Name: 특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 밀도 구배 원심분리와 자기 분리를 사용하여 마우스 뇌에서 고순도 원발성 미세아교세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 신경염증 및 신경계 질환 연구에 필수적인 면역조절 특성 분석에 활용됩니다.

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다음 절차는 모나 쉬 대학에서 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 건강 한 치료 신생아 C57Bl6/J P3-6 쥐 대표적인 결과 생성 하기 위해 사용 되었다.
1. 효소 소화
참고: 그것은 무 균 분리 하 고 1 차 셀을 경작 하는 경우를 고려 하는 것이 중요입니다. 확보 가능한 무 균입니다, 반면 초기 해 부와 murine 두뇌의 수확 완료할 수 있습니다 laminal 흐름 후드, 외부 층 류 후드 내에서 수행 하는 이후의 모든 단계.
<ol><li>불 임 악기를 사용 하 여, 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사, 동물을 목을 벨 고 100% 에탄올으로 씻어. 메 마른 작은 위를 사용 하 여, 머리의 오른쪽과 왼쪽 측면을 따라 작은 절 개를 확인 합니다. 이 나이에 피부 껍질 떨어져 쉽게. Bregma 포함 두개골 노출 연단 쪽으로 조직을 밀어 부드럽게 곡선된 겸 자의 팁을 사용 하 여.</li>
	<li>척추 운하의 개통에가 위 끝을 삽입 하 고 외가도에 측면 절 개를 만들기. 부드럽게 위쪽으로 손상을 방지 하기 위해 두뇌가 위 끝을 가리키는 Bregma에 화살 봉합을 따라 절 개를 확인 합니다. Bregma에가 위 팁을 삽입 하 고 코로나 봉합 따라 머리의 오른쪽과 왼쪽된 측면 절 개에 게.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 부드럽게 껍질 멀리 두개골 두뇌를 노출 합니다. 이렇게 하려면 측면 절 개에 의해 노출 되는 두개골의 가장자리를 잡고 하 고 측면에 두개골을 가볍게 당깁니다. 두개골 쉽게 떨어져 껍질 해야 합니다. 곡선된 겸 자 사용 하 여, 부드럽게 그것을 제거 하는 두뇌에서 특 종.</li>
	<li>5 mL 살 균 컨테이너에서 두뇌, 혈액을 제거 하, 세척 당 약 5 mL 미디어 차가운 세척 미디어 (낮은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 1% 페니실린-스 보충), 2-3 번 씻어.</li>
	<li>층 류 공기 후드에서 얼음에 작은 페 트리 접시 (35mm)에 5 mL 컨테이너의 내용을 놓습니다. 살 균 메스 블레이드 또는 살 균가 위를 사용 하면, 소 뇌 및 후 각 전구 제거할. 두 개의 반구를 분리를 잘라 중간을 확인 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 멀리는 외피가 손상 하지 않도록 주의 복용 좋은 집게와 meningeal 레이어 껍질. 보이는 혈관과 뇌의 표면에 붉은 가미와 매우 얇은 층의 세포로 meningeal 레이어를 식별 합니다. 두뇌를 차가운 유지 하는 것은 적절 한 meninges 제거를 위해 필수적 이다. Meningeal 레이어 나누기, 필 링 멀리 찢어진된 조각 완전히 제거 될 때까지 계속 합니다.</li>
	<li>(얼음)에 새로운 작은 페 트리 접시를 세척 미디어 채우기 반구를 전송 합니다. 뇌 살 균 메스 칼/가 위 작은 조각으로 잘라. 참고:이 크기에 ~ 1 m m2 이어야 하며 해야 주의 하지이 생산량을 줄일 수 있습니다 너무 작은 조각으로 그들을 잘라.</li>
	<li>100 µ L papain (17 U/mg 증권) 및 150 µ L 추가 DNase 미디어에 나 고 37 ° C에서 30 분 동안 품 어</li>
	<li>소화, 다음 조직 P1000 피 펫을 사용 하 여 triturate. 조직 조각을 피펫으로 입력 너무 큰 경우, 피 펫 팁을 넓혀 쌍 또는 살 균가 위를 사용 하는 것이 좋습니다. 이 과정 동안, 주의 하지 거품 미디어에 소개 하 고이 세포 생존 능력을 줄일 수 있습니다.</li>
</ol>2. myelin 파편 제거
<ol><li>층 류 흐름 후드 살 균 장비를 사용, 50 mL 원뿔 튜브는 100 µ m 셀 스 트레이너와, 각 두뇌에 대 한 준비. 스 트레이너에 다이제스트 매체와 뇌 조각을 포함 하는 배양 접시의 내용을 붓는 다. 볼 수 없는 더 많은 조직까지 연 삭 모션의 살 균 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 뇌의 조각을 통해 밀어. 소화, 다음 뇌 조직 한다가 떨어져 쉽게.</li>
	<li>지속적으로이 과정을 통해 셀 스 트레이너를 토 핑에 의해 세척 미디어 필터를 세척. 이 스 트레이너에 갇혀 셀 통해 씻어 것입니다. 참고:이 할 수 있을 때까지 튜브에 약 ~ 15 mL. 이것은 스 트 레 통해 씻어 충분히 보장 수집 셀의 양을 최대화 하 고입니다.</li>
	<li>
4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 단일 세포 현 탁 액을 원심 이 시간 동안 설명한 밀도 그라데이션 매체를 준비 합니다.
	<ol>
<li>밀도 그라데이션 매체 사용 되는 재고 isotonic percoll (SIP)을 준비 합니다. 이렇게 살 균 행 크 스 균형된 소금물 (HBSS) x 10에 밀도 그라데이션 매체의 9:1 비율을 추가 합니다.</li>
		<li>30으로 그라디언트를 준비 %DMEM SIP 및 70 %1 x HBSS에 SIP. 예를 들어, 30의 10 mL를 준비 %SIP, 7 ml DMEM SIP의 3 개 mL를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30%의 8 mL와 셀 펠 릿 DMEM에 SIP 원뿔 관 및 resuspend에서 상쾌한 발음 신선한 15 mL 원뿔 튜브로 전체 볼륨을 전송.</li>
	<li>70 %SIP 솔루션 아래에 배치 이렇게 하려면 전송 피 펫을 70 %SIP 신중 하 게 원뿔 튜브의 하단에 전송 피 펫을 통해 푸시 채우십시오. 일단 팁 하단 가까이, 전송 피 펫의 내용을 통해 밀어 부드럽게. 참고: 이렇게 천천히 30/70 인터페이스를 중단 시킬 수 없습니다. 분명 선 두 레이어를 분리 해야 합니다.</li>
	<li>650 x g 0 브레이크와 가속 4, 실 온에서 25 분에는 셀을 포함 하 여 SIP 레이어 원심 참고: 스핀 오프 브레이크 완료 하 고 천천히와 서 중단, 브레이크의 응용 프로그램은 interphase 중단 되며 극적으로 SIP 레이어 사이 셀 컬렉션을 줄일 수를 원심 분리기에 필수적 이다.</li>
	<li>튜브의 상단에 세포질 파편을 발음 하 고 상단에서 약 4 mL 미디어를 제거 합니다. 이 다음 단계에서 단 세포의 제거를 쉽게 것입니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게는 interphase 향해 피 펫 팁 낮은. 30/70 밀도 그라데이션 중간 인터페이스에서 단 세포를 분리. 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 흐린 인터페이스와 전송에서 약 3 mL를 수집 합니다. 이 따라, HBSS 밀도 그라데이션 매체의 제거를 돕기 위해의 9 mL와 혼합 희석.</li>
	<li>원심 희석된 밀도 그라데이션 중간 interphase, 단 세포를 포함 하 5 분에 대 한 500 x g에서 상쾌한 발음 1 mL 성장 매체 (DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 항생제로 보충) resuspend. 이 따라, resuspended 셀 trypan 푸른 얼룩 하 고는 haemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 자석 활성화 된 세포 분류
참고: 다음이 단계는 제조업체의 프로토콜에서 수정 됩니다.
<ol><li>이 자석 절연을 방해할 것 이다 성장 매체 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 300 x g에서 수집 된 단 세포 원심 단계 2.8에서 얻은 동일한 셀 수를 사용 하 여, 1 x 108 에서 resuspend nucleated 세포/mL PBS (+ + Ca와 Mg ++ 무료)에 포함 된 0.1-2.5의 볼륨 범위 내에서 2 %FBS 및 1 mM EDTA mL.</li>
	<li>신선한 5 mL (12 x 75 mm) 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브에 이전 단계에서 PBS에 nucleated 세포의 전체 볼륨을 추가 합니다. 추가 50 µ L CD11b PE 라벨 시 샘플의 1 mL 당. 빛에서 보호 하는 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>70 µ L 칵테일 선택의 (PBS에 CD11b에 대 한 단일 클론 항 체의 조합) 샘플의 1 mL 당을 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>5 번 이상 아래로 pipetting으로 마그네틱 입자를 혼합. 샘플에 50 µ L/mL를 추가 합니다. 빛에서 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어. 참고: 이러한 입자는 항 체와 tetrameric 복잡 한 형성 그리고 자기 열에 연결 된 얻을 것 이다.</li>
	<li>셀 혼합물의 총 볼륨은 2.5 mL 미만, PBS (+ + Ca와 Mg ++ 무료)이이 볼륨까지 상위 2 %FBS 및 1 mM EDTA를 포함 하 고 부드럽게 2-3 번 pipetting으로 혼합. 자석 (뚜껑) 없이 튜브를 삽입 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>한 연속 움직임에 완벽 하 게는 상쾌한 떨어져 따르고 2-3 s에 대 한 튜브를 포함 하는 자석 반전. 자석, 수직 위치를 반환 하 고 자석에서 튜브를 제거 합니다. 열에서 나머지를 준비 합니다. 참고:는 상쾌한 자석에 튜브를 거꾸로 하 여 제거 됩니다 unlabelled 및 원치 않는 셀을 포함 합니다. 튜브 연결 된 Cd11b 포함+ 세포.</li>
	<li>3.5, 3.6 두 번 더 단계를 반복 하 여 세포를 씻어. 샘플 1 mL 보다 큰 경우, 추가 반복 단계 3.5과 3.6의 것이 좋습니다.</li>
	<li>원하는 성장 매체에 셀 resuspend 린스 뿐만 아니라 컬렉션 그릇의 측면 (예. 15 mL 튜브) 튜브의 측면에서 세포를 수집 하 여 수익률을 극대화.</li>
</ol>4입니다. Microglia 순도의 확인
참고: 기본 microglia 3 L에서 격리 (n = 5 동물 총) 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 순도 대표 결과 대 한 확인을 통해 확인 했다.
<ol><li>10 %FBS 하룻밤, 1-2 플라스 크 당 106 세포 x의 밀도에서 시드를 포함 하는 성장 매체에서 T-25 플라스 크에 문화 세포.</li>
	<li>PBS 3 가진 T-25 플라스 크에 세포를 씻어 x 5 분 나머지 성장 미디어는 trypsinization 방해할 수도 제거.</li>
	<li>0.25 %trypsin 플라스 크에서 세포를 분리 하는 것의 2 개 mL를 추가 합니다. 트립 신 양의 플라스 크의 전체 표면을 커버 하기에 충분 한지 확인 합니다. 부드러운 trypsin의 획 일 한 적용을 보장 하기 위해 플라스 크의 소용돌이, 다음 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>10%를 포함 하는 성장 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 trypsinization 프로세스를 끄다 FBS 플라스 크로.</li>
	<li>Trypsinized 셀과 셀 수집 하 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>상쾌한 성장 매체 및 트립 신을 제거 하 고 500 μ FACS 버퍼에 펠 릿을 resuspend. Trypan 블루를 사용 하 여 셀 수를 수행 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 Fc 수용 체 블록 50 μ FACS 버퍼 + 5 x 106 세포 당 1 μ FcR 차단기를 추가 하 여 수행 합니다. 4 ° c.에 15 분 동안 품 어 참고: Fc 수용 체 블록 면역 세포 인구에 있는 Fc 수용 체 면역 글로불린의 비 특정 바인딩 방지 얼룩 절차에서 중요 한 단계입니다. 이 봉쇄 대는 다른 항 체의 다운스트림 바인딩에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>500 μ FACS 버퍼 diluting 하 여 차단 프로세스를 종료 합니다. 이 따라 원심에서 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 세포를 포함 하는 혼합물</li>
	<li>신선한 500 μ FACS 버퍼에 resuspend.</li>
	<li>샘플 튜브로 셀 (예: resuspending FACS 버퍼, 사용 400 μ의 500 μ 셀 하는 경우)의 대다수를 놓습니다. 제어 튜브 사이 나머지 셀을 배포 하 고 제어 튜브 당 최대 100 μ 톱 (예: 6 제어 튜브, 참아 16.67 μ 각 제어 튜브 상단에 83.33 μ FACS 버퍼). Unstained, 단일 스테인드 (CD45, CD11b), 단일 라이브/죽은 얼룩, FMOs, 및 샘플 튜브도 그룹 (굵게 컨트롤 튜브)를 확인 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 centrifuging 여 모든 튜브에 세포를 작은</li>
	<li>셀 당 5 x 106 셀 당 100 μ FACS 버퍼 1 μ 항 체와 튜브에 얼룩. 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 참고: 2 x 10 보다 작은6 셀 사용 하는 경우 50 μ 항 체 칵테일을 사용 합니다.</li>
	<li>워시 500 μ FACS 버퍼 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심</li>
	<li>300 μ FACS 버퍼에 셀 resuspend 참고: 셀 count가 2 x 10 보다 작은6~ 100 μ를 사용 합니다.</li>
	<li>사용 하 여 흐름 cytometry 분석, CD45낮은 고 CD11b 얼룩에 대 한 긍정적인 셀 계량. 이 백분율은 고립 된 기본 microglia에 해당합니다.</li>
</ol>5. Immunohistochemical 기본 Microglia의 얼룩
<ol><li>1 x 105 셀의 밀도에서 96 잘 접시의 세포 성장 매체 접시 하 고 밤새 품 어.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>15 분 제거 P1000 피펫은와 PFA에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 셀 고정 후 PBS + 0.1 %3 번 그들을 씻어 트리톤-X.</li>
	<li>3% 소 혈 청 알 부 민 실 온에서 1 h와 일반적인 바인딩에 대 한 블록.</li>
	<li>토끼 Iba-1 (1: 100) 4 ° c.에 24 시간으로 품 어 이 따라, 기본 항 체 혼합물을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 보조 안티 토끼 GFP 켤레 (1: 200)으로 품 어. 이것 다음, 이차 항 체 혼합물을 제거 하 고 PBS로 3 회 세척 합니다.</li>
	<li>형광 현미경을 사용 하 여 매체 및 캡처 이미지를 마운트 하는 형광으로 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
</ol>6. Microglia 사용 하 여 pHrodo 분석 결과의 정량화
참고: pHrodo 분석 결과 경작된 한 세포에 먹어서 레벨의 식별에 대 한 수 있습니다. Endocytosis 통해 통풍 관에 더 산 성 환경으로 국제화 bioparticle 어원이 같은 말의 형광의 수준 증가 한다. 형광 수준 다음 FACS에 의해 측정할 수 있습니다. 다음 단계는 제조업체의 프로토콜에서 수정 됩니다.
<ol><li>문화 성장 매체에서 T-25 플라스 크에 세포 하룻밤, 1-2 플라스 크 당 106 세포 x의 밀도에 시드. T-25 PBS 3 시간 5 분에 대 한 플라스 크에 세포를 씻어.</li>
	<li>2 mL 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</li>
	<li>10%를 포함 하는 성장 매체의 2 개 mL를 추가 하 여 trypsinisation 프로세스를 끄다 FBS 플라스 크로.</li>
	<li>세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g에서 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 resuspend 106 셀/mL에서 문화 매체에서 기본 microglia를 포함 하는 펠 릿. 참고: 또는 플레이트 96 잘 접시에 적어도 하루 전에 셀 하 고 수행 하는 것입니다 분석 결과 하루에 잘 당 1 x 105 가능한 셀에 대 한 목표.</li>
	<li>접시에 1 x 105 셀/잘 96 잘 접시, 잘 당 100 μ 셀. 하십시오 컨트롤 및 3 중, 실험적인 우물 그리고 no-셀 컨트롤 배경 빼기에 대 한 긍정적인 통제 당 한 빈 잘 두고.</li>
	<li>No-셀 배경 빼기 비어 우물에 성장 매체의 100 μ를 추가 합니다. 참고: 모든 다른 시험관에서 분석 결과, 같은 적절 한 제어는 판독의 정확성에 대 한 생명 이다. No-셀과 함께 컨트롤 (배경 독서), 또한 부정적인 컨트롤 잘 포함 (pHrodo 켤레 추가, 하지만 얼음에).</li>
	<li>접시를 커버 하 고 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>자극 제와 치료를 추가 하 여 실험 웰 스를 준비 합니다. 치료 되지 않는 우물을 차량 컨트롤 (성장 매체에만)를 추가 합니다. 참고: Lipopolysaccharide 1 µ g/mL [흥분 제]와 인간 amnion 상피 세포 (항구적)-바른된 미디어 [치료]는 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 했다.</li>
	<li>활용 된 염료의 유리병을 녹여, 추가 2 mL 글귀 버퍼와 짧게 소용돌이. 깨끗 한 유리 튜브로 튜브 내용을 전송 하 고 입자는 균일 하 게 분산 되도록 5 분 sonicate.</li>
	<li>미 판 우물에서 문화 매체를 발음 하 고 신속 하 게 염료의 서 스 펜 션의 100 μ로 바꿉니다. 커버 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 컨트롤 튜브도 얼룩 기억 해요.</li>
	<li>교류 cytometry 분석을 사용 하 여, 셀 활용된 pHrodo 구슬에 대 한 긍정적인 얼룩을 계량 하 고 microglia를 적극적으로 phagocytosing의 (부모)의 백분율로 제시.</li>
</ol>7. 다음과 같은 염증 성 모욕 Microglia Apoptosis의 정량화
<ol><li>"Microglia 순도의 확인" 섹션에서 1-7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>샘플 튜브로 셀 (예: 만약 당신이 resuspended FACS 버퍼, 사용 400 μ의 500 μ 셀)의 대다수를 놓습니다. 제어 튜브 사이 나머지 셀 고 상위 컨트롤 (예: 6 제어 튜브, 참아 16.67 μ 각 제어 튜브 상단에 83.33 μ FACS 버퍼) 튜브 당 최대 100 μ. 그룹 (굵게 컨트롤 튜브): 흠 없는, 단일 얼룩 (AnnexinV, Propidium 요오드 화물), 단일 라이브/죽은 얼룩, FMOs, 샘플 튜브.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 centrifuging 여 모든 튜브에 세포를 작은.</li>
	<li>1 μ 항 체/100 μ FACS 버퍼/5 x 106 셀 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 참고: 경우 50 μ를 사용 2 x 106 셀.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 500 μ FACS 버퍼 및 원심 분리기를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
	<li>300 μ FACS 버퍼에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: ~ 100 μ 셀 count가 2 x 10 보다 작은6</li>
	<li>각 사분면 내에서 셀을 계량 (1 분기: 괴 사 성, 2 분기: 늦은 apoptotic, Q3: 가능한, 4 분기: 초기 apoptotic).</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

Microglia 환경 자극에 의해 변경 둘 다 프로 및 안티-염증, 기능이 있다. 이전 연구 microglia 활성화의 변조 neuroprotection 부여 수 있습니다 나타났습니다. 뉴런을 보호 하 고 부상을 복구 하는 능력은 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해를 심화 하기 위해 더 많은 연구를 필요로 합니다. 따라서, 절연 고 순도 기본 microglia의 중요 하 고 유용한 기술입니다. 이것은 높은 순수 기본 microglia 2 일 이내 생체 외에서 실험에 대 한 준비를 얻기에 상대적으로 빠른 방법입니다.
다양 한 기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 문학에 설명 된 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 주요 도전은 효율적으로 충분 한 샘플, 생존에 순도 높은 생산 이다. 이 프로토콜의 주요 이점은 문화에 시간에 대 한 필요 없이 매우 순수한 샘플의 수익률 이다. 따라서, 메서드는 2 주에서 2 일 단축, 빠른 결과 용이 하 게이. 특...

염증, hypoxic 뇌 출혈에서 perinatal 기간 동안 손상 장기 sequelae의 배열을 가질 수 있습니다. Perinatal 뇌 손상의 복잡 한 이상 염증 그리고 이어지는 신경 및 axonal 죽음1허 혈 이론 이다. 타고 난 면역 반응 부상2로 이어지는 이벤트의 캐스케이드에 중요 한 역할을 한다.
Microglia, 중앙 신경 시스템 (CNS) 내 거주 면역 세포는 부상3초 동 조치. Microglia 용량4환경 보호 또는 독성, 종속을 가진 플라스틱 셀 종류가 있습니다. 그들은 chemotaxis, 식 균 작용, 항 원 프레 젠 테이 션 및 cytokines 및 반응성 산소 종4,5의 생산에서 포함 된다. 노화 microglia 끊임없이 환경을 조사 하 고4외국 또는 유해한 물질 존재에 의해 활성화 됩니다. 활성화는 CNS 보호4중요 한 프로 염증 반응을 이끌어 낸다. 이 m 1 "프로-염증 성" 형 microglia 주로 항 원 프레 젠 테이 션 및 병원 체4의 죽음에서 포함 된다. Neuroprotection에서 염증 반응의 중요 한 역할에도 불구 하 고 유해 하 고 신경 손상4에 통제 또는 장기간 염증이 될 수 있습니다. 그러나, 특정 환경 자극에 노출 되 면 microglia 염증 형을 전시 수 있습니다. 이러한 프로 M2 microglia 상처 치유 및 복구6, cytokines의 범위를 해제에서 중요 한 역할 그리고 다른 수용 성 중재자 downregulate 염증, 식 균 작용을 증가 하 고 홍보 복구4, 7. microglia의 역할 다양 하 고 다시 myelination8, 뇌졸중 모델9 에 산소와 포도 당 소모 하는 동안 뉴런을 보호 하 고 홍보에 neurite 결과 중 운전 oligodendrocyte 차별화를 포함 척수 부상10모델.
이러한 glial 세포의 연구는 이해 및 조작 neuroinflammation에 대 한 응답에서 중요 한 측면을 나타냅니다. 설명된 프로토콜 microglia 변조 neuroinflammatory 장애에서의 치료 잠재력에 추가 조사에 대 한 수 있습니다.
신경 보호 역할을 향해 microglial 활성화의 변조 조건11,,1213의 범위에 관찰 되었습니다. 따라서, 현재 이해 하 고 더 공부 microglial 활성화의 향상이 중요, 체 외에서 그리고 vivo에서모두를 포함 하 여 다양 한 모델의 사용을 필요로 합니다. 생체 외에서 연구는 그들의 더 큰 효율성, 낮은 비용 및 고립 된 세포 인구 조사 수는 중요 한 도구를 나타냅니다.
다양 한 프로토콜 microglia murine 두뇌에서 효율적으로 좋은 생존 및 고 순도 높은 수익률 샘플 생산에 도전의 격리에 대 한 문헌에 설명 되어 있습니다. 기본 microglia의 절연의 일반적으로 사용 되는 방법 자력 분리와 혼합 glial 문화의 장기간 떨고 있습니다. 개인적인 경험을 통해 자기 열을 저지 한 세포질 파편의 높은 수준의 있었다는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다음 프로토콜 이용 되었다, 어떤 CD11b 자력 분리 뒤 초기 밀도 그라데이션 원심 분리 단계를 통합. 아래에 설명 된 프로토콜은 충분 한 수량에 매우 순수한 샘플 생산 최적화 되었습니다. 그것은 그것의 높은 순도 짧은 기간으로 인해 유리-한 문화 2-3 주에 대 한 필요 없이 2 일 이내에 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜 기본 murine 이다의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM, 저포도당, 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI 등급 II, 파</td><td></td>파야 라텍스에서 추출한 <td>Sigma-Aldrich</td> 10104159001 <td></td></tr><tr><td>Papain, 완충 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125-100mg</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 적격, 열 비활성화</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>18770</td><td>EasySep 자석 변형</td></tr><tr><td>EasySep 자석</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 버퍼</td><td>StemCell Technologies</td><td>20144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate buffered saline</td><td>Gibco</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%) (10X)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&trade;)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL 라운드 바텀 하이 클리리티 PP 테스트 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균</td><td>코닝</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>175cm&sup2; 벤트 캡이 있는 각진 목 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>대장균의 지질다당류 O127:B8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5024</td><td></td></tr><tr><td>96웰 TC 처리 마이크로플레이트 크기 96웰, 투명, 폴리스티렌, 둥근 바닥</td><td>Corning</td><td>CLS3799</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(분말, 95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>래빗 안티-IBA1</td><td>와코</td><td>01919741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG H& </td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>FACS 항체</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 CD11b&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>ZombieNIR</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Annexin.V_FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-060</td><td></td></tr><tr><td>Propodium Iodide solution</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 microglia의 절연

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, 두뇌에 있는 면역 세포 염증 또는 중앙 신경 조직에 상해에 초 동 조치입니다. 최근 연구는 동적, 프로-염증 성 및 안티-염증 고기 가정 수 microglia를 밝혔다. 둘 다 (프로-염증 성) M1 및 M2 (프로) 고기 플레이 perinatal 뇌 손상 등 전시 다른 neuroinflammatory 조건에서 중요 한 역할은 특정 환경 자극에 대 한 응답에서 기능. Microglial 활성화의 변조는 따라서 microglia 뇌 손상에 치료 잠재력을 할 수 있습니다 제안 하는 neuroprotection 부여 하는 것 주의 되었다. 그러나, 더 많은 연구가 더 나은 microglia 질병에서의 역할을 이해 하는 데 필요한 이며이 프로토콜을 용이 하 게 한다. 프로토콜 아래에 설명 된 결합 밀도 그라데이션 원심 분리 과정에서 시험관 실험 없이 사용할 수 있는 기본 microglial 세포의 매우 순수한 샘플 생산 자력 분리와 세포 파편을 줄이기 위해는 2-3 주 배양에 대 한 필요 합니다. 또한, 특성화 단계 microglia, 분극의 우리의 이해를 더 나은 연구를 방 조 하 고 이러한 세포의 못쓰게는 재생 의학 분야에서 강한 영향에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을.

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여, microglia의 순수한 인구 고립 될 수 있다 하 고 생체 외에서 및 FACS 분석을 사용 하 여 특성에 대 한 준비가 될 수 있습니다. 로 시작 되기 위하여는, 18 동물까지 사용할 수 있습니다 약 450000 600000 microglial 셀의 예상된 수확량을 가진 추려 당. 먼저 격리 된 세포의 순도 확인 하는 중요 한 및 FACS 분석 두 마커 CD45 및 CD11b. microglia 신분증에 대 한 얼룩에 의해 수행 됐다 할 수 증명 귀찮은, 많은 마커 microglia 표현으로 표현 됩니다. 대 식 세포, 그리고이 두 개의 마커를 사용 하 여 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화를 허용 한다. 특히, microglia CD45, CNS와 주변 세포에서 높은 식에 비해 낮은 표현의 있으며 또한 CD11b에 대 한 긍정적인 (그림 1). 이 특정 격리에...

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 설치류로부터 고순도의 미세아교세포 집단을 분리하는 것입니다. 이 방법은 미세아교세포에서 줄기세포의 면역조절 특성을 확인하거나 약물 스크리닝 분석을 수행하는 것과 같은 신경 정보 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양에서 장시간 시간을 사용할 필요 없이 미세아교세포의 고순도 집단을 분리하는 것입니다.이 절차를 시작하려면 척추관의 구멍을 통해 가위 끝을 삽입하고 외이도를 측면 절개합니다. 그런 다음 조직을 연단 쪽으로 부드럽게 밀어 두개골을 노출시킵니다. 다음으로, 시상 봉합선을 따라 브레그마 쪽으로 절개합니다.그런 다음 가위 끝을 브레그마에 삽입하고 측면을 절개합니다. 그런 다음 두개골을 부드럽게 벗겨내어 뇌를 노출시킵니다. 구부러진 집게를 사용하여 집게를 제거하고 5ml 멸균 용기로 옮깁니다.세척 당 5ml의 얼음처럼 차가운 세척 매체로 2-3회 세척하여 혈액을 제거합니다. 층류 공기 흐름 후드에서 5mm 용기의 내용물을 얼음 위에 놓인 작은 페트리 접시에 넣습니다. 멸균 메스 날이나 멸균 가위를 사용하여 소뇌와 후각 전구를 제거합니다.그런 다음 두 반구를 분리하기 위해 정중선을 자릅니다. 그런 다음, 수막층을 혈관이 보이는 뇌 표면에 붉은색을 띤 매우 얇은 세포층으로 식별합니다. 피질이 손상되지 않도록 주의하면서 가는 집게로 수막층을 조심스럽게 벗겨냅니다.수막층이 끊어지면 완전히 제거될 때까지 찢어진 조각을 계속 벗겨냅니다. 그런 다음 반구를 얼음 위의 새로운 작은 페트리 접시로 옮기고 세척 매체로 채웁니다. 멸균 메스 칼날로 뇌를 작은 조각으로 자릅니다.그런 다음 100마이크로리터의 파파인과 150마이크로리터의 DNase1을 배지에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 분해 후 P1000 피펫을 사용하여 조직을 분쇄합니다. 티슈 조각이 너무 커서 파이펫에 들어갈 수 없는 경우 멸균 가위를 사용하여 파이펫 팁을 넓히는 것이 좋습니다.이 과정에서 세포 생존율을 감소시킬 수 있으므로 배지에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 층류 후드에서 100마이크로미터 셀 스트레이너가 있는 50리터 원추형 튜브를 준비합니다. 다이제스트 배지와 뇌 조각을 여과기에 붓습니다.멸균 3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 더 이상 조직이 보이지 않을 때까지 갈리는 동작으로 뇌 조각을 밀어 넣습니다. 이 과정에서 세척 매체로 필터를 지속적으로 세척하십시오. 이렇게 하면 스트레이너에 갇힌 모든 세포가 씻겨집니다.그 후, 500G에서 단일 셀 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 10X 멸균 HBSS에 9:1 비율의 밀도 구배 매체를 추가하여 스톡 등장성 Percoll을 준비합니다. 그래디언트를 DMEM에서 30% SIP, one-X HBSS에서 70% SIP로 준비합니다.예를 들어, 10mL의 30%SIP를 준비하려면 7ml의 DMEM에 3ml의 SIP를 추가합니다. 다음으로, 원뿔형 튜브에서 상등액을 흡인하고 DMEM에서 8ml의 30% SIP로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 전체 볼륨을 새 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 전사 피펫에 70% SIP를 채워 70% SIP 용액의 밑받침을 하고 전사 피펫을 원뿔형 튜브의 바닥으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 팁이 바닥에 가까워지면 전사 피펫을 통해 내용물을 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 실온에서 25분 동안 브레이크 0 및 가속 4로 650G에서 셀을 포함한 SIP 계층을 원심분리합니다.70% Percoll 레이어는 세심한 주의를 기울여 밑에 깔아야 합니다. 이 계면의 중단은 세포층에서 미세아교세포의 포획에 심각한 영향을 미치고 수율을 심각하게 감소시킬 수 있습니다. 그런 다음 튜브 상단의 세포 파편이 있는 배지 4ml를 흡입하여 다음 단계에서 단핵 세포를 쉽게 제거할 수 있습니다.다음으로, 피펫 팁을 계면 쪽으로 조심스럽게 내리고 30/70 밀도 구배 매체 계면에서 단핵 세포를 분리합니다. 흐린 계면에서 약 3밀리리터를 모아 새로운 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물을 9ml의 HBSS로 희석하여 밀도 구배 매체를 제거하는 데 도움을 줍니다.500G에서 단핵 세포를 포함하는 희석된 밀도 구배 매체 계면을 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 1ml의 성장 배지로 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 다시 부유한 세포를 Trypan blue로 염색하고 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.이 단계에서는 수집된 단핵 세포를 300G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 자기 분리를 방해하는 성장 매체를 제거합니다. 이전에 얻은 것과 동일한 세포 수를 사용하여 0.1 - 2.5 밀리리터의 부피 범위 내에서 2% FBS 및 1 밀리몰 EDTA를 포함하는 PBS에서 밀리리터당 8개의 핵이 있는 세포를 10배로 한 번 재현탁합니다. 다음으로, PBS의 핵이 있는 세포의 전체 부피를 새로운 5밀리리터 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 추가합니다.그런 다음 샘플 1ml당 50마이크로리터의 CD11b PE 라벨링 시약을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 샘플 1ml당 70마이크로리터의 선택 칵테일을 추가합니다.빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 5회 이상 위아래로 피펫팅하여 자성 입자를 혼합합니다. 샘플에 밀리리터당 50마이크로리터를 추가하고 빛으로부터 보호된 실온에서 10분 동안 배양합니다.세포 혼합물의 총 부피가 2.5 밀리리터 미만인 경우, 2% FBS와 1밀리몰 EDTA를 함유한 PBS를 이 부피까지 채우고 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 자석에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 한 번의 연속 동작으로 튜브가 들어있는 자석을 2-3 초 동안 완전히 뒤집어 상층액을 붓습니다.자석을 똑바로 세우고 자석에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 절차를 반복하여 열에서 나머지 셀을 씻어냅니다. 원하는 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.채취 용기의 측면을 헹구어 튜브 측면에서 세포를 수집하고 수율을 최대화합니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 고립된 1차 미세아교세포는 구형 세포체와 뚜렷한 파열된 구조를 유지합니다. 다음은 분리된 미세아교세포의 대표적인 사실 플롯입니다.Annexin V와 propidium iodide의 결합된 염색은 LPS로 자극한 후 apoptotic, necrotic 또는 live cell의 분류를 가능하게 합니다. hAEC-conditioned medium은 대조군에 비해 microglia apoptosis를 유의하게 감소시켰으며, 이는 이 세포 유형에 대한 보호 형태를 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 6-8시간 안에 수행할 수 있습니다.이 방법을 수행할 때 이 단계가 수율에 가장 큰 영향을 미치므로 Percoll을 레이어링할 때 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 기술에 따라, 식세포 기능 분석 또는 뉴런과의 공동 배양과 같은 다른 절차를 사용하여 1차 미세아교세포에서 선택한 세포 유형의 면역 조절 특성에 대한 추가 질문에 답변할 수 있습니다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 분야에 있는 연구원을 위한 1차 microglia가 주산기 뇌 손상에서 어떻게 조절될 수 있는지 발견하는 길을 닦았습니다.이 기술의 의미는 운동 및인지 기능 장애로 이어지는 신경 정보에 관여하는 것으로 알려진 1 차 면역 세포 유형의 특성을 규명 할 수 있기 때문에 주산기 뇌 손상의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 뇌성마비와 같은 운동 장애에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 알츠하이머병과 같은 발병기전에 미세아교세포가 역할을 하는 다른 장애에도 적용할 수 있습니다. 우리는 배양에서 장기간 시간을 보낸 후 잠재적인 후성유전학적 변화를 우회하는 미세아교세포의 빠른 특성화를 위한 기술을 원했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다.이 비디오를 시청한 후에는 다운스트림 특성화를 위해 미세아교세포의 고순도 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

이 비디오에서는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 쥐 새끼 뇌에서 미세아교세포를 포함한 CD11b 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 뇌 조직을 균질화하여 단세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액은 항-CD11b 항체로 코팅된 마이크로비드로 배양된 후 자기 컬럼 기반 분리를 통해 CD11b+ 세포 집단을 정제합니다.

쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

이 비디오는 자기 세포 분류를 사용하여 마우스 뇌의 탈수초 병변에서 미세아교세포를 추출하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 미세아교세포를 포함하는 병변된 뇌 조직을 절개하고, 특정 효소로 조직을 처리하여 단세포 현탁액을 얻고, 미세아교세포 수용체 특이적 자기 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 것이 포함됩니다.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

배우세요 밀도 구배 원심분리와 자기 분리를 사용하여 마우스 뇌에서 고순도 원발성 미세아교세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 신경염증 및 신경계 질환 연구에 필수적인 면역조절 특성 분석에 활용됩니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

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