싱크로트론 마이크로 CT를 위한 고처리량 피질 뼈 샘플 조달 및 분석을 위한 단면, 코링 및 이미지 처리 가이드

싱크로트론 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 위한 뼈 표본 조달과 관련된 사용 가능한 데이터는 여전히 희박합니다. 우리의 포괄적인 튜토리얼은 간단하고 파괴를 최소화하며 비용 효율적인 방법론을 제공합니다. 일관된 치수와 원통형 모양의 뼈 표본을 확보하는 것은 결과 데이터 세트가 최고 품질이고 결과를 적용 가능하게 하는 데 중요합니다.

이 원고에 기술된 기술은 암석, 화석 또는 단단한 물질에 코어를 채취하기 위해 적용할 수 있다. 우리는 이를 사용하여 지구의 지각과 상부 맨틀의 유변학을 탐구하기 위한 고압 실험을 위해 균일한 크기의 암석과 단결정 코어를 수집했습니다. 초보 코어러는 뼈 표본이 원뿔 모양을 형성하는 것을 알 수 있습니다.

이 문제는 드릴 비트에서 뼈 가루가 흘러나올 수 있는 적절하고 충분한 시간을 허용하고 코어링 속도를 늦춤으로써 해결할 수 있습니다. 싱크로트론 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 위한 뼈 표본 조달을 보여주고 논리적 분석을 보여주는 교육용 텍스트와 비디오가 부족합니다. 단계별 뼈 준비 튜토리얼은 이 간극을 메우는 데 도움이 됩니다.

최대 섭씨 140도의 핫플레이트에 75 x 25mm 유리 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드 중앙에 충분한 양의 열 에폭시 수지를 녹입니다. 뼈 블록의 아래쪽 측면을 슬라이드에 수직인 뼈의 길이로 현미경 슬라이드의 열 에폭시 수지로 누릅니다. 뼈의 아래쪽을 코팅하고 안정적인 접착을 보장하기 위해 샘플을 앞뒤로 이동합니다.

장착된 시편을 약 5분 동안 핫 플레이트에 올려 놓고 열 에폭시가 모공과 균열로 흡수되도록 하여 슬라이드의 에폭시에 기포가 없는지 확인합니다. 기포가 있는 경우 샘플을 앞뒤로 이동하여 제거합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 핫 플레이트에서 장착된 표본이 있는 슬라이드를 제거하고 약 10분 동안 실온에서 냉각시킨 다음 면도날로 슬라이드 가장자리의 에폭시를 제거하여 척이 슬라이드를 적절하게 잡도록 합니다.

접착된 샘플이 있는 슬라이드를 유리 슬라이드 척에 부착하고 저속 절단 톱의 회전 암에 척을 장착하여 뼈의 단면이 길이에 수직으로 절단될 수 있도록 배치합니다. 스위블 암을 조정하여 블레이드가 샘플과 접촉하고 횡단하도록 합니다. 절단 암의 무게에 대응하기 위해 절단 암의 반대쪽에 추를 추가하고 유체 용기에 증류수와 절삭유를 추가합니다.

다이아몬드 웨이퍼 블레이드를 단단히 고정하고 유체 레벨이 블레이드의 절단 부분에 잠기도록 합니다. 속도를 200RPM으로 설정하고 샘플을 블레이드 위로 천천히 내립니다. 톱이 절단을 시작하면 날과 척이 흔들리거나 튀지 않는지 확인하십시오.

그렇다면 즉시 톱을 멈추고 블레이드 또는 척 암 어셈블리를 조입니다. 척이 공격적으로 위아래로 움직이는 경우 균형추를 더 추가하십시오. 첫 번째 두꺼운 단면은 각 추가 절단과 평행하게 잘 정의된 표면을 제공하는 폐기물 절단입니다.

초기 폐기물 절단 후 스위블 암을 올리고 포지셔닝 다이얼을 사용하여 척을 블레이드 쪽으로 5mm 이동합니다. 절편이 완료된 후 장착된 시편과 함께 유리 슬라이드를 핫 플레이트에 올려 열 에폭시를 녹입니다. 앞서 설명한 열 에폭시 접합 기술을 사용하여 얕은 알루미늄 주석의 바닥에 5mm의 뼈 단면을 장착합니다.

밀 드릴 프레스의 XY 기계 테이블에 주석을 놓고 고정 클램프를 손으로 조입니다. 2 밀리미터 안 직경 빈 갱구 보석상, 다이아몬드에 의하여 기울어지는 응어리를 빼는 드릴용 날을 선반 교련 물림쇠로 삽입하고 주석을 통해서 응어리를 빼는 것을 막기 위하여 깊이 제한기를 조정하십시오. 뼈 샘플의 중앙 앞쪽을 드릴 비트 아래에 정렬하면서 골막과 골 또는 섬유주가 많이 발달된 영역과의 밀접한 접촉을 피합니다.

주석에 증류수를 채워 샘플을 완전히 덮으면 열 축적, 샘플의 연소 및 코어링 중 드릴 비트 손상을 방지할 수 있습니다. 밀 드릴 프레스는 적절한 안전 조치를 취하지 않으면 위험할 수 있습니다. 작업자는 보안경을 착용하고, 헐렁한 옷을 단단히 고정하고, 긴 머리를 뒤로 당겨 스핀들에 걸리지 않도록 해야 합니다.

코어 비트와 뼈 사이의 처음 몇 번의 접촉은 뼈의 상부 표면에 링을 착용하기 위해 부드러운 압력을 가합니다. 이것은 코어링 프로세스 시작 시 드릴 비트의 처짐을 방지하고 비트의 올바른 배치를 보장합니다. 코어링하는 동안 드릴 비트를 샘플 안팎으로 들어 올리고 비트의 팁을 물 표면 아래에 두십시오.

몇 초마다 이 작업을 수행하여 갇힌 뼈 먼지를 씻어내고 파편이 드릴 비트를 막지 않도록 합니다. 응어리를 빼는 것이 완료된 후에, 유래하는 뼈 중핵은 빈 줄기가 있는 드릴 비트에서 박히게 될지도 모릅니다. 끝이 가는 집게 한 쌍이나 작은 육각 렌치를 사용하여 비트에서 코어를 제거합니다.

이미징할 때까지 서늘하고 건조한 장소의 라벨링된 미세 원심분리기 튜브에 코어드 샘플을 보관하십시오. 설명된 코어 샘플링 방법은 매우 효과적이고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 코어드 샘플과 로터리 도구를 사용하여 얻은 샘플의 이미지 처리 워크플로우를 비교하는 대표적인 그림이 여기에 나와 있습니다.

일반적인 회전 도구를 사용하여 절단한 샘플은 코어드 샘플과 비교할 때 근관과 틈새의 수가 증가하고 평균 근관 직경, 근관 부피 및 피질 다공성이 감소했습니다. 이 표는 각 샘플에 대한 다공성 데이터를 보여줍니다. 코어링 프로토콜은 싱크로트론 마이크로컴퓨터 단층 촬영 스캔에서 관찰되는 아티팩트를 감소시키지만, 직선 뼈 블록 실험에서 아티팩트가 많은 낮은 품질의 수치는 다면적인 문제를 나타냅니다.

후속 이미지 처리는 피질 뼈 미세 구조의 시각화를 개선하는 기술의 잠재력을 확인했습니다. 예를 들어, 광물화(mineralization) 차이, 골 경계(osteonal bound)의 개선된 묘사, 혈관(vascular canal) 내 연조직의 일관된 시각화가 관찰되었습니다. 천천히 진행하는 것이 일관된 크기의 원통형 샘플을 얻는 열쇠입니다.

너무 빨리 가면 시편이 원통형이 아닌 원뿔 모양이 될 수 있습니다. 코어링을 위해 두꺼운 절편을 확보하는 동안 명시야 또는 컨포칼 현미경 검사를 위해 더 두꺼운 절편을 수집할 수 있습니다. 이를 통해 이관 네트워크를 시각화할 수 있습니다.