심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

이 기술은 뱀 독 심장 독소의 근육 내 주입의 조합을 허용, 자기 전달 siRNA의 근육 내 주입, 따라서 골격 근육의 재생의 분석을 허용. 자가 전달 siRNA의 응용 프로그램은 근육 재생 중 단일 유전자의 기능적 손실을 조사하는 우아한 방법이며, 이를 통해 형질전환 동물을 피한다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 무릎에서 발에 두개골 하반신의 주입 영역을 면도하고, 느슨한 머리를 제거합니다.

살균 수술 천으로 덮인 헤딩 패드에 마우스를 배치하고 70 %의 에탄올을 사용하여 두개골 하반신의 주입 영역을 소독하십시오. 다음으로, 29 게이지 바늘이 장착된 인슐린 주사기를 적재하고, 50마이크로리터20 마이크로리터를 심장독소로 만들고, 피부에 완전히 관통하여 무릎에 말살합니다. 바늘이 제자리에있을 때, 근육의 전체 길이를 따라 10-20 초 전달 기간 동안 심장 독소를 주입하고 바늘을 앞뒤로 움직이면서 심장 독소의 균일 한 분포를 허용하여 전체 티비알 전방 근육을 손상시다.

그런 다음 전체 재조정까지 모니터링과 가열 패드에 케이지에 마우스를 반환합니다. 수술 후 3 일, 그냥 입증 된 대로 주사 영역을 소독. 마취 마우스의 티비알리스 전방 근육에 관심있는 표적 유전자에 대해 지시된 최대 50개의 소RNA를 주입합니다.

그런 다음 마우스를 케이지로 되돌리고 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링합니다. 부상당한 근육 조직을 수집하기 전에 연필 주위에 호일을 감싸고 연필을 테이프로 밀봉하여 금형의 바닥이 균일하고 닫힌 표면을 제공합니다. 곰팡이가 준비되면 동물 전체를 70%에탄올로 소독하고 날카로운 가위를 사용하여 발목의 피부를 제거합니다.

근육을 수확하기 전에 미세 한 집게를 사용하여 부상당한 다리의 발목의 경골 뼈 옆의 근막을 꼬집어 무릎쪽으로 집게를 움직여 심장근을 찢어 내고 티비알리스 전방 근육을 노출시하십시오. 티비알리스 전방 근육을 분리하려면, 탈면 힘줄을 노출하고, 미세 한 집게로 힘줄을 잡아. 힘줄을 잘라 봄 가위를 사용 하 여, 무릎쪽으로 근육을 당기기 위해 힘줄에 근육을 파악.

중간 배 영역의 분석을 허용하려면, 직선 가위를 사용하여 중간 배 부위의 티비알리스 전방 근육을 동일한 크기의 두 반으로 자르고 연필 금형을 동결 용액으로 반쯤 채웁니다. 티비알리스 전방 근육의 두 반쪽을 직립 된 위치에 있는 동결 금형에 삽입하고 중간 배 영역은 곰팡이의 바닥을 향합니다. 집게를 사용하여 동결 금형을 액체 질소로 반으로 옮긴다.

동결 매체가 투명에서 흰색으로 변하고 고체가 되면 동결 금형을 섭씨 80도까지 옮기거나 향후 처리를 위해 얼음을 건조시합니다. 대조군 근육에서, 조직의 건축은 심섬유의 주변에 핵의 국소화에 의해 관찰된 바와 같이, 그대로 남아 있으며, 간질 공간 내에서 단핵세포의 축적부족. 심장 독소 매개 부상 후 7 일, 새로운 심근 섬유는 중앙에 위치한 핵에 의해 표시로 형성된다, 위성 세포의 주로 구성 단핵 세포의 축적, 뿐만 아니라 면역 세포와 같은 비 mymyogenic 세포.

휴식 조건에서, 위성 세포는 Pax7 붉은 색으로 염색, 기저 라미나 아래에 위치 하 고 있습니다., 여기에 녹색으로 표시. 부상 후 3 일, 위성 세포의 수가 증가하고, 위성 세포는 더 이상 기저 라미나 아래에 위치하지 않습니다. 10일 차 부상 후 위성의 수는 여전히 증가하고 있습니다.

재생 과정을 더욱 분석하기 위해 새로 형성된 근섬유는 발달 근신을 향한 항체로 염색될 수 있다. siRNA를 가진 주입 후에 2 일, 위성 세포는 형광 표시 siRNA의 존재를 위해 분석될 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서, 재생 근육에 있는 위성 세포의 대략 75%는 형광표시 siRNA를 위해 양성이었습니다.

더욱이, 재생심섬유의 약 74%는 형광표 siRNA에 대해서도 양성반응을 보였으며, 재생된 심섬유의 74%가 siRNA를 차지했으며, siRNA 양성 위성 세포가 융합되어 새로운 근섬유를 형성하거나 이미 재생성하는 myofibers와 융합이 발생하였다. 가장 중요한 단계는 티비알리스 전방 근육의 완전한 부상을 달성하는 것입니다. 조직학적 분석 외에도 생성된 힘과 같은 파라미터는 기능적인 방식으로 골격 근의 재생을 분석하기 위해 기록될 수 있다.