특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

이 프로토콜의 전반적인 목표는 설치류로부터 고순도의 미세아교세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 미세아교세포에서 줄기세포의 면역조절 특성을 확인하거나 약물 스크리닝 분석을 수행하는 것과 같은 신경 정보 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양에서 장시간 시간을 사용할 필요 없이 미세아교세포의 고순도 집단을 분리하는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 척추관의 구멍을 통해 가위 끝을 삽입하고 외이도를 측면 절개합니다. 그런 다음 조직을 연단 쪽으로 부드럽게 밀어 두개골을 노출시킵니다. 다음으로, 시상 봉합선을 따라 브레그마 쪽으로 절개합니다.

그런 다음 가위 끝을 브레그마에 삽입하고 측면을 절개합니다. 그런 다음 두개골을 부드럽게 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다. 구부러진 집게를 사용하여 집게를 제거하고 5ml 멸균 용기로 옮깁니다.

세척 당 5ml의 얼음처럼 차가운 세척 매체로 2-3회 세척하여 혈액을 제거합니다. 층류 공기 흐름 후드에서 5mm 용기의 내용물을 얼음 위에 놓인 작은 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 메스 날이나 멸균 가위를 사용하여 소뇌와 후각 전구를 제거합니다.

그런 다음 두 반구를 분리하기 위해 정중선을 자릅니다. 그런 다음, 수막층을 혈관이 보이는 뇌 표면에 붉은색을 띤 매우 얇은 세포층으로 식별합니다. 피질이 손상되지 않도록 주의하면서 가는 집게로 수막층을 조심스럽게 벗겨냅니다.

수막층이 끊어지면 완전히 제거될 때까지 찢어진 조각을 계속 벗겨냅니다. 그런 다음 반구를 얼음 위의 새로운 작은 페트리 접시로 옮기고 세척 매체로 채웁니다. 멸균 메스 칼날로 뇌를 작은 조각으로 자릅니다.

그런 다음 100마이크로리터의 파파인과 150마이크로리터의 DNase1을 배지에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 분해 후 P1000 피펫을 사용하여 조직을 분쇄합니다. 티슈 조각이 너무 커서 파이펫에 들어갈 수 없는 경우 멸균 가위를 사용하여 파이펫 팁을 넓히는 것이 좋습니다.

이 과정에서 세포 생존율을 감소시킬 수 있으므로 배지에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 층류 후드에서 100마이크로미터 셀 스트레이너가 있는 50리터 원추형 튜브를 준비합니다. 다이제스트 배지와 뇌 조각을 여과기에 붓습니다.

멸균 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 더 이상 조직이 보이지 않을 때까지 갈리는 동작으로 뇌 조각을 밀어 넣습니다. 이 과정에서 세척 매체로 필터를 지속적으로 세척하십시오. 이렇게 하면 스트레이너에 갇힌 모든 세포가 씻겨집니다.

그 후, 500G에서 단일 셀 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 10X 멸균 HBSS에 9:1 비율의 밀도 구배 매체를 추가하여 스톡 등장성 Percoll을 준비합니다. 그래디언트를 DMEM에서 30% SIP, one-X HBSS에서 70% SIP로 준비합니다.

예를 들어, 10mL의 30%SIP를 준비하려면 7ml의 DMEM에 3ml의 SIP를 추가합니다. 다음으로, 원뿔형 튜브에서 상등액을 흡인하고 DMEM에서 8ml의 30% SIP로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 전체 볼륨을 새 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 전사 피펫에 70% SIP를 채워 70% SIP 용액의 밑받침을 하고 전사 피펫을 원뿔형 튜브의 바닥으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 팁이 바닥에 가까워지면 전사 피펫을 통해 내용물을 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 실온에서 25분 동안 브레이크 0 및 가속 4로 650G에서 셀을 포함한 SIP 계층을 원심분리합니다.

70% Percoll 레이어는 세심한 주의를 기울여 밑에 깔아야 합니다. 이 계면의 중단은 세포층에서 미세아교세포의 포획에 심각한 영향을 미치고 수율을 심각하게 감소시킬 수 있습니다. 그런 다음 튜브 상단의 세포 파편이 있는 배지 4ml를 흡입하여 다음 단계에서 단핵 세포를 쉽게 제거할 수 있습니다.

다음으로, 피펫 팁을 계면 쪽으로 조심스럽게 내리고 30/70 밀도 구배 매체 계면에서 단핵 세포를 분리합니다. 흐린 계면에서 약 3밀리리터를 모아 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물을 9ml의 HBSS로 희석하여 밀도 구배 매체를 제거하는 데 도움을 줍니다.

500G에서 단핵 세포를 포함하는 희석된 밀도 구배 매체 계면을 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 1ml의 성장 배지로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 다시 부유한 세포를 Trypan blue로 염색하고 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.

이 단계에서는 수집된 단핵 세포를 300G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 자기 분리를 방해하는 성장 매체를 제거합니다. 이전에 얻은 것과 동일한 세포 수를 사용하여 0.1 - 2.5 밀리리터의 부피 범위 내에서 2% FBS 및 1 밀리몰 EDTA를 포함하는 PBS에서 밀리리터당 8개의 핵이 있는 세포를 10배로 한 번 재현탁합니다. 다음으로, PBS의 핵이 있는 세포의 전체 부피를 새로운 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 추가합니다.

그런 다음 샘플 1ml당 50마이크로리터의 CD11b PE 라벨링 시약을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 샘플 1ml당 70마이크로리터의 선택 칵테일을 추가합니다.

빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 5회 이상 위아래로 피펫팅하여 자성 입자를 혼합합니다. 샘플에 밀리리터당 50마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 배양합니다.

세포 혼합물의 총 부피가 2.5 밀리리터 미만인 경우, 2% FBS와 1밀리몰 EDTA를 함유한 PBS를 이 부피까지 채우고 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 자석에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 한 번의 연속 동작으로 튜브가 들어있는 자석을 2-3 초 동안 완전히 뒤집어 상층액을 붓습니다.

자석을 똑바로 세우고 자석에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 절차를 반복하여 열에서 나머지 셀을 씻어냅니다. 원하는 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.

채취 용기의 측면을 헹구어 튜브 측면에서 세포를 수집하고 수율을 최대화합니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 고립된 1차 미세아교세포는 구형 세포체와 뚜렷한 파열된 구조를 유지합니다. 다음은 분리된 미세아교세포의 대표적인 사실 플롯입니다.

Annexin V와 propidium iodide의 결합된 염색은 LPS로 자극한 후 apoptotic, necrotic 또는 live cell의 분류를 가능하게 합니다. hAEC-conditioned medium은 대조군에 비해 microglia apoptosis를 유의하게 감소시켰으며, 이는 이 세포 유형에 대한 보호 형태를 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 6-8시간 안에 수행할 수 있습니다.

이 방법을 수행할 때 이 단계가 수율에 가장 큰 영향을 미치므로 Percoll을 레이어링할 때 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 기술에 따라, 식세포 기능 분석 또는 뉴런과의 공동 배양과 같은 다른 절차를 사용하여 1차 미세아교세포에서 선택한 세포 유형의 면역 조절 특성에 대한 추가 질문에 답변할 수 있습니다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 분야에 있는 연구원을 위한 1차 microglia가 주산기 뇌 손상에서 어떻게 조절될 수 있는지 발견하는 길을 닦았습니다.

이 기술의 의미는 운동 및인지 기능 장애로 이어지는 신경 정보에 관여하는 것으로 알려진 1 차 면역 세포 유형의 특성을 규명 할 수 있기 때문에 주산기 뇌 손상의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 뇌성마비와 같은 운동 장애에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 알츠하이머병과 같은 발병기전에 미세아교세포가 역할을 하는 다른 장애에도 적용할 수 있습니다. 우리는 배양에서 장기간 시간을 보낸 후 잠재적인 후성유전학적 변화를 우회하는 미세아교세포의 빠른 특성화를 위한 기술을 원했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다운스트림 특성화를 위해 미세아교세포의 고순도 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.