Name: 암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 학습하세요 암 관련 피로에서 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 임상 프로토콜을. 표준 채혈과 기본 실험실 절차를 사용하여 환자의 독성 위험을 식별하고 피로 관리를 최적화하는 방법입니다.

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이 연구는 완전히 사단 교내 연구의 국립 연구소의 간호 연구 NIH, 베 데스 다, 메릴랜드의에 의해 지원 됩니다.

현재 연구 (NCT00852111)에 의해은 기관 검토 위원회 (IRB)의 국립 보건원의 건강 (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드 승인 되었다. 이 연구에 등록 참가자 euthymic 남자 18 세, 이전 전립선의 유무에 관계 없이 비 전이성 전립선 암 진단을 받은 사람과 했다 외부 광속 방사선 요법 (EBRT) 받을 예정. 만약 그들이 진보적인 질병 상당한 피로 일으킬 수 있는 잠재적인 참가자 제외 됐다 지난 5 년 이내 정신 질병을 했다, 했다 교정된 hypothyroidism 또는 빈 혈, 또는 두 번째 종은 했다. 진정 제, 스테로이드, 또는 비 스테로이드 항 염증 제 대리인을 사용 하는 개인도 제외 했다. 건강 한 제어 혈액 샘플 NIH 부의 수혈 의학에는 IRB 승인 프로토콜 (NCT00001846)에서 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 모든 참가자는 Magnuson 임상 연구 센터는 NIH에서 보충 했다. 서명 된 서 면된 통지 해준 동의 연구 참여 전에 얻은 했다.
1. 미토 콘 드리 아 기능 측정 준비 (실험의 1 일)
<ol><li>센서 카트리지 수 화 ( 재료의 테이블; 대략적인 기간을 참조: 5 분).<ol>
<li>패키지에서 센서 카트리지를 제거 합니다. 400 μ Calibrant 솔루션으로 각 자 채우기 다음 유틸리티 플레이트의 각 음에 200 μ Calibrant 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>지금 그것에 있는 Calibrant 솔루션 유틸리티 접시에 센서 플레이트를 반환 합니다. 하룻밤 비 CO2 37 ° C 배양 기에서 카트리지를 하이드 레이트. 참고: 센서 카트리지 4 h의 최소 및 최대 72 h 화 될 필요가 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 임상 샘플 준비 (실험의 주 2)
<ol><li>13 항목 기능 평가의 만성 질환 치료-(EBRT 개시) 전에 기준선, 중간점, EBRT, 1 년제 포스트 EBRT의 완성 피로 (FACIT-F)2,23,24 를 사용 하 여 피로 측정 합니다.<ol>
<li>0-사용 하 여 각 항목 응답, 어디 0 "전혀" 나타내고 4는 응답자에 관한 해당 문이 "대단히." 나타냅니다 4 규모 총 점수는 높은 피로 강도 반영 하는 낮은 점수와 16-53에서 범위 해야 합니다.</li>
		<li>FACIT F 점수 43, 보다 낮은 점수로 FACIT F ≥43의의 부재 또는 하지 임상-의미 있는 피로2나타내는으로 피로 정의 합니다. 참고: 43 최고의 FACIT F 점수는 환자와 일반 인구2의 피로 점수 나눕니다.</li>
		<li>FACIT 피로 규모에 다음 13 항목을 포함: 1) 기분이 피로; 2) 나 온통; 약한 느낌 3) 기분이 무관심 ("세척 밖 으로"); 4) 나는 피곤해; 5) 나는 문제가 시작 하는 것 들 때문에 피곤; 6) 나는 문제가 피곤; 이기 때문에 일을 마무리 7) 나는 에너지; 8) 내가 내 평소 활동을 할 수 9) 나 낮; 자 필요 10) 내가 너무 피곤해 서 먹는; 11) 내가 내 평소 활동을 하 고 도움이 필요 12) 나; 하려는 일을 너무 피곤 되 고에 의해 좌절 해요 그리고 13) 나 난 피곤 때문에 내 사회 활동을 제한 하는.</li>
	</ol>
</li>
	<li>갓 수집 된 혈액 샘플에서 PBMC를 분리 (대략적인 소요 시간: 1 시간).<ol>
<li>단 세포 준비 관으로 8 mL의 혈액을 수집 ( 재료의 표참조). 참고: 혈액 샘플 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 샘플 수집 후 2 시간 이상 처리 하는 경우 PBMCs의 품질을 손상 될 수 있습니다.</li>
		<li>실 온 (18-25 ° C)에서 30 분 동안 1750 x g에서 원심. 15 mL 원뿔 튜브에 흐림 레이어를 전송. PBS의 15 mL를 추가 하 고 5 번 반전.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 300 x g에서 원심 조심 스럽게 제거 하 고 방해 펠 릿 없이 상쾌한 삭제. 다시 10 mL PBS, 추가 하 여 펠 릿을 일시 중단 하 고 5 번 반전.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 액체 표면에 뜨는 삭제 하 고 다시 1 mL PBS에에서 셀을 일시 중단. 1.5 mL microfuge 관에는 PBMCs를 전송 합니다.</li>
		<li>610 x g에서 10 분간 원심. 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 RPMI-1640 년에 펠 릿을 resuspend (RPMI-1640 보충 10 %FBS, 10mm 페니실린/스).</li>
	</ol>
</li>
	<li>비 부착 한 세포에 대 한 셀 번호판 코트 (대략적인 소요 시간: 30 분).<ol>
<li>세포 및 조직 접착제 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조) 0.1 M 나트륨 중 탄산염 pH 8.0에서에서 재고 솔루션을 diluting 하 여. 작업 솔루션 3.5 μ g/c m2 의 영역에 있어야 합니다. 참고:이 솔루션에는 해양 홍합 Mytilus 새싹에서 추출한 polyphenolic 단백질을 포함 되어 있습니다. 이 단백질은 표면에 자체를 홍합에서 분 비 하는 접착제의 주요 구성 요소. 우리는 세포 탁 PBMCs와 함께 최고의 작품을 찾을.</li>
		<li>각 잘을 희석된 접착제 솔루션의 100 μ를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 20 분 동안 품 어. 씻어 세 번 디 물과 공기 건조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 미토 콘 드리 아 기능 측정
<ol><li>분석 결과 미디어의 준비 (대략적인 소요 시간: 10 분). 참고: 분석 결과 미디어 준비 되어야 한다 갓 실험의 날에.<ol>
<li>L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 미디어 (동일한 성분 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 하지 않고 탄산, 포도 당, 글루타민, 또는 나트륨 pyruvate) 기반 분석 결과 미디어를 추가 합니다. 미디어를 따뜻하게 37 ° c, pH 7.4에 조정. 참고: L-글루타민, pyruvate, 및 포도 당 농도 일반적으로 정상적인 성장 미디어, 농도와 동일 하지만 분석 결과에 따라 조정 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs 미토 스트레스 테스트에 대 한 준비 (대략적인 소요 시간: 2 시간).<ol>
<li>각 잘 80-90 %confluency 도달에 2 단계에서에서 충분 한 PBMCs를 접시. 우리의 경험에서 1.5 x 105 셀/잘 가장 일관 된 결과 얻지 못했다. 참고: 웰 스 A와 H 배경 우물 이며, 분석 결과 미디어 셀 포함. 스 B g, outliers를 담당 하기 위해 환자 샘플 당 적어도 3-6 우물을 도금 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>우물의 바닥에 셀 수 있도록 2 분 200 x g에서 내려 접시를 회전 합니다. 한 번 분석 결과 미디어와 세포를 씻어. 이 단계는 성장 매체에서 혈 청 및 나트륨 중 탄산염을 제거합니다. 참고: 우리의 경험에서 세척 단계 일반적으로 제거 됩니다 셀의 20-30%.</li>
		<li>45-60 분에 대 한 비 CO2 37 ° C 배양 기에서 배경 웰 스 A와 헤 품을 포함 하 여 각 음에 180 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미토 스트레스 테스트 실행<ol>
<li>마약 분석 결과 미디어와 미토 스트레스 키트에 다음과 같이 다시 구성:<ol>
<li>Oligomycin: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 252 μ 분석 결과 미디어를 추가 합니다.</li>
			<li>FCCP: 50 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 288 μ를 추가 합니다.</li>
			<li>Antimycin A /로 테 논: 25 μ M에서 재고 솔루션을 생성 하기 위해 유리병에 분석 결과 미디어의 추가 216 μ.</li>
		</ol>
</li>
		<li>소용돌이 약 1 분간 약을 재구성 된다. 작업 솔루션으로 희석. 참고: 작업 솔루션의 농도 적정 및 셀 유형에 따라 실험 전에 미리 결정 되어야 한다. PBMCs, 우리 찾을 Oligomycin의 그 1 μ M, 1 μ M FCCP, 그리고 0.5 μ M antimycin A로 테 논 최고 작동 /.</li>
		<li>약 플라스틱 센서 카트리지에서 각 포트에 순차적으로:<ol>
<li>포트 a: 10 μ M의 피 펫 20 μ Oligomycin, 1 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한.</li>
			<li>포트 b: 피 펫 22 μ 1 μ M의 각 음에 최종 농도 10 μ M FCCP의.</li>
			<li>포트 c: 5 μ M antimycin A의 피 펫 25 μ / 0.5 μ M의 각 음에 최종 농도 대 한로 테 논.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 외 유출 악기에 "미토 스트레스 테스트"를 선택 합니다. 악기 프롬프트를 따라을 센서 카트리지를 삽입 합니다. 악기는 자동으로 센서 캘리브레이션을 수행 합니다. 센서 교정 및 악기 분석 결과의 나머지를 완료 것입니다 셀 플레이트를 삽입 합니다. 530에서 산소 역학 측정 nm (여기) / 650nm (방출), 470에 양성자 농도 측정은 nm (여기) / 530 nm (방출).</li>
</ol>4입니다. 미토 콘 드리 아 기능 데이터의 정규화
<ol><li>셀 확산 분석 결과 솔루션 준비 (대략적인 소요 시간: 5 분).<ol>
<li>48 μ 핵 산 얼룩 (500 x)와 240 μ 배경 억압 11.7 mL PBS 추가 (2 배). 핵 산 얼룩 셀 permeant DNA 바인딩 염료 이며 배경 억압은 죽은 셀 또는 셀에서 얼룩이 되 고 손상 된 세포 막 무결성을 차단 마스크 염료. DNA 묶는 염료와 배경 억압의 조합은 라이브 셀은 스테인드 보장 합니다.</li>
		<li>미토 스트레스 테스트 완료 된 후에 각 잘 매체에 직접 작업 솔루션 (180 μ) x 2의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>45-60 분 계량 508에서 플레이트 리더에 라이브 셀 (형광)의 수에 대 한 37 ° C 배양 기에서 세포 확산 분석 결과 솔루션의 셀을 품 어 nm (여기) / 527 nm (방출) OCR 데이터를 정규화 (대략적인 소요 시간: 10 분) . 참고: 숫자 라이브 셀 이외에 선택할 수 있습니다 또한 셀의 총 수, 핵 산, 단백질 농도, 등등의 그들의 데이터를 정상화.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

암 환자의 피로 잘 정의 되지 않은 또는 특징1쇠 약 조건입니다. 피로의 진단은 전적으로 주관적인 보고에 의존 하며 현재 진단 표준 또는 그것의 pathobiology2에 대 한 이해의 부족 때문에 주로이 조건에 대 한 치료. 암 환자에서 피로 기본 제안 된 메커니즘의 미토 콘 드 리아 기능에서 장애는 가장 치료 대상 경로 중 하나입니다. 따라서, 우리 임상 샘플 사전 개발을 일찍 피로를 포함 하 여 암 치료 관련 독성 위험 환자를 식별 하는 데 사용할 수 있는 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하기 위한 신속 하 고 실용적인 방법을 개발 관리는 제정 될 수 있다.
호흡 억제제의 순차 주사와 함께에서 세포 외 유출 기술 미토 콘 드 리아 기능 상태 평가 대 한 허용 사용 되었습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo 모델19...

피로 암 환자1의 삶의 질에 부정적인 영향이 우세 하 고 비참 한 상태 이다. 이 날짜에 암 피로 가난 하 게 정의 된 유적과 환자2주관적인 보고에 의존. 따라서, 객관적 임상 설정3,4에서 피로 특성을 쉽게 적응 진단 실험실 테스트를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다.
미토 콘 드리 아 기능 장애를 포함 하 여 여러 기본 메커니즘을 피로5제안 되었습니다. 미토 콘 드리 아 발전소 세포, 산화 인 산화를 통해 세포 에너지의 95%를 제공 하 고 칼슘 신호, apoptosis, 면역 신호 및 다른 세포내 신호 이벤트6 의 규칙에 중요 한 역 . 따라서 장애인된 미토 콘 드리 아 생체 및 결함 에너지 생산에 피로에 기여할 수 있습니다. 이 가설을 지원, 이전 연구는 만성 피로 증후군7환자에서 미토 콘 드리 아 DNA에 돌연변이 관찰. 피로의 병 태 생리 기원 중앙 신경 조직 또는 주변 조직, 골격 근육8,9, 같은 거짓말 여부 불분명 남아 있지만 방법은 현재 없습니다 직접 정확 하 게 평가 하 미토 콘 드 리아 기능 장애, 다 셀에 피로 관련 된.
미토 콘 드리 아 기능 연구에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 첫째, PBMCs는 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있으며 기본적인 실험 기법을 사용 하 여 신속 하 게 격리 될 수 있습니다. 둘째, 혈액 컬렉션 수집 근육 생 검 등 다른 조직 보다 적게 침략 적 이다. 따라서, 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다 동일한 환자에서 반복적으로 시간이 지남에, 치료 효과의 경도 평가 용이. 흥미롭게도, PBMCs에서 미토 콘 드리 아 기능 동물 모델10신장 미토 콘 드 리아 상태와 상관 잘 될 것으로 보인다. 또한, 면역 세포 미토 콘 드리 아 다른 질병 조건11,12에서 조직의 변화를 탐지 하기 위한 프록시로 사용 되었습니다. 순환 하는 면역 세포에서 미토 콘 드리 아 특히 면역성이 있는 기능에 있는 변화에 과민 하 고 면역 신호 분자 cytokines13,,1415같은 있습니다. 예를 들어 류 마티스 급성 염증 성 질병을 가진 환자에서 PBMCs 높은 기준선 산소 소비14전시 관찰 되었습니다. 반면, 산소 소비는 패 혈 증16를 포함 하 여 조직의 염증 상태 환자에서 분리 된 PBMCs에서 감소 되었다. 염증 성 조건 하에서 자유 래 디 칼 역 기능 mitochondria 제작한 더 높은 산화 스트레스와 장기 염증17에 기여할 수 있습니다. 산화 긴장에서 뿐만 아니라 에너지 생산에 미토 콘 드리 아의 역할 암 환자 13피로 공부에 대 한 프록시로 미토 콘 드리 아 기능을 사용 하 여 잠재적인 유틸리티를 나왔다.
생 화 확 적인 기술, 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정, 또는 임상 설정5, 에서 쉽게 적응 되지 않을 수 있습니다 특정 세포 인구의 절연을 활용 하는 미토 콘 드리 아 기능을 검사 하는 이전 연구 14,18. 최근 몇 년 동안, 세포 외 유출 분석 실험의 개발 연구자를 쉽게 허용 하 고 정확 하 게 응답 호흡 억제제19,20 의 자동된 주입으로 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 검사 , 21 , 그러나 22., 이러한 연구의 대부분은 특정 세포 유형에 대 한 디자인과 높은 처리량 대형 임상 설정에 적용 되지 않을 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 임상 사용에 대 한 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하기 위한 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>CPT 단핵 세포 준비 튜브&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>정맥 절개술 후 PBMC를 분리하기 위한</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td>의 성장 배지 제작<td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>PBMCs</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td>의 성장 배지 제작, <td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>세포 및 조직 접착 용액의 성장 배지 제작, 현탁 세포가 표면에</td></tr> <tr><td>부착할 수 있도록 합니다.Seahorse XF Calibrant 솔루션</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>하이드레이팅 카트리지용</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (미니플레이트 및 센서 카트리지)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>XFp 세포 배양 미니플레이트 및 센서 카트리지 포함</td></tr><tr><td>XF 기본 배지</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>XF 분석 매체</td></tr><tr><td>45% 세포 배양 D-(+)-포도당 용액</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>XF 제조용 분석 매체</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산 용액</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>XF 분석 매체</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td> 제조용 <td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>XF 분석 매체 제조용</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>올리고마이신, FCCP, 항마이신 A/로테논</td></tr><tr><td>함유 CyQUANT 직접 세포 증식 분석</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>살아있는 세포의 정량화 및 데이터 정규화용</td></tr><tr><td>Seahorse XFp 분석기</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>살아있는 세포의 미토콘드리아 기능 측정용</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(또는 플레이트의 형광 세포를 정량화할 수 있는 모든 기기)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>살아있는 세포의 정량화 및 데이터 정규화</td></tr></tbody></table>

암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

피로 공통 이며 조건에 영향을 미치는 대부분의 암 환자를 쇠 약. 날짜 하려면, 피로 남아 제대로 없는 진단 특징을 객관적으로 측정이 상태의 심각도 테스트 합니다. 여기는 PBMCs 피로 암 환자에서 수집의 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하기 위한 최적화 방법에 설명 합니다. 조밀한 extracellular 플럭스 시스템 및 호흡 저 해제의 순차 주사를 사용 하 여, 우리 검사 PBMC 미토 콘 드 리아 기능 상태 측정 기저 미토 콘 드리 아 호흡, 예비 호흡기 용량 및 에너지 표현 형, 설명 스트레스에 대응 하는 기본 에너지 통로. 신선한 PBMCs 표준 정을 사용 하 여 임상 설정에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 전체 분석 결과 복잡 한 생 화 확 적인 기술의 참여 없이 4 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 또한,는 재현할 수 데이터를 얻기 위해 필요한 정규화 방법에 설명 합니다. 간단한 절차 및 정규화 방법 제시 동일한 환자 및 잠재적인 치료 효과 평가 하는 시간 포인트 사이 비교 될 수 있는 재현 가능한 데이터의 생성에서 반복된 샘플 컬렉션에 대 한 허용.

미토 스트레스 테스트는 완전 한 미토 콘 드리 아 프로 파일을 매핑하는 데 다양 한 호흡 억제제의 순차 주사 후 산소 소비 속도 (OCR) 측정에 의존 합니다. 미토 콘 드리 아 건강에 관련 된 OCR 측정 후 각 약물 주입 다음 매개 변수를 계산 하는 데 사용 수: 기저 OCR 은 먼저 쉬고 레벨 ATP 수요를 충족 하는 데 필요한 산소 소비를 평가 하기 위해 어떤 약물 주입 하기 전에 측정. 기초 호흡 oligomycin 주입 전에 OCR 기준선에서 비-미토 콘 드리 아 호흡 속도 빼서 계산 됩니다. 다음, oligomycin ATP synthase (복잡 한 V)의 양성자 채널을 억제 하기 위해 주입 됩니다. Oligomycin 주입 후 OCR에 후속 드롭 ATP 생산 관련 산소 소비를 나타냅니다. FCCP (Carbonyl 시안 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), 양성자...

우리의 목표는 암 환자의 피로와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애를 평가 하는 실용적인 프로토콜을 개발 했다. 이 혁신적인 프로토콜 임상 사용 관련 표준 정 및 기본적인 실험실 절차에 최적화 되어 있습니다.

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

이 절차의 전반적인 목표는 암 환자의 피로와 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 것입니다. 이 방법은 방사선 치료를 받은 후 암 환자의 미토콘드리아 기능 장애가 피로와 관련이 있는지 여부와 같은 지지 암 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 덜 침습적이며 암 치료로 인한 독성 위험이 있는 환자를 식별하기 위해 클리닉에서 쉽게 사용할 수 있다는 것입니다.이 기술은 암 관련 피로 비트에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 평가를 개선하고 관리를 최적화할 수 있습니다. 이 방법은 암 관련 피로의 기저에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 대사 및 요변 염증 상태와 같은 다른 뚱뚱한 질병 상태에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 사전 시각적 시연 없이 센서 카트리지의 각 포트에 호흡 억제제를 적절하게 주입하는 것이 어려울 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 postbac 펠로우인 Mr. Quang Nguyen이 될 것입니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 먼저 패키지에서 제거하십시오. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 보정 용액을 추가합니다.또한 각 해자를 400마이크로리터의 캘리브런트 용액으로 채웁니다. 그런 다음 센서 플레이트를 유틸리티 플레이트에 다시 넣고 밤새 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에서 카트리지에 수분을 공급하기 시작합니다. 만성 질환 치료의 13개 항목 기능 평가를 기반으로 피로 수준을 측정합니다.기준선, 중간점, EBRT 완료 시 및 EBRT 후 1년에서의 피로. 먼저 미토콘드리아 기능 측정을 위한 분석 배지를 준비합니다. 매체를 준비한 후 섭씨 37도까지 예열하고 pH를 7.4로 조정합니다.실험 당일에 분석 매체를 준비하고 PH를 7.4로 조정하기 전에 37도까지 예열하는 것이 중요합니다. 다음으로, 80-90%의 포화도를 달성하기 위해 각 유정에 PBMC를 파종합니다. 그런 다음 세포가 웰 바닥에 부착되도록 200회 g에서 2분 동안 플레이트를 돌립니다.스핀 후 각 웰에서 매체를 제거하고 분석 매체로 웰을 한 번 헹굽니다. 배경 웰을 포함한 각 웰에 180마이크로리터의 분석 배지를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 45-60분 동안 플레이트를 배양합니다.약물을 재구성하려면 약물에 252마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 올리고마이신의 50마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다. 약물에 288마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 FCCP의 50마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다. 마지막으로 216마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 항마이신 a/로테논의 25마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다.세 가지 약물을 모두 재구성한 후 약물 현탁액을 1분 동안 와류로 만든 다음 작업 용액을 희석합니다. 그런 다음 포트 A에서 20마이크로리터의 10마이크로몰 올리고마이신을 각 웰에서 1마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다. 다음으로 포트 B에서 22마이크로리터의 10마이크로몰 FCCP를 각 웰에서 1마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다.마지막으로, 포트 C에서 25마이크로리터의 5마이크로몰 안티마이신 a/로테논을 각 웰에서 0.5마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다. 그런 다음 세포외 플럭스 기기에서 Mito Stress Test를 선택합니다. 그런 다음 기기 프롬프트에 따라 센서 카트리지를 삽입합니다.기기는 자동으로 센서 보정을 수행합니다. 보정이 완료되면 기기용 셀 플레이트를 삽입하여 나머지 분석을 완료합니다. 세포 증식 분석 용액을 준비하려면 1.405ml의 인산염 완충 식염수에 5.76마이크로리터의 핵산 염색제와 28.8마이크로리터의 백그라운드 억제제를 추가합니다.Mito Stress Test가 끝나면 각 웰의 매체에 180마이크로리터의 2x 작업 용액을 직접 추가합니다. 그런 다음 세포 증식 분석 용액으로 세포를 섭씨 37도에서 45-60분 동안 배양합니다. 508나노미터 여기(excitation) 및 527나노미터 방출(emmission)에서 플레이트 리더의 살아있는 세포 수를 정량화한 후 OCR 데이터를 정규화합니다.FCCP 적정을 수행할 때 1마이크로몰은 PBMC 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 사용되는 최적의 약물 농도입니다. 미토콘드리아 호흡과 새로 분리된 PBMC를 조사한 결과, OCR은 3시간부터 감소하기 시작하여 8시간까지 계속됩니다. 그러나 FCCP 주사에 의해 유도된 최대 호흡도 기초 OCR 수준을 초과하지 않습니다.여기에서는 세포가 건강한 두 개체로부터 분리되는 미토콘드리아 기능의 정상화가 표시됩니다. 실제로, 녹색 형광 DNA 결합 염료로 대표되는 살아있는 세포로 정규화된 OCR은 건강한 두 개체에서 모두 유사합니다. 실제로, 건강한 피험자와 피험자 간에 기초 OCR에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.그러나 피로한 피험자는 대조군에 비해 최대 산소 소비량과 예비 호흡 용량이 감소한 것으로 나타났습니다. 미토콘드리아 및 ATP와 관련된 비 미토콘드리아 및 ATP 관련 산소 소비량 또는 건강한 피험자와 피곤한 피험자 간의 결합 효율에는 차이가 발견되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 먼저 최적의 세포 밀도와 FCCP 농도를 결정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 세포 유형에 초점을 맞춘 향후 기계론적 연구를 안내하기 위해 다른 세포 집단을 분리하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 지지 치료 분야의 연구자들이 피로한 암 환자에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 미토콘드리아 기능 및 임상 샘플을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 피로를 포함한 암 치료 관련 독성이 발생할 위험이 있는 환자를 사전에 식별하는 데 사용할 수도 있습니다. 올리고마이신(oligomycin) 및 로테논(rotenone)과 같은 호흡기 억제제를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 말자. 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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