암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

이 절차의 전반적인 목표는 암 환자의 피로와 관련된 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 것입니다. 이 방법은 방사선 치료를 받은 후 암 환자의 미토콘드리아 기능 장애가 피로와 관련이 있는지 여부와 같은 지지 암 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 덜 침습적이며 암 치료로 인한 독성 위험이 있는 환자를 식별하기 위해 클리닉에서 쉽게 사용할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 암 관련 피로 비트에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 평가를 개선하고 관리를 최적화할 수 있습니다. 이 방법은 암 관련 피로의 기저에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 대사 및 요변 염증 상태와 같은 다른 뚱뚱한 질병 상태에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 사전 시각적 시연 없이 센서 카트리지의 각 포트에 호흡 억제제를 적절하게 주입하는 것이 어려울 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 postbac 펠로우인 Mr. Quang Nguyen이 될 것입니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 먼저 패키지에서 제거하십시오. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 보정 용액을 추가합니다.

또한 각 해자를 400마이크로리터의 캘리브런트 용액으로 채웁니다. 그런 다음 센서 플레이트를 유틸리티 플레이트에 다시 넣고 밤새 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에서 카트리지에 수분을 공급하기 시작합니다. 만성 질환 치료의 13개 항목 기능 평가를 기반으로 피로 수준을 측정합니다.

기준선, 중간점, EBRT 완료 시 및 EBRT 후 1년에서의 피로. 먼저 미토콘드리아 기능 측정을 위한 분석 배지를 준비합니다. 매체를 준비한 후 섭씨 37도까지 예열하고 pH를 7.4로 조정합니다.

실험 당일에 분석 매체를 준비하고 PH를 7.4로 조정하기 전에 37도까지 예열하는 것이 중요합니다. 다음으로, 80-90%의 포화도를 달성하기 위해 각 유정에 PBMC를 파종합니다. 그런 다음 세포가 웰 바닥에 부착되도록 200회 g에서 2분 동안 플레이트를 돌립니다.

스핀 후 각 웰에서 매체를 제거하고 분석 매체로 웰을 한 번 헹굽니다. 배경 웰을 포함한 각 웰에 180마이크로리터의 분석 배지를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 45-60분 동안 플레이트를 배양합니다.

약물을 재구성하려면 약물에 252마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 올리고마이신의 50마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다. 약물에 288마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 FCCP의 50마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다. 마지막으로 216마이크로리터의 분석 배지를 추가하여 항마이신 a/로테논의 25마이크로몰 스톡 용액을 생성합니다.

세 가지 약물을 모두 재구성한 후 약물 현탁액을 1분 동안 와류로 만든 다음 작업 용액을 희석합니다. 그런 다음 포트 A에서 20마이크로리터의 10마이크로몰 올리고마이신을 각 웰에서 1마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다. 다음으로 포트 B에서 22마이크로리터의 10마이크로몰 FCCP를 각 웰에서 1마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다.

마지막으로, 포트 C에서 25마이크로리터의 5마이크로몰 안티마이신 a/로테논을 각 웰에서 0.5마이크로몰의 최종 농도로 피펫팅합니다. 그런 다음 세포외 플럭스 기기에서 Mito Stress Test를 선택합니다. 그런 다음 기기 프롬프트에 따라 센서 카트리지를 삽입합니다.

기기는 자동으로 센서 보정을 수행합니다. 보정이 완료되면 기기용 셀 플레이트를 삽입하여 나머지 분석을 완료합니다. 세포 증식 분석 용액을 준비하려면 1.405ml의 인산염 완충 식염수에 5.76마이크로리터의 핵산 염색제와 28.8마이크로리터의 백그라운드 억제제를 추가합니다.

Mito Stress Test가 끝나면 각 웰의 매체에 180마이크로리터의 2x 작업 용액을 직접 추가합니다. 그런 다음 세포 증식 분석 용액으로 세포를 섭씨 37도에서 45-60분 동안 배양합니다. 508나노미터 여기(excitation) 및 527나노미터 방출(emmission)에서 플레이트 리더의 살아있는 세포 수를 정량화한 후 OCR 데이터를 정규화합니다.

FCCP 적정을 수행할 때 1마이크로몰은 PBMC 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 사용되는 최적의 약물 농도입니다. 미토콘드리아 호흡과 새로 분리된 PBMC를 조사한 결과, OCR은 3시간부터 감소하기 시작하여 8시간까지 계속됩니다. 그러나 FCCP 주사에 의해 유도된 최대 호흡도 기초 OCR 수준을 초과하지 않습니다.

여기에서는 세포가 건강한 두 개체로부터 분리되는 미토콘드리아 기능의 정상화가 표시됩니다. 실제로, 녹색 형광 DNA 결합 염료로 대표되는 살아있는 세포로 정규화된 OCR은 건강한 두 개체에서 모두 유사합니다. 실제로, 건강한 피험자와 피험자 간에 기초 OCR에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.

그러나 피로한 피험자는 대조군에 비해 최대 산소 소비량과 예비 호흡 용량이 감소한 것으로 나타났습니다. 미토콘드리아 및 ATP와 관련된 비 미토콘드리아 및 ATP 관련 산소 소비량 또는 건강한 피험자와 피곤한 피험자 간의 결합 효율에는 차이가 발견되지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 먼저 최적의 세포 밀도와 FCCP 농도를 결정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 세포 유형에 초점을 맞춘 향후 기계론적 연구를 안내하기 위해 다른 세포 집단을 분리하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 지지 치료 분야의 연구자들이 피로한 암 환자에서 미토콘드리아 기능 장애의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미토콘드리아 기능 및 임상 샘플을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 피로를 포함한 암 치료 관련 독성이 발생할 위험이 있는 환자를 사전에 식별하는 데 사용할 수도 있습니다. 올리고마이신(oligomycin) 및 로테논(rotenone)과 같은 호흡기 억제제를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 말자. 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.