Name: 싱크로트론 마이크로 CT를 위한 고처리량 피질 뼈 샘플 조달 및 분석을 위한 단면, 코링 및 이미지 처리 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 인간 대퇴골에서 최소 침해 방식으로 피질 뼈 샘플을 채취하고 싱크로트론 마이크로 CT로 고품질 영상을 얻는 방법을. 이 기법은 이미징 아티팩트를 줄여 뼈 미세구조 시각화를 개선합니다.

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이 논문에 설명된 연구는 캐나다 혁신, 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 서스 캐처 원 대학, 서스 캐처 원 정부, 서부 경제 다각화 캐나다, 캐나다 국립 연구위원회 및 캐나다 보건 연구소의 캐나다 혁신 재단이 지원하는 캐나다 광원의 BMIT 시설에서 수행되었습니다. 저자는 캐나다 광원의 빔 라인 과학자, 특히 아담 웹, 데니스 밀러, 세르게이 가질로프, 닝 주 스카이스캔 SRμCT 및 백색 빔 현미경 시스템의 설정 및 문제 해결에 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 대한 cadaveric 견본에 접근을 위한 Toledo 의과 대학의 대학 및 박사 제프리 웬스트루프에서 베스 달젤에게 감사드립니다. JM Andronowski는 애크런 대학과 형사 사법 목적 부여를위한 법의학 과학의 국립 사법 연구 개발 연구소 (2018-DU-BX-0188)에서 제공하는 창업 연구 기금을 통해 지원됩니다. RA 데이비스는 애크런 대학에서 제공하는 대학원 보조에 의해 지원됩니다. 코링 과 톱질에 사용되는 장비와 공급은 아크론 대학과 NSF가 CW 홀리오크에 EAR-1624242를 부여하는 스타트업 기금에 의해 구입되었습니다.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

제한된 FOV 설정을 갖춘 고해상도 SRμCT 이미징을 위한 균일한 및 원통형 피질 뼈 코어 샘플을 조달하기 위한 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 없었습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 SRμCT 이미징에 대한 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 샘플을 조달하는 방법과 미세 건축 데이터의 후속 정확한 시각화 및 추출에 대한 포괄적인 자습서를 제공함으로써 무효화를 채웁니다. 당사의 프로토콜은 임의 차원의 직선 골격 블록을 절개하는 이전 설명보다 피질 뼈 코어를 조달하기 위한 보다 표준화되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 핸드헬드 로터리 도구(예를 들어, Dremel)에 의존하여 불규칙한 크기의 뼈 블록을 제거하는 연구자들은 분석 중에 이미징 중에 훨씬 더 긴 샘플 설정 시간을 경험하고 분석 중에 임계값 및 피질 모공 추출에 더 큰 오류를 경험할 수 있습니다. 이러한 불일치는 뼈 샘플 준비, 후속 시각화 및 분석 및 해석 결과와 관련하여 이 표준화된 프로토콜의 필요성과 중요성을 강조합니다.
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이미징 기술의 최근 발전으로, 지금 매우 높은 해상도의 X 선 이미징 데이터를 취득하는 것이 가능합니다. 데스크탑 마이크로 CT(μCT) 시스템은 비파괴적 특성1로인해 방수 골격을 이미징하는 현재 표준입니다. 그러나 피질 뼈의 미세 구조 적 특징을 이미징 할 때 μCT 사용은 더 제한적이었습니다. 해상도 제약으로 인해 데스크톱 시스템은 골세포 라쿠나에 같은 피질 모공보다 작은 미세 구조 적 특징을 이미지하는 데 필요한 해상도를 달성할 수 없습니다. 이 응용 프로그램의 경우 SRμCT는 이러한 시스템1의해상도가 커지므로 이상적입니다. 예를 들어, 생물 의학 이미징 및 치료 (BMIT) 빔 라인2에 캐나다 광원 (CLS)에서 실험은 0.9 μm만큼 작은 복셀이미지를 생산하고있다. 이전 연구1,3,4,5는 인간 긴 뼈(그림 1)에서피질 뼈 표본으로부터 프로젝션및 후속 3차원 (3D)을 획득하기 위해 이 해상도를 사용하여 골구세포 라부나 밀도4,6,7,9및라쿠나 모양및 크기3의 변화및 성간 사이의 변화. 추가 연구는 인간에서 골연 밴딩의 존재를입증했다 10,이전에 법의학 인류학 문헌에서 비 인간 포유동물과 연관된 것으로 인식 되는 현상.
뛰어난 해상도를 달성하기 위해 X선 빔은 최대 시편 크기를 직경 이내로 제한하는 시야(FOV) 내에 미세하게 초점을 맞추어야 합니다. 현재, 이러한 제한을 충족하는 뼈 샘플 조달을 요약하는 문헌에 설명된 포괄적이고 표준화된 절차는 없었습니다. FOV 내의 중심 표본은 1) 이미징 중에 180°를 회전할 때 샘플이 중심을 유지하고 2) 스캔 아티팩트가 이미지 잘림이 없기 때문에 제한되도록 하는 것이 중요합니다. 즉, FOV 외부의 시료의 어떤 부분도 FOV 내부의 초점으로 들어가는 빔을 방해하지 않는다. 이 경우 재구성 알고리즘은 완전히 올바른 재구성에 필요한 일부 감쇠 데이터가 박탈됩니다. 360° (전체 회전) 스캔빔 경화의 영향을 최소화하지만 이미징 중 정렬 불량 및 샘플 움직임으로 인한 아티팩트를 증가시키는 것은 주목할 가치가 있습니다. 따라서 360° 검사는 일반적으로 더 깨끗한 데이터를 생성하지만 이미징 시간이 두 배가되므로 실험 비용과 데이터 품질 간의 절충안을 해결해야 합니다.
뼈 화상 진찰 실험의 중요하고 수시로 간과되는 양상은 스캐닝의 앞에 수행된 정확하고 복제가능한 견본 준비 기술입니다. SRμCT 방법을 실험에 통합하는 연구는 샘플링 프로토콜을 간략하게 언급하지만 저자는 표본을 수집하는 데 사용되는 특정 방법론에 대해 거의 또는 전혀 세부 사항을 제공하지 않습니다. 많은 연구는 임의 차원의 직선 뼈 블록을 절단 언급하지만, 일반적으로사용되는도구 또는 포함 재료에 대한 자세한 정보를 제공하지3,4,10,11,12,13,14. 일부 연구자들은 일반적으로 핸드헬드 로터리 도구(예를 들어, Dremel)를 사용하여 관심 영역(ROI)3,4,10,11, 12,13,14에서뼈의 직선 블록을 제거한다. 이 방법은 FOV보다 더 큰 균일하게 크기의 샘플을 생성하여 아티팩트 및 이미지 잘림 스캔가능성을 높입니다. 이러한 표본은 종종 정밀 다이아몬드 웨이퍼 톱 (예 : Buehler Isomet)을 사용하여 추가 정제가 필요합니다. 일관된 차원(200/mm)으로 샘플을 조달하는 것은 획득된 데이터 집합이 최고 품질이고 후속 결과가 복제가능한지 확인하는 데 중요합니다.
샘플 조달 방법론의 제한된 보고는 이전 연구에서 수행된 방법을 사용 및/또는 검증하려고 할 때 어려움을 더합니다. 현재 연구원은 샘플링 절차에 대한 자세한 내용은 저자에게 직접 문의해야 합니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 생물 의학 연구자들이 철저히 문서화되고 복제되고 비용 효율적인 샘플링 기술을 제공합니다. 이 문서의 주요 목적은 미세 건축 데이터의 정확한 시각화 및 추출을 위해 밀 드릴 프레스 및 다이아몬드 코링 비트를 사용하여 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 샘플을 조달하는 방법에 대한 포괄적 인 자습서를 제공하는 것입니다. 이 방법은 고압 암석 역학15,16,17,18,19의단단한 재료 블록에서 균일하고 작은 직경 (1-5 mm) 실린더를 일상적으로 수집하는 데 사용되는 절차에서 수정됩니다.

<table><tbody><tr><td>복합재용 1-1/8" 플런지 절단 카바이드</td><td>Warrior</td><td>61812</td><td>28.6mm 플런지</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8201500</td><td>3.8</td></tr>리터 <tr><td>둔탁한 펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>55398</td><td></td></tr><tr><td>Crystalbond 509-3 에폭시</td><td>Ted Pella</td><td>821-3</td><td></td></tr><tr><td>CTAnalyser</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.15.4.0</td><td>https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td></tr><tr><td>Dental Tool Kit</td><td>Amazon</td><td>787269885110</td><td></td></tr><tr><td>복합 재료용 다이아몬드 웨이퍼 톱날</td><td>Buehler</td><td>#11-4247</td><td></td></tr><tr><td>드릴 프레스</td><td>제트 밀/드릴</td><td>350017</td> <td>다운로드 및 설치모델 : JMD-15, 벤치 탑 드릴 프레스는 적절한 대체품이지만 일반적으로 드릴 스템 아래에 샘플을 배치하기위한 번역 가능한 기계 테이블이 없습니다</td></tr><tr><td>파인 팁 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>밀 / 드릴 용 XY 기계 테이블 용 고정 클램프</td><td>MSC Industrial Supply</td> <td># 04804571</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Ted Pella</td><td>26005</td><td>75x50mm 슬라이드, 1mm 두께</td></tr><tr><td>유리 슬라이드 척</td><td>Buehler</td><td>#112488</td><td>75x50mm 유리 슬라이드를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽</td></tr>니다. <tr><td>140도에 도달할 수 있는 핫 플레이트; C</td><td>ThermoScientific</td><td>HP88850105</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>NAPCO</td><td>모델 4200</td><td></td></tr><tr><td>Isocut 유체</td><td>Buehler</td><td>111193032</td><td>윤활제; 30mL</td></tr><tr><td>보석상의 다이아몬드 코어 링 드릴 비트</td><td>Otto Frei</td> <td># 119.050</td><td>2mm 내경 중공 스템 코어 링 비트</td></tr><tr><td>NRecon</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.6.10.2</td><td>https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td></tr><tr><td>진동 톱</td><td>Harbour Freight</td><td>62866</td><td></td></tr><tr><td>오븐용 유리 접시</td><td>Pyrex</td><td>1117715</td><td>Glass 식품 저장 용기</td></tr><tr><td>정밀 저속 톱(Isomet 1000)</td><td>Buehler</td><td>111280160</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Amazon</td><td>25181</td><td></td></tr><tr><td>얕은 알루미늄 깡통</td><td>아마존</td><td>B01MRWLD0R</td> <td>~ 8cm 직경</td></tr><tr><td>표본 컵</td><td>아마존</td><td>616784425436 885334344729</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme 세제</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>1.8kg 상자</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>MTI Corporation</td><td>KJ201508006</td><td></td></tr></tbody></table>

싱크로트론 마이크로 ct를 위한 고처리량 피질 뼈 샘플 조달 및 분석을 위한 단면, 코링 및 이미지 처리 가이드

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

뼈는 인간의 수명 동안 구조에 변화 하는 동적 및 기계적으로 활성 조직. 뼈 리모델링 과정의 제품은 기존의 2차원 기술을 사용하여 실질적으로 연구되었습니다. 데스크톱 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT) 및 싱크로트론 방사선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(SRμCT)을 통한 X선 이미징 기술의 최근 발전은 다른 3D 이미징 기술(예를 들어, SEM)보다 더 큰 시야(FOV)의 고해상도 3차원(3D) 스캔을 획득하여 인간 내 마이크로코픽 구조의 보다 완전한 그림을 제공한다. 그러나 표본은 FOV 내에서 정확하게 중심을 두어 데이터 분석에 영향을 미치는 것으로 알려진 줄무늬 아티팩트의 모양을 제한해야 합니다. 이전 연구는 고르지 못한 가장자리 또는 이미지 잘림으로 인해 이미징 아티팩트를 초래하는 불규칙한 모양의 직선 골 블록의 조달을 보고했습니다. 우리는 인간 페모라의 전방 양으로부터 SRμCT 실험을 위해 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 표본을 조달하기 위해 지질 학적 샘플링 프로토콜 (coring)을 적용했습니다. 이 코링 방법은 효율적이고 조직에 최소한의 파괴적입니다. 균일한 원통형 샘플을 생성하여 회전 시 동포메트릭이 되고 스캔 전반에 걸쳐 X선 빔에 대한 균일한 경로 길이를 제공하는 특성상 이미징 아티팩트를 감소시합니다. 코어및 불규칙한 모양의 샘플의 X선 지형 데이터의 이미지 처리는 피질 뼈 미세 아키텍처의 시각화 및 분석을 개선하는 기술의 잠재력을 확인합니다. 이 프로토콜의 목표는 다양한 유형의 고해상도 뼈 이미징 실험에 적응할 수 있는 피질 뼈 코어추출을 위한 신뢰할 수 있고 반복가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이 작업의 가장 중요한 목표는 저렴하고 일관되며 간단하며 SRμCT를 위한 표준화된 피질 뼈 조달을 만드는 것입니다. 이 절차는 생물학적 인류학, 지구과학 또는 물질 과학과 같은 단단한 복합 물질을 일반적으로 평가하는 관련 분야의 연구원에 의해 더 적응될 수 있습니다.

설명된 코어 샘플링 방법은 매우 효과적이고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 코링 시편은 CLS BMIT-BM 빔라인2의실험을 위해 일관되게 크기의 샘플을 조달할 수 있었으며, FOV는 1.49 μm 복셀 크기로 ~2mm입니다. 코어 직경의 일관성을 검증하기 위해 인간 전방 대퇴코어(n=69)의 하위 집합의 길이(위,중간, 아래)를 따라 세 가지 측정을 수행하였다. 코어의 평균 직경은 1.96 ± 0.11mm였으며, 코어의 길이를 따라 평균 숱이 0.06 ± 0.06 mm/mm로 다른 단단한 복합 재료에 대한 적용성을 강조하기 위해돌로미테(n=32)의 샘플에서 이 방법을 시도하여 평균 직경이 1.06 ± 0.02mm였다. 코어 샘플의 길이를 따라 숱이 0.01 ± 0.005 mm/mm로 기록되었다. 4.2.3 단계에서 설명된 바와 같이, 코리 샘플의 이미지 처리 워크플로우와 로터리 툴(예를 들어, Dremel)을 사용하여 조달된 하나...

우리는 인간 페모라의 전방 측면에서 SRμCT 실험을 위해 균일한 크기의 피질 뼈 표본을 조달하기 위해 지질학적(coring) 샘플링 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 최소한의 파괴적이고 효율적이며, 불규칙한 샘플 모양에서 이미징 아티팩트를 최소화하고 미세 건축 시각화 및 분석을 향상시키는 원통형 표본을 초래합니다.

싱크로트론 마이크로 CT를 위한 고처리량 피질 뼈 샘플 조달 및 분석을 위한 단면, 코링 및 이미지 처리 가이드

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

싱크로트론 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 위한 뼈 표본 조달과 관련된 사용 가능한 데이터는 여전히 희박합니다. 우리의 포괄적인 튜토리얼은 간단하고 파괴를 최소화하며 비용 효율적인 방법론을 제공합니다. 일관된 치수와 원통형 모양의 뼈 표본을 확보하는 것은 결과 데이터 세트가 최고 품질이고 결과를 적용 가능하게 하는 데 중요합니다.이 원고에 기술된 기술은 암석, 화석 또는 단단한 물질에 코어를 채취하기 위해 적용할 수 있다. 우리는 이를 사용하여 지구의 지각과 상부 맨틀의 유변학을 탐구하기 위한 고압 실험을 위해 균일한 크기의 암석과 단결정 코어를 수집했습니다. 초보 코어러는 뼈 표본이 원뿔 모양을 형성하는 것을 알 수 있습니다.이 문제는 드릴 비트에서 뼈 가루가 흘러나올 수 있는 적절하고 충분한 시간을 허용하고 코어링 속도를 늦춤으로써 해결할 수 있습니다. 싱크로트론 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 위한 뼈 표본 조달을 보여주고 논리적 분석을 보여주는 교육용 텍스트와 비디오가 부족합니다. 단계별 뼈 준비 튜토리얼은 이 간극을 메우는 데 도움이 됩니다.최대 섭씨 140도의 핫플레이트에 75 x 25mm 유리 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드 중앙에 충분한 양의 열 에폭시 수지를 녹입니다. 뼈 블록의 아래쪽 측면을 슬라이드에 수직인 뼈의 길이로 현미경 슬라이드의 열 에폭시 수지로 누릅니다. 뼈의 아래쪽을 코팅하고 안정적인 접착을 보장하기 위해 샘플을 앞뒤로 이동합니다.장착된 시편을 약 5분 동안 핫 플레이트에 올려 놓고 열 에폭시가 모공과 균열로 흡수되도록 하여 슬라이드의 에폭시에 기포가 없는지 확인합니다. 기포가 있는 경우 샘플을 앞뒤로 이동하여 제거합니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 핫 플레이트에서 장착된 표본이 있는 슬라이드를 제거하고 약 10분 동안 실온에서 냉각시킨 다음 면도날로 슬라이드 가장자리의 에폭시를 제거하여 척이 슬라이드를 적절하게 잡도록 합니다.접착된 샘플이 있는 슬라이드를 유리 슬라이드 척에 부착하고 저속 절단 톱의 회전 암에 척을 장착하여 뼈의 단면이 길이에 수직으로 절단될 수 있도록 배치합니다. 스위블 암을 조정하여 블레이드가 샘플과 접촉하고 횡단하도록 합니다. 절단 암의 무게에 대응하기 위해 절단 암의 반대쪽에 추를 추가하고 유체 용기에 증류수와 절삭유를 추가합니다.다이아몬드 웨이퍼 블레이드를 단단히 고정하고 유체 레벨이 블레이드의 절단 부분에 잠기도록 합니다. 속도를 200RPM으로 설정하고 샘플을 블레이드 위로 천천히 내립니다. 톱이 절단을 시작하면 날과 척이 흔들리거나 튀지 않는지 확인하십시오.그렇다면 즉시 톱을 멈추고 블레이드 또는 척 암 어셈블리를 조입니다. 척이 공격적으로 위아래로 움직이는 경우 균형추를 더 추가하십시오. 첫 번째 두꺼운 단면은 각 추가 절단과 평행하게 잘 정의된 표면을 제공하는 폐기물 절단입니다.초기 폐기물 절단 후 스위블 암을 올리고 포지셔닝 다이얼을 사용하여 척을 블레이드 쪽으로 5mm 이동합니다. 절편이 완료된 후 장착된 시편과 함께 유리 슬라이드를 핫 플레이트에 올려 열 에폭시를 녹입니다. 앞서 설명한 열 에폭시 접합 기술을 사용하여 얕은 알루미늄 주석의 바닥에 5mm의 뼈 단면을 장착합니다.밀 드릴 프레스의 XY 기계 테이블에 주석을 놓고 고정 클램프를 손으로 조입니다. 2 밀리미터 안 직경 빈 갱구 보석상, 다이아몬드에 의하여 기울어지는 응어리를 빼는 드릴용 날을 선반 교련 물림쇠로 삽입하고 주석을 통해서 응어리를 빼는 것을 막기 위하여 깊이 제한기를 조정하십시오. 뼈 샘플의 중앙 앞쪽을 드릴 비트 아래에 정렬하면서 골막과 골 또는 섬유주가 많이 발달된 영역과의 밀접한 접촉을 피합니다.주석에 증류수를 채워 샘플을 완전히 덮으면 열 축적, 샘플의 연소 및 코어링 중 드릴 비트 손상을 방지할 수 있습니다. 밀 드릴 프레스는 적절한 안전 조치를 취하지 않으면 위험할 수 있습니다. 작업자는 보안경을 착용하고, 헐렁한 옷을 단단히 고정하고, 긴 머리를 뒤로 당겨 스핀들에 걸리지 않도록 해야 합니다.코어 비트와 뼈 사이의 처음 몇 번의 접촉은 뼈의 상부 표면에 링을 착용하기 위해 부드러운 압력을 가합니다. 이것은 코어링 프로세스 시작 시 드릴 비트의 처짐을 방지하고 비트의 올바른 배치를 보장합니다. 코어링하는 동안 드릴 비트를 샘플 안팎으로 들어 올리고 비트의 팁을 물 표면 아래에 두십시오.몇 초마다 이 작업을 수행하여 갇힌 뼈 먼지를 씻어내고 파편이 드릴 비트를 막지 않도록 합니다. 응어리를 빼는 것이 완료된 후에, 유래하는 뼈 중핵은 빈 줄기가 있는 드릴 비트에서 박히게 될지도 모릅니다. 끝이 가는 집게 한 쌍이나 작은 육각 렌치를 사용하여 비트에서 코어를 제거합니다.이미징할 때까지 서늘하고 건조한 장소의 라벨링된 미세 원심분리기 튜브에 코어드 샘플을 보관하십시오. 설명된 코어 샘플링 방법은 매우 효과적이고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 코어드 샘플과 로터리 도구를 사용하여 얻은 샘플의 이미지 처리 워크플로우를 비교하는 대표적인 그림이 여기에 나와 있습니다.일반적인 회전 도구를 사용하여 절단한 샘플은 코어드 샘플과 비교할 때 근관과 틈새의 수가 증가하고 평균 근관 직경, 근관 부피 및 피질 다공성이 감소했습니다. 이 표는 각 샘플에 대한 다공성 데이터를 보여줍니다. 코어링 프로토콜은 싱크로트론 마이크로컴퓨터 단층 촬영 스캔에서 관찰되는 아티팩트를 감소시키지만, 직선 뼈 블록 실험에서 아티팩트가 많은 낮은 품질의 수치는 다면적인 문제를 나타냅니다.후속 이미지 처리는 피질 뼈 미세 구조의 시각화를 개선하는 기술의 잠재력을 확인했습니다. 예를 들어, 광물화(mineralization) 차이, 골 경계(osteonal bound)의 개선된 묘사, 혈관(vascular canal) 내 연조직의 일관된 시각화가 관찰되었습니다. 천천히 진행하는 것이 일관된 크기의 원통형 샘플을 얻는 열쇠입니다.너무 빨리 가면 시편이 원통형이 아닌 원뿔 모양이 될 수 있습니다. 코어링을 위해 두꺼운 절편을 확보하는 동안 명시야 또는 컨포칼 현미경 검사를 위해 더 두꺼운 절편을 수집할 수 있습니다. 이를 통해 이관 네트워크를 시각화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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