 2.5 ° c/s로 설정 해야 합니다.</li>
</ol>5. 텔로 확장 제품의 검출
<ol><li>액 적 리더기에 96-웰 플레이트를 적재 합니다. 참고: A1 샘플이 홀더의 홀더와 일치 하도록 플레이트의 방향을 올바르게 지정 해야 합니다.<ol>
<li>드롭릿 판독기와 관련 된 소프트웨어를 엽니다. 첫 번째 우물 A1 을 두 번 클릭 하 여 샘플/우물 편집기 화면을 엽니다.</li>
		<li>실험 을 클릭 하 고 드롭다운 메뉴에서 ABS 를 선택 합니다. 참고: 실험 은 사용 되는 분석 법의 유형을 정의 합니다 (즉, 절대 정량화 또는 유전자 카피 수 분석). ABS 는 절대 정량화를 의미 합니다.</li>
		<li>QX200 ddPCR Evagreen 수퍼 믹스 를 선택 하 여 판독기가 올바른 검색 방법을 사용 하도록 합니다. 우물 편집기 화면의 오른쪽 아래에 있는 적용 을 클릭 하 여 강조 표시 된 모든 우물에 사용자 정의 설정을 저장 합니다. 참고: 수퍼 믹스 는 독자가 읽을 수 있는 PCR 혼합 및 검출 화학의 유형을 정의 합니다.</li>
		<li>샘플을 정의 하기 위해 소프트웨어의 우물 편집기 화면에서 대상을 클릭 합니다.</li>
		<li>대상 드롭다운 메뉴를 클릭 하 고 알 수없음, 참조또는 NTC (템플릿 없음 컨트롤) 중 하나를 선택 하 여 샘플 유형을 정의 합니다. 참고: 알 수 없는 실험 샘플을 참조 하 는 것은 알려진 텔로 활성의 제어 샘플이 될 수 있으며, NTC 는 오염 측면에서 분석 유효성의 결정을 위한 중요 한 제어 및 배경 신호.</li>
		<li>샘플 이름 섹션의 모든 샘플에 레이블을 지정 하 고 적용 을 클릭 하 여 강조 표시 된 우물이 적절 하 게 편집 되도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>판을 실행/읽기 위해 실행 을 클릭 합니다. 플레이트를 읽어야 하는 방향에 대해 컴퓨터에 알리는 메시지가 표시 되 면 실행 옵션 화면에서 열 또는 행 을 선택 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>개별 우물을 클릭 하 여 각 시료에 허용 되는 물방울 수를 결정 합니다. 개별 우물 또는 열/행 헤더를 두 번 클릭 하 여 샘플 데이터를 보고 분석 합니다. 참고: 특정 샘플의 분석을 진행할지 여부에 대 한 가장 중요 한 기준은 "허용 된 물방울"의 수입니다. DdTRAP의 경우, 1만 이상의 허용 액 적이 있는 샘플은 추가 분석에 유효 합니다. .Csv 테이블, .jpg 이미지, 히스토그램 등을 비롯 한 다양 한 형식으로 사용자에 게 데이터를 제공할 수 있습니다. Ddpcr11,13을 포함 하는 ddpcr 데이터의 심층 분석을 위한 많은 자원이 이용 가능 하다. 이러한 리소스는 임계값11,13 을 선택 하는 것부터 거짓 긍정 및 네거티브13을 식별 하는 샘플을 선택 하는 ddtrap 데이터 분석 가이드를 제공 하며 일반 문제 해결13.</li>
	<li>샘플 복제 및 NTC 샘플을 나타내는 우물을 강조 표시 합니다. (2.1.2 단계에서 위에 나열 된 대로) BJ 세포와 같은 NTC 또는 네거티브 제어 라인과 비교 하 여 샘플을 분석 합니다.<ol>
<li>화면 왼쪽 아래에 있는 임계값 설정 아이콘을 클릭 하 여 샘플에 대 한 임계값을 수동으로 설정 합니다. 각 개별 웰 또는 한 번에 여러 웰에 대 한 임계값을 설정 합니다 (권장). 참고: NTC에서 배경이 감지 되 면 다른 모든 샘플에서이를 빼서 신호를 ' 정규화 ' 하 고 참 긍정 신호만 분석 하도록 할 수 있습니다. NTC 값은 일반적으로 NP-40 용 해 완충 시스템을 위한 0.2-1 분자/µ L 범위에 있습니다. 다른 버퍼 시스템 및 구성 요소 (예: CHAPS 버퍼)를 테스트 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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텔로 활동의 측정은 암, telomere 생물학, 노화, 재생 의학 및 구조 기반 약물 설계를 포함 하 되이에 국한 되지 않는 과다 한 연구 주제에 매우 중요 합니다. 텔로 RNPs는 낮은 풍부, 조차 암 세포에서,이 효소의 탐지 그리고 연구 만들기 도전. 이 논문에서는 새로 개발 된 ddTRAP 분석에 대 한 단계별 절차를 설명 하 여 세포에서 텔로 활성을 견고 하 게 정량화 했습니다. 기존의 텔로 확장 반응과 ddPCR을 결합 하 여 폐암 세포에서 텔로 활성 (텔로 제품)을 정량적으로 검출할 수 있었습니다.
DdTRAP 분석은 함정 분석 법과 동일한 이론에 의존 합니다. 세포 용 해물은 효소 활성을 유지 하 고 이어서 "TS" 기질/프라이 머의 텔로 확장 반응을 수행 하기 위해 사용 되는 비 이온 성 세제 (NP-40) 용 해 완충 액에서 용 해물 세포에 의해 얻어진 다. DdTRAP의 참신 함은 PCR 이전에 방울의 형성에 의존 합니다. 샘플을 방울로 분할 하면 분석을 통해...

텔로 미 어는 선형 염색체의 말단에 있는 동적인 DNA 단백질 복합물입니다. 인간 말단 소 립은1번에서 12hexameric kilobases 사이의 길이에 따라 달라 지는 5 '-TTAGGGn 의 반복의 배열로 구성 된다. 말단 소 립을 유지 하는 ribonucleoprotein 효소 인 인간 텔로는, 헬 라 세포 용 해물 (암 세포 라인)에서 먼저 동정 되었다. 말단 소 립 및 텔로는 게놈 보호, 유전자 조절 및 암 세포 불멸3,5,6과 같은 생물학적 과정의 스펙트럼에서 중요 한 역할을 한다.
인간의 텔로는 주로 두 가지 주요 구성 요소, 즉 텔로 역 역전사 및 텔로 RNA (각각 hTERT 및 hTERC)로 구성 됩니다. 상기 단백질 서브 유닛 hTERT는, 텔로 효소의 촉매 활성 역 역전사 성분 이다. RNA 템플릿 hTERC는 말단 소 립을 연장 및/또는 유지 하기 위해 템플릿과 텔로을 제공 한다. 대부분의 인체 체세포 조직에는 검출 가능한 텔로 활동이 없습니다. 텔로의 부족과 함께 dna의 지체 가닥의 끝을 확장 하는 DNA 중 합 효소의 무 능력은 세포 분열의 매 라운드 후에 말단 소 립의 점진적 단축으로 이끌어 냅니다. 이 현상은 세포가 복제 적인 노 쇠의 상태를 입력 하는 결정적으로 단축 된 길이에 도달할 때까지 대부분의 체세포에 있는 telomere 단축으로 이끌어 냅니다. 세포 분열의 최대 횟수는 그것의 telomere 길이에 의해 결정 되 고 지속적인 세포 분할에이 블록은 발암에 진행을 방지 하는 것으로 생각 된다7. 암 세포는 telomere 유도 된 복제 노 광을 극복 하 고 그들의 말단 소 립을 유지 하기 위해 텔로를 이용 하 여 증식을 계속할 수 있다. 암의 약 90%는 텔로를 활성화 하 고, 암 탐지와 처리 둘 다에 있는 텔로 활동을 비판적으로 중요 하 게 합니다.
1990 년대에 있는 함정 분석의 발달은 텔로 효소의 필요한 성분의 식별 뿐만 아니라 정상과 암 모두의 광범위 한 세포 및 조직에서 텔로의 측정에 중요 한 역할을 했습니다. 본래의 젤 기반 PCR 분석 법은 방사선 학적으로 표지 된 DNA 기질을 사용 하 여 텔로 활성을 검출 합니다. 2006에서, 분석은 형광 표지 된 기판8,9를 사용 하 여 비 방사성 형태로 적응 되었다. 형광 표지 된 기질을 사용 하 여, 사용자는 정확한 여기 파장에 노출 하 여 젤에 밴드로 텔로 확장 제품을 시각화할 수 있었습니다. 트랩 분석의 민감도와 조 세포 용 해물에서 텔로 활성을 검출 하는 능력은이 분석을 텔로 활성 검출을 위해 가장 널리 사용 되는 방법으로 만들었다. 그러나, 함정 분석에는 한계가 있습니다. 이 분석은 젤 기반으로, 보통에서 고 처리량 연구에 필요한 복제를 수행 하는 것을 어렵게 만들고, 따라서 적절 한 통계 분석이 거의 이루어지지 않습니다. 더욱이, 겔 계 분석은 샘플 들 간의 텔로 활성에서의 두 배 차이 미만의 검출의 무 능력으로 인하여 신뢰성 있게 정량화 하기 어렵다. 이러한 두 가지 한계를 극복 하는 것은 환자 샘플 또는 약물 설계 연구에서 텔로 활성의 검출을 위한 임상 또는 산업 설정으로 이동 하는 트랩 등의 효소 활성 분석에 중요 하다.
디지털 PCR은 초기에 PCR의 지 수 및 아날로그 특성을 선형 및 디지털 분석 (10)으로 변환 하는 수단으로 1999에서 개발 되었다. 액 적 디지털 PCR (ddPCR)은 본래 디지털 PCR 방법론의 가장 최근의 혁신 이다. 액 적 디지털 PCR은 안정적이 고 균일 한 크기의 방울을 안정적으로 생성 하는 고급 미세 유체 및 수 중유 에멀젼 화학의 출현으로 탄생 했습니다. 겔 계 및 정량 PCR (qPCR)과는 달리, ddPCR은 투입 물질의 절대 정량화를 생성 한다. DdPCR의 핵심은 샘플을 방울로 분할 하 여 ~ 2만 개별 반응의 생성입니다. 종말 점 PCR 다음에, 액 적 독자는 각 물방울에 있는 형광의 존재 또는 부재를 계산 하 고, 크기 조정 하 고, 기록 하는 유 세포 미터와 같은 유행에 있는 각 방울을 검사 합니다 (즉, 각 물방울에 있는 PCR 앰 플 아이콘의 유무 또는 존재). 그런 다음 푸아송 분포를 사용 하 여 입력 분자는 총 물방울 수에 대 한 양의 물방울의 비율을 기준으로 추정 됩니다. 이 숫자는 각 PCR의 입력 분자 수의 추정치를 나타냅니다. 또한, ddPCR은 96-웰 플레이트에서 수행 되 고 분석 되어 사용자가 많은 샘플을 실행 하 고 적절 한 통계 분석을 위해 생물학적 및 기술적 복제를 수행할 수 있습니다. 이에 따라 ddPCR의 강력한 정량 및 적정 처리량 특성을 결합 하 여 Ddpcr 분석 (11)을 개발 하였다. 이 분석은 사용자가 생물학적 샘플11,12에서 절대 텔로 활성을 연구 하 고 견고 하 게 정량화 하도록 설계 되었습니다. DdTRAP의 민감도는 단일 셀 측정을 포함 하 여 제한적이 고 귀중 한 샘플 로부터 텔로 활성의 정량화를 가능 하 게 합니다. 또한, 사용자는 텔로 조작 및/또는 약물의 두 가지 변화 (~ 50% 차이) 미만의 절대적인 정량화를 통해 효과를 연구할 수 있습니다. DdTRAP은 현대 실험실 실험과 임상 설정의 디지털 및 높은 처리량 특성에 대 한 트랩 분석의 자연 스러운 진화입니다.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>RNAse/DNAse free</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td>RnAse/DNAse free</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td>RNAse/DNAse free</td></tr><tr><td>Surfact- Amps NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>100% 초순수 글리세롤</td><td>Invitrogen</td><td>15514011</td><td>RNAse/DNAse 프리</td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>분말</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>516732</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 H20</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>RNAse/DNAse 무함유</td></tr><tr><td>2.5mM dNTP mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R72501</td><td>각 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 2.5mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td>RNAse/DNAse 무함유</td></tr><tr><td>100% Tween-20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>50-255-956</td><td>RNAse/DNAse free</td></tr><tr><td>텔로머라제 기질(TS) 프라이머</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td>맞춤형 프라이머(HPLC 정제)</td><td>5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX</td></tr><tr><td>(리버스) 프라이머</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td>맞춤형 프라이머(HPLC 정제)</td><td>5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'</td></tr><tr><td>얇은 벽(250 ul) PCR 등급 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>스트립, 플레이트, 튜브 등</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>Twin-Tec 96 Well Plate</td><td>Fisher</td><td>Eppendorf 951020362</td><td></td></tr><tr><td>Piercable foil heat seal</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>액적 발생기 카트리지 (DG8)</td><td>Bio Rad</td><td>1863008</td><td></td></tr><tr><td>액적 발생기 오일</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>액적 발생기 개스킷</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>96-well Thermocycler T100</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 실러</td><td>, Bio Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 리더 및 Quantasoft 소프트웨어</td><td>, Bio Rad</td><td>1864001 및 1864003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 액적 리더 오일</td>, <td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 여과 피펫 팁</td><td>Thermo 과학적인</td><td></td><td>10 ul, 20 ul, 200 ul 및 1000 ul</td></tr></tbody></table>

물방울 디지털 트랩 (ddtrap): telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP)은 주어진 샘플 내에서 텔로 활성을 검출 하기 위해 가장 널리 사용 되는 분석 법입니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 방법은 대부분의 세포 용 해물에서 효소 활성을 강력 하 게 측정할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이 머를 사용한 겔 기반 트랩은 시료 처리량을 제한 하 고 시료의 차이를 검출 하는 능력은 효소 활성의 2 배 또는 그 이상의 변화에 제한 됩니다. 물방울 디지털 트랩 인 ddTRAP은 기존의 트랩 분석에서 수정 된 매우 민감한 접근 방식으로, 사용자가 96 샘플에 대 한 강력한 분석을 수행 하 고 DNA (텔로 확장 제품의 절대 정량화를 얻을 수 있게 합니다. ) 각 PCR 내 입력. 따라서 새로 개발 된 ddTRAP 분석은 기존의 겔 기반 트랩 분석의 한계를 극복 하 고 실험실 및 임상 설정 내에서 텔로 활동을 측정 하는 보다 효율적이 고 정확 하며 정량적 인 접근법을 제공 합니다.

DdTRAP을 사용 하 여, 텔로 활성은 다음 세포 주 들로 구성 된 세포 패널에서 측정 되었다 (그림 1). 비 소 세포 폐암 (H2882, H1299, Calu6, H920 및 A549), 소 세포 폐암 (H2887 및 H82) 및 SHP77-네거티브 섬유 아 세포 (BJ). 100만 세포 펠 렛은 NP-40 완충 액에서 분해 되었고, 텔로 확장 반응은 생물학적 3 중에서 수행 되었다. 일반적이 고 매우 권장 되는 네거티브 컨트롤은 "NTC" 템플릿 없는 컨트롤입니다. 이 샘플은 텔로 확장 반응에 NP-40 용 해 완충 액 (2 µ L)을 추가 하 고 실제 세포 용 해물을 함유 하는 다른 샘플과 동일한 방법으로 연장 제품을 진행 하 여 생성 됩니다. 이 샘플은 사용자가 텔로 활동을 더 잘 정량화 하기 위해 백그라운드 신호 (있는 경우)를 뺄 수 있도록 합니다. 본 도면에 도시 되지 않았지만, 또 다른 음성 대조 군...

저희는 액 적 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 사용 되는 표준 telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 분석 법을 성공적으로 전환 했습니다. DdTRAP 이라고 불리는이 새로운 분석은 더 민감하고 정량적 이며, 다양 한 인간 세포 내에서의 텔로 활동에 대 한 더 나은 검출 및 통계적 분석을 가능 하 게 합니다.

물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

ddTRAP 분석법은 세포에서 텔로머라아제 효소 활성의 민감하고 견고하며 정량적 측정을 얻을 수 있는 능력을 제공합니다. 중간 처리량 방식으로 실행당 최대 96개의 샘플을 실행할 수 있는 능력은 우리에게 큰 이점을 제공합니다. 수집된 데이터에 대한 적절한 통계 분석을 위해 컨트롤과 복제를 실행할 수 있습니다.셀 리싱 직전에 NP-40 용해 버퍼의 냉동 알리쿼트를 해동하십시오. 해동되면 리시스 버퍼를 얼음 위에 놓습니다. NP-40 용해 버퍼에 PMSF 프로테아제 억제제를 추가하여 최종 농도0.2 밀리머에 도달합니다.그런 다음, 세포 펠릿을 함유하는 튜브에 40마이크로리터를 추가하여 마이크로리터당 25, 000 세포의 세포 동등성에 도달한다. 부드럽게 세포를 열수 있도록 위아래로 lysate를 피펫. 거품을 하지 않도록 노력하십시오.세포가 30분 동안 얼음에 대고 감아 두도록 합니다. 10분마다 부드럽게 소용돌이어 세포 파편이 형성되는 것을 방지합니다. 세포 용해 동안, 텔로머라제 연장 반응을 위해 마이크로 센심 분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비하고 얼음에 저장합니다.셀 리시스 후, 익스텐션 마스터의 파이펫 48 마이크로리터가 각 PCR 튜브에 혼합됩니다. 각 PCR 튜브에 희석 된 용액의 2 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 리터 당 50 세포의 최종 세포 동등성에 도달하고 원고에 따라 텔로머라아제 확장 반응을 계속합니다. ddTRAP에 대한 미세 원심 분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비하고 실온에서 유지합니다.각 PCR 튜브에 ddPCR 마스터 믹스의 파이펫 19.8 마이크로 리터. 각 튜브에 이전 확장 반응 용액의 2.2 마이크로리터를 추가하여 총 22마이크로리터를 남깁니다. 액적 생성 카트리지를 설정하려면 준비된 용액의 20 마이크로리터를 카트리지의 중간 샘플에 잘 로드합니다.카트리지의 측면을 부드럽게 탭하여 거품을 솔루션 상단으로 이동합니다. 카트리지의 모든 우물은 오일을 적재하기 전에 시료로 적재해야 합니다. 그런 다음 70 마이크로리터의 액적 생성 오일을 왼쪽 오일에 잘 넣습니다.카트리지 의 끝에 밧줄로 개스킷을 고정하고 적재되고 조립된 카트리지를 물방울 발생기에 배치합니다. 생성기는 카트리지가 제대로 배치된다는 것을 알리는 단단한 녹색 표시등을 표시합니다. 60~90초 후에 발전기 표시등이 깜박임이 중지되면 주기가 완료됩니다.이제 카트리지를 제거합니다. 카트리지에서 개스킷을 부드럽게 제거합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 오른쪽에서 새로 생성된 액적 약 40마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트로 피펫합니다.모든 샘플이 증발을 방지하기 위해 96 웰 플레이트에 로드되면 알루미늄 호일 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 열 밀봉합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 열순환기로 로드하여 PCR 반응을 수행합니다. 시작하려면 96웰 플레이트를 액적 판독기로 로드합니다.A1 샘플이 홀더의 샘플과 일치되도록 플레이트를 올바르게 방향을 지정합니다. 물방울 판독기와 연결된 소프트웨어를 엽니다. 첫 번째 우물 A01을 두 번 클릭하여 샘플 웰 편집기 화면을 엽니다.실험을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 사용할 분석 유형을 선택합니다. QX200 ddPCR 에바그린 슈퍼믹스를 올바른 감지 방법으로 선택합니다. 웰 편집기 화면의 오른쪽 아래쪽에 적용을 클릭하여 강조 표시된 모든 우물에 사용자 정의 설정을 저장합니다.다음으로, 웰 편집기 화면에서 대상을 클릭하고 대상 드롭다운 메뉴를 클릭하여 알 수 없음, 참조 또는 템플릿 없음 컨트롤을 선택하여 샘플 유형을 정의합니다. 샘플 이름 섹션에서 모든 샘플에 레이블을 지정하고 적용을 클릭합니다. 실행을 클릭하여 접시를 읽습니다.플레이트를 읽어야 하는 방향을 알리는 메시지가 표시되면 Run Options 화면에서 열 또는 행을 선택합니다. 개별 우물 또는 열 및 행 헤더를 두 번 클릭하여 각 샘플에 대해 허용되는 물방울 수를 결정하여 정보 테이블을 제공합니다. ddTRAP의 경우 10개, 000개 이상의 허용된 액적샘플이 추가 분석을 위해 유효합니다.샘플 복제 및 NTC 샘플을 나타내는 우물을 강조 표시합니다. 화면 왼쪽 하단에 임계값을 설정하기 위한 아이콘을 클릭하여 샘플의 임계값을 수동으로 설정합니다. 이 프로토콜에서, 텔로머라아제 활성은 폐암과 텔로머라아제 음성 섬유아세포의 9개의 세포주로 구성된 세포 패널에서 측정되었다.임계값은 SHP77, H2887 및 NTC에 대한 세 가지 생물학적 복제모두에 대해 약 2, 000형광 진폭으로 설정되었다. 양성 물방울은 6, 000 형광 진폭 주위의 형광 강도를 가지고 있었고, 이는 상단에 명확한 인구를 형성하고, 약 1, 100 형광 진폭주위의 부정적인 물방울에서 분리. 모든 샘플 간의 세포당 총 텔로머라제 연장 제품은 폐암 라인에서 텔로머라제 활성을 나타내는 핵산의 측정된 농도에서 추정되었다.용해 또는 확장 반응 단계 중 모든 RNase 오염은 리보뉴클레오단백질 복합체이기 때문에 텔로머라아제 효소 활성을 파괴합니다. ddTRAP은 세포 내의 hTERT mRNA 발현 수준에서 ddPCR을 후속할 수 있다. 두 데이터 세트를 통해 hTERT 의 발현과 텔로머라제 활동과 상관 관계를 맺고 대체 접합과 같은 잠재적인 텔로머라제 규제 메커니즘을 자세히 파고들 수 있습니다.우리는 특정 접합 요인과 텔로머라아제 활동에 미치는 영향에 대한 조작을 탐구 할 수 있습니다. 현재, 우리는 텔로머라아제 활성을 표적으로 하는 잠재적인 약으로 올리고뉴클레오티드 접합 변조기를 설계하고 있습니다.

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SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

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눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

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물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

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