Name: 공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 고해상도 X선 단층촬영을 활용한 식물 도관 조직의 3차원 구조 및 기능 분석 방법을. 이 기술은 생체 식물에서 수분 운송 메커니즘을 비파괴적으로 정밀 관찰할 수 있게 합니다.

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저자는 S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi 및 Zedan 감사드립니다. 이 작품은이 지원되었습니다 농업 - 농업 연구 서비스 현재 연구 정보 시스템 자금은 미국과 (연구 프로젝트 없음 5306-21220-004-00, 고급 라이트 소스는 이사, 과학 사무실, 기본 사무실에 의해 지원됩니다. 에너지 과학, 에너지의 미국학과 계약에 따라 번호 DE-AC02-05CH11231).와 AJM에 NIFA 특수 작물 연구 사업 허가.

아래에 설명 된 프로토콜 세부 정보는 고급 광원 8.3.2 빔라인에서 일을 구체적으로 작성되었습니다. 적응은 다른 싱크로트론 시설에서 일을해야 할 수도 있습니다. 적절한 안전 및 방사선 교육은 이러한 시설의 이용이 필요합니다. 1. 라이브 식물을위한 샘플 준비 <ol><li> ~ 10cm 직경의 냄비에 식물을 성장, 주요 줄기 (또는 스캔 할 식물의 부분)와 같은 냄비에 수직으로 가능한 방향으로 중심되어 있는지 확인합니다. 고급 광원 제한에서 HRCT 악기 하치의 물리적 크기는 높이 ~ 1m에 식물을 살고 있습니다. 결과적으로, 라이브 식물의 이미지는 가장 묘목 / 작은 화분에서 재배 묘목에 수행됩니다. 실험에 따라 다른 토양 유형은 토양 수분 콘텐츠 (가뭄 실험에 등) 제어하는 데 사용될 수 있으며, 유연한 촬영 (예 : 포도 나무)와 일부 식물에 대해 더 이상 촬영이 될 수 있습니다주의 TU아크릴 관에 cked은 (그림 1과 2 참조) 아래에 설명. </li><li> 주문 제작 강성 알루미늄 냄비 홀더에 라이브 화분에 담긴 식물을 탑재합니다. 상단 플레이트 높이가 냄비 높이의 범위를 수용 할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 판의 상단은 토양 표면의 상단과 두 부분으로 판의 중심에서 식물이 돌출에 부합하도록 설계되었습니다. 냄비 홀더의 목적은 식물의 줄기가 진동 샘플 움직임을 최소화하기 위해 제자리에 단단히 개최되어 있는지 확인하는 것입니다. 스캔하는 동안 샘플 움직임을 최소화하는 것은 필수적입니다. </li><li> 일단 홀더에 장착, Scholander 스타일의 압력 챔버 또는 클립 - 온 이전 검사에 식물의 생리 상태를 결정하기 위해 각각 잎 porometer,.을 사용하여 줄기 물 잠재적 또는 잎 증산을 측정 </li><li> 공장을 극복하고 알루미늄 공장 소유자의 상단에 얇은 벽 아크릴 실린더를 놓고 안정화 찰흙 접착제와 장소에 고정샘플 (그림 2). 상단 단풍의 진동 운동은 줄기를 전송하고 스캔 영역 내에서 식물 조직은 궁극적으로 이미지 왜곡로 이어지는, 이동 될 수 있습니다. 실린더는 공장 단풍을 포함하고 검사 중에 진동이 발생할 것 토끼장에 장비의 다른 조각에 대한 가닥의 식물 잎을 방지하기 위해 사용됩니다. 추가 플라스틱 랩, 종이 수건, 테이프는 더 (그림 4의 샘플 운동과 관련된 문제를 참조) 공장 부품의 진동과 움직임을 최소화하기 위해 사용되어야합니다. 의 기능을 수행 할 수있는 충분한 강성을 유지하면서 자사의 x-선 흡수를 (주어진 노출 시간에 이미지 품질을 줄일 수있는) 줄이기 위해이 포함 된 실린더는 가능한 한 얇은 벽으로 있어야합니다. </li><li> 공기 베어링 스테이지에 사용자 정의 냄비 홀더를 첨부하여 X 선 소스와 이미지 센서와 카메라 장비 사이에 (나사)를 잠그십시오. Positi샘플 회전하는 동안 시야에 있는지 확인해야 자기 척베이스의 수와 센터처럼 수직 줄기 있습니다. </li></ol> 2. 신선한, Excised 식물 조직을위한 샘플 준비 <ol><li> 신선한 식물 재료, 일반적으로 줄기 나 pe​​tioles은 실제 공장에서 즉시 제거 후 스캔 할 수 있습니다. 실험의 의도는 혈관 내에서 목질부 네트워크, 물 전체를 시각화하는 경우 철수와 공기로 대체해야합니다. 이 작업을 수행하려면 Scholander 스타일의 압력 챔버에 시료를 장착하고 약 5 분 동안 낮은 압력 (&lt;0.05 MPA)에서 샘플을 통해 압축 공기 또는 질소를 밀어. 종은 혈관 네트워크를 철수하는 데 필요한 시간이 다를 수 있습니다. 목적은 새로운 면도날을 사용하여 공장에서 다음 신선한 식물 조직의 색전증 형성의 범위, 소비세 샘플을 평가하고 물 아래의 삭감을하는 경우. </li><li> 홍보에 Parafilm의 층에 샘플을 감싸스캔하는 동안 이벤트 건조. </li><li> 공기 베어링 스테이지로 망하는 금속 플레이트에 고정 드릴 척에 나와있는 예제를 탑재합니다. 센터와 방향이 수직으로 샘플을 보장하기 위해 위에서 설명한 예제는 시야에 남아 있습니다. </li></ol> 3. 말린 우디 화장지를위한 샘플 준비 <ol><li> 최적의 조직 샘플 시각화 및 이미지 대비를 들어, 천천히 전체 우디 조직 샘플을 탈수 할 필요가 있습니다. 길이 약 6cm로 샘플을 잘라 버릴거야. 대상 검색 지역에서와 같이 직선으로 가능합니다 샘플을 선택하고 ≤ 1cm의 직경이 있습니다. </li><li> 천천히 조직의 균열이나 분할을 야기하지 않고 샘플을 건조하는 낮은 온도에서 건조 오븐에 우디 조직 샘플을 놓습니다. 이 과정은 종과 조직 사이에 차이가 가능성이 높습니다. 우디 줄기를 들어, 40 ° C의 오븐에 12 시간은 일반적으로 큰 차를 발생하지 않고 우수한 콘트라스트를 제공 할 충분줄기의 물리적 구조의 nges (그림 3에서 보여준 빠른 건조 문제를 참조). </li><li> 어떤 상황에서는이 전자 현미경을 스캔과 후속 해부 및 시각화는 HRCT 이미지의 특정 지점에 중심이 될 수 있도록 샘플 내에서 수탁자의 표시가 바람직하다. 이 작업을 수행하려면, 부착 금속이나 유리 구슬이나 Parafilm를 사용하여 줄기의 바깥 선. 또 다른 방법은 실리콘 수지 (예 : RTV-141, Bluestar Silicones, 동 브런 즈윅, 뉴저지) (Brodersen 외 2010 년 예를 참조) 하나의 목부 도관에 주입 할 수 있습니다.를 사용하는 것입니다 일단 경화, 실리콘 수지는 표본의 명확하게 표시하고 쉽게 다른 공기 주입 선박에서 구별됩니다. 정확하게 샘플의 특정 지역을 찾아이 아이콘을 사용합니다. </li><li> 위에서 설명한대로 드릴 척하고 센터에서 샘플을 탑재합니다. </li></ol> 4. 잎 Tissu을위한 샘플 준비2 차원 (2D) Radiograms에 대한 전자 <ol><li> 가까운 실시간으로 잎에서 선박의 내용을 시각화하기 위해 잎은 치과 X-레이와 비슷한 2D 무선 전보를 생성하기 위해 스캔 할 수 있습니다. 얇은 아크릴 플라스틱의 두 시트 사이의 잎을 탑재하고, 클립 가장자리를 확보. 그런 후 홀더 시스템과 위치 이미징 시스템과 X-레이 소스 옆에있는 광학 브레드를에 장착 샘플을 첨부합니다. </li></ol> 5. 8.3.2 허치에서 샘플을 스캔 <ol><li> 응용 프로그램에 가장 적합한 것 배율을 결정합니다. ALS 빔라인 8.3.2은 배, 5 배, 그리고 10 배의 배율과 렌즈로 스캔 할 수있는 기능이 있습니다. 각각의 이미지 픽셀 크기 4.5, 2.25 및 0.9 μm에서 이러한 결과. 보기의 필드를 증가 확대와 함께 감소로 배율에 따라 샘플은 적절한 크기이어야합니다. 카메라와 렌즈의 선택에 대한 자세한 내용과 표 1의 결과 이미지 매개 변수를 참조하십시오.</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000 (4008x2672) </td><td colspan="2"> PCO.Edge (2560x2160) (Optique 피터) </td></tr><tr><td> 렌즈 </td><td> 픽셀 (μm) </td><td> 시야 (mm) </td><td> 픽셀 (μm) </td><td> 시야 (mm) </td></tr><tr><td> 10 배 </td><td> 0.9 </td><td> 3.6 </td><td> 0.65 (0.69) </td><td> 1.7 (1.7) </td></tr><tr><td> 5 배 (4 배) </td><td> 1.8 </td><td> 7.2 </td><td> 1.3 (1.72) </td><td> 3.3 (4.4) </td></tr><tr><td> 배 </td><td> 4.5 </td><td> 18 </td><td> 3.25 (3.44) </td><td> 8.3 (8.8) </td></tr><tr><td> 1X </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6.5 (-) </td><td> 16.6 (-) </td></tr></tbody></table> 가능에 관한 표 1. 세부 정보카메라와 ALS 8.3.2에서 렌즈. <ol start="2"><li> x-선 에너지 15 케빈를 설정합니다. 이것은 (Brodersen 외. 2010 2011 2012a, B 참조) 대부분의 식물 응용 프로그램에 대한 좋은 이미지 대비를 제공하기 위해 표시되었습니다. 노출 시간은 일반적으로 100 1000 밀리 초 사이의 샘플의 두께 및 밀도 (및 따라서 배율이 사용) 범위에 따라 달라집니다. 긴 노출 시간 (오래 검출기 픽셀이 포화되지 않으므로)은 일반적으로 잡음 비율 높은 신호에 연결하지만, 증가 스캔 시간 비용을 것입니다. </li><li> 응용 프로그램에 적합한 각도 증가를 선택합니다. 샘플은 스캔하는 동안 180 °를 회전하고 있으며, 회전 중에 찍은 이미지의 수는 스캔 간격의 세트, 길이, 및 최종 이미지 품질의 크기에 큰 영향을 미칠 수 있지만, 일반적으로 품질이 수익을가 감소하고 있습니다. 일반 스캔은 스캔 당 721 이미지를하였으며, 0.25 ° 단위로 수행됩니다. incremen을 감소좋은 정보를 시각화를위한 더 나은 이미지에서 0.125 ° 결과 t하지만, 따라서 생산량 1,440 이미지와 훨씬 더 큰 데이터 세트 (관심 전형적인 지역이 방법 ~의 데이터 10-30기가바이트 대 5기가바이트). 그러나 잡음 비율의 신호는 종종 향상과 증가 스캔 시간과 데이터 크기 모두 가치가있다. 스캔하는 동안 변형 / 축소 할 가능성이 드라이 줄기는 손해가없는 이상 간격 (작은 각도의 증가)를 받게 할 수 있습니다. 생물학적 과정 (예 색전증 수리) 짧은 시간 단위에서 진행 영상 라이브 식물, 짧은 스캔 간격을 선택하고 언제 지에서 X-레이 방사선의 잠재적 피해 효과를 제한하는 것이 바람직합니다 조직 - 있지만이의 잠재적 인 손실에 있습니다 이미지 품질. 짧은 스캔 간격은 이미지를 캡처하는 동안 샘플이 연속적으로 회전하는 동안 연속 단층 촬영 설정을 사용하여 달성 할 수 있습니다. </li><li> 각 스캔 들어, &quot;시야&quot;과 &quot;암시&quot;이미지 correcte해야합니다D. 밝은 필드 이미지는 빔의 샘플이없는 이미지입니다. 이은 종종 수평으로 샘플을 번역하여 샘플의 검사 전후 수집하고 있습니다. 다크 필드는이 셔터 - 카메라가 더 X-선으로 표시 신호의 양을 측정 한 X-레이 종료에 의해 저장됩니다. </li></ol> 6. 데이터 처리 <ol><li> 데이터 처리 컴퓨터에 인수 컴퓨터에서 파일 서버에 수출 된 &quot;원시&quot;2D. TIF 이미지를, 전송할 수 있습니다. 컴퓨터가 충분한 RAM이있는 경우, 데이터는 소위 &quot;RAM 드라이브&quot;(RAM의 일부가 컴퓨터에 하드 드라이브로 표시)에 복사 할 수 있습니다. 이런 식으로 소프트웨어는 솔리드 스테이트 드라이브 또는 플래시 메모리에 비해 비교적 느린 회전 하드 드라이브에 액세스 할 필요가 없습니다. 이 단계는 크게 데이터 세트를 처리하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. </li><li> 이미지는 %의 전송 크기로 변환해야합니다. 빔라인 8.3.2 사용자 정의 바 있습니다ckground 정규화 플러그인은 무료로 다운로드 할 수있는 소프트웨어 패키지 ImageJ이나 피지 (를 다운로드하고 사용할 수 있습니다 <a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ). 이 이미지에서 어두운 카운트를 뺀와 %의 전송을 표시 이미지를 창출하고 밝은 분야로 샘플 이미지를 normalizes. 낙지 소프트웨어 패키지 (로 정규화 된 이미지를로드 <a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> )와 (링 제거를 이미지를 정규화 지정된 처리 단계를 사용하여 2D 생. TIF 파일에서 3D 데이터 세트 &quot;를 재구성&quot; , Sinogram 만들기, 병렬 빔 재건). 이 과정은 그럼. TIF 횡 방향 (단면) &quot;voxels&quot;(용적 픽셀 요소), x-선 선형 흡수 계수를 나타내는 X, Y, Z 좌표와 강도 값으로 각각 구성 일련의 이미지를 얻을. </li></ol> 7. 눈에 보이게 함 <ol><li> Visuali소프트웨어 패키지의 다양한 중 하나에 이미지의 스택을 ZE. 프리웨어 (예 : Drishti, <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml는</a> ) 볼륨이나 개인이나 이미지의 스택을 (예 : ImageJ 또는 피지) 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 소프트웨어 패키지는 3D 시각화에 사용할 수 있습니다. 우리의 연구 그룹은 Avizo 소프트웨어 패키지 (사용 <a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview를</a> )이지만 Amira합니다 (다른 <a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> )와 VGStudioMax ( <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www. 내 volumegraphics.com /는</a> )도 일반적으로 사용됩니다. </li><li> 시스템 메모리에 데이터 집합을로드하고 세로 가상 횡 방향, 또는 방사상 슬라이스 방향에 나와있는 예제를 표시합니다. 때문에 데이터 세트, 가상 슬라이스의 3D 속성의 sampl를 통해e는 관심 지역, 전통 시리얼 광 현미경 (자세한 예제 1-3 영화 참조)을 통해 상당한 개선을 정렬 할 비행기에 회전 할 수 있습니다. </li><li> 3D로 필요에 따라 샘플을 시각화하기 위해, &quot;세그먼트&quot;주변 조직에서 혈관 루멘 또는 다른 구조를 분리하는 Avizo에 반 자동 및 수동 루틴의 다양한 사용하여 샘​​플. 세분화 따라서 분리 또는 별도의 지역으로를 분류, 관심 객체 사이의 경계를 정의를 의미합니다. 3D로 렌더링 볼륨은 시각화 소프트웨어에 의해 수행된다. 이 작업을 수행하는 한 가지 방법은 볼륨의 각 지점이 빛을 방출하고 흡수 간주됩니다 직접 볼륨 렌더링이다; 방출과 흡수의 양 및 색상은 특정 방향으로 &quot;colormap&quot;, 그리고 결과 투영을 사용하여 정의 할 수 있습니다 화면에 표시됩니다. 또는 세그먼트 경계를 대표하는 와이어 프레임 또는 3D 메쉬 표면은 t의 3D 모델을 표시하도록 구성되어 있습니다관심 그는 구조. 3D 메쉬는 다각형 요소로 구성되어 있으며, 요소의 총 수는 구조를 재현의 충실도 및 관련 데이터 파일의 크기 (더 많은 요소를 즉 높은 충실도하지만, 큰 파일 크기로 연결)을 모두 적용됩니다. 영상 처리 모듈의 다양한 이미지 밝기, 명암, 투명성, 소음 감소 등의 볼륨 렌더링 출력뿐만 아니라 컨트롤을 제어 할 시각화 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다 </li></ol> 8. 양을 정함 <ol><li> 분할이 이루어 된 후에는 예를 들어 물, 공기 등의 볼륨, 길이, 폭, 존재 또는 부재에 대상 공장 구조 나 기능 변경 사항을 수량화 할 수 있습니다, Brodersen 외. (2010) 수량화 할 수 Avizo 소프트웨어를 사용 grapevine 충진 용기 내부에 물방울의 볼륨을 변경할 수 없습니다. 식물은 시간 일품을 만드는 4-8시간 이상 매 30 분 스캔 된용기의 PSE 시퀀스는 충진. 각 검사는 자신의 볼륨이 증가로 개인의 방울은 시간이 지남에 따라 측정 하였다 Avizo로 재건 및로드했습니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

Synchotron HRCT 믿을 자세히 식물 vasculature의 내부를 탐험 할 수있는 강력한, 비 파괴적인 도구를 사용하여 식물 생물 학자를 제공합니다. 이 연결이 크게 확산하기 위해 혈관 병원균과 emboli의 능력을 변경할 수 있습니다 -이 기술은 differentially 다양한 grapevine 종 (. 언론의 Brodersen 외 2012b)에 목질부 네트워크 연결을 변경 grapevine의 목부의 이전 undescribed 해부학 구조를 확인하기 위해 최근에 사용 된 destructively 목부 네트워크를 통해. 생활 식물의 첫 번째 성공 스캔도 색전증의 확산 및 수리 (Brodersen 외 2010; McElrone 외 2012 새로운 Phytologist 196 (3) :661-665)과 같은 동적 프로세스의 미세 규모의 세부 사항을 공개 한 및 역할을 연루 데 도움이 ALS 8.3.2에서 HRCT에서 제공 색전증 - 공간적 해상도를 수리의...

상호 도관, 섬유, 생활, metabolically 활성 셀의 네트워크 - 물은 식물의 뿌리에서 목부라는 혈관 조직에있는 잎으로 이송되어 있습니다. 식물 목질부의 교통 기능은 광합성을위한 잎, 성장하고, 궁극적으로 생존에 영양분과 물을 공급하기 위해 유지해야합니다. 목부 네트워크가 병원성 미생물에 의해 손상되면 목부 도관의 물 운송이 중단 될 수 있습니다. 이러한 감염 식물에 대한 응답으로 자주 (; 2,010 예 McElrone 외 2008) 병원체 확산을 분리하는 수단으로 젤, 잇몸, 그리고 tyloses을 생산합니다. 가뭄 스트레스도 목질부에 물 전송을 제한 할 수 있습니다. 식물이 오랜 가뭄 때 물을 잃어으로 긴장은 목부의 수액에 구축합니다. 긴장 아래의 물은 (즉, 특정 임계 값에 긴장이 목부 도관에 포함 된 물 열을 cavitate 할 수있을만큼 훌륭한된다) metastable입니다. 캐비테이션이 발생하면 가스 기포 (색전증) cond를 형성하고 입력 할 수 있습니다uit, 효과적으로 차단 물 운동 (타 이리와 스페리 1989), 심해 다이빙의 감압 질병 (즉, &quot;벤딩&quot;)와 유사한 현상. 로이 주제에 (. 타 이리 &amp; Zimmermann, 2002, 홀 브룩 외, 2005)에서 역사와 현대 문학의 광대 한 기관 증명 최적의 식물 기능에 대한 목부 물 수송의 중요성에도 불구하고, 어려운 남아 목부 네트워크 측면은 여전히 있습니다 . 여러 연구 그룹은 최근 미세한 나무 해부학 세부 사항 및 혈관 조직 (예 : 메이요 외를 평가 고해상도 X 선 계산 된 마이크로 단층 촬영을 (HRCT) 활용하기 시작했습니다, 2010, 2008, Mannes 외 2010;. Brodersen 외 2010. 2011 년, 2012a, B, 마에다와 미야케, 2009, 스텝 외 2004).. HRCT는 고체 물체의 내부에 기능을 시각화하고 자신의 3-D 구조 특성에 디지털 정보를 얻기 위해 사용되는 비파괴 기법이다. HRCT도 고밀도 개체의 크기는 미크론으로 작은 등의 세부를 해결하는 능력에 종래의 의료 CAT-스캐닝과 다릅니다. 싱크로트론 HRCT 기술의 최근 발전은 충분히 있으므로 식물 선박 네트워크와 intervessel 연결 시각화 할 수있는 잡음 비율로 이미지 해상도 및 신호 개선 3D 좌표를 할당하고, 유압 모델 시뮬레이션에 수출하고 있습니다. Brodersen 외. (2011) 최근 자동으로 기존의 해부학 적 방법 (시리얼 즉, 마이크로톰을 sectioning로 어느 가능했던 것보다 훨씬 높은 해상도로 목부 네트워크에서 데이터를 추출 포트란 모델 싱크로트론 HRCT에 의해 생성 된 3D reconstructions를 결합하여이 기술을 고급 빛 현미경과 및 이미지 캡처, 예를 들어 Zimmermann 1971). 이 작품은 목부 시스템의 유압 모델을 최적화하는 데 사용 및 전송의 고유 한 특성을 (일부 VE에서 즉, 역방향 흐름 확인되었습니다최대 증산 기간 동안 ssels) (리 외., 리뷰). 싱크로트론 HRCT는 이제 목부 기능, 캐비테이션에 대한 민감성, 그리고 embolized 도관을 복구 할 수있는 식물 &#39;능력을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. embolized 도관의 재 구축 흐름에 실패 유압 용량 제한 광합성, 그리고 극단적 인 경우에 식물 사망의 결과 (맥도웰 외. 2008) 줄일 수 있습니다. 식물은 인접 기능 도관을 연결 구덩이를 통해 폐색 주위에 물을 우회 의해 손실 유압 용량을 대체 할 수있는 새로운 목부 성장하여 emboli에 대응 할 수 있습니다. 일부 식물은 물과 열에서 휴식을 복구 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 긴장 미만의 목부에서이 절차의 세부 사항은 수십 년 동안 불분명 남아 있습니다. Brodersen이 외. (2010) 최근 시각화 및 HRCT를 사용하여 라이브 grapevines의 충진 과정을 정량화. 충진 성공적인 선박은 xyl을 둘러싼 살아있는 세포에서 물이 유입에 의존했습니다그들 각각의 물방울은 시간이 지남에 따라 확장 도관, 가득 선박,하고 갇힌 가스의 해산을 강요. 이 수리를 제어하는​​ 위험 목부 선박과 메커니즘을 복구하기 위해 다른 식물의 용량이 현재 조사되고있다. ALS 시설 빔라인 8.3.2에 대한 설명 지금까지 우리의 작품은 로렌스 버클리 국립 연구소 (버클리 CA USA)의 고급 광원에서 하드 X-선 마이크로 단층 촬영 빔라인 8.3.2에서 실시되었습니다. 식물 샘플은 11.5 케빈의 중요한 에너지의 고급 광원 전자 저장 링 운영 내에 쌍극자 6 테 슬러 초전도 굽힘 자석에 의해 생성 된 x-선 소스에서 리드 늘어선 토끼장에 위치한 20m에 위치하게된다. 엔드 스테이션의 개략적 인은 그림 1에 표시됩니다. X-레이 40x의 빔 크기 ~ 4.6 mm로 하치를 입력하고 방문객 회전 무대에 장착되어있는 샘플을 통과.전송 X-레이 이미지 컬렉션에 대한 CCD로 렌즈를 통해 전달되어 보이는 빛 엑스레이로 변환 크리스탈 신틸 레이터 (일반적으로 사용되는이 자료는 LuAG 또는 CdWO 4아르)에 가해진. 카메라, 신틸 레이터와 광학는 샘플 - 투 - 신틸 레이터 거리가 위상 콘트라스트 이미지에 맞게 최적화 할 수 있습니다 레일에 빛을 꼭 상자에 포함되어 있습니다. 모든 샘플은 결과적으로 샘플 위치에 수평 및 수직 번역 단계에 장착되어있는 10cm 직경 로터리 스테이지에 장착되어 있습니다. 사용자 정의 내장 식물 냄비 홀더와 아크릴 관에 포함 된 단풍에 장착 루트 시스템과 생활 공장 샘플은, 그림 2에서 볼 수 있습니다. 일반적인 노출 시간이 초는 10-18 케빈를 사용하여 0.1-1까지 다양 할 수 있으며, 스캔 기간은 특정 샘플에 최적화 된 설정에 따라 5-40 분까지 다양합니다. 키가 큰 샘플의 경우 (식물 목질부 네트워크의 전형적인), 데이터 스캔 할 수 있습니다~ 10cm의 최대 샘플 높이를 따라 원활한 시리얼 섹션 수 있도록 자동으로 제어되는 다른 높이에서 샘플로 측정을 반복하여 타일로 마감. 4.5 μm 해상도의 영상이 수직 방향으로 거의 완벽 샘플 ~ 1cm입니다 최대 샘플 폭. 데이터 생성 및 처리는 다음과 같습니다 프로토콜을 사용하여 완료됩니다. 때문에 공기와 물 사이의 x-선 감쇠의 차이를, 우수한 이미지 대비가 의료 중부 표준시 시스템의 전형적인 대비 솔루션을 사용하지 않고 식물에서 얻을 수 있습니다. 공기 주입 선박 루멘은 수화 식물에서 주변의 물이 채워진 조직에서 쉽게 구별됩니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Advanced Light Source beamline 8.3.2의 장비에 대해 위에 나열된 세부 사항을 참조하십시오</td></tr></tbody></table>.

공장 vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

고해상도 X 선 계산 된 단층 촬영 (HRCT)은 지금 (예 : Brodersen 외 삼차원 (3D)에 식물 목질부 네트워크의 구조와 기능을 평가하는 데 사용되는 하위 마이크론 해상도 기능을 갖춘 비파괴 진단 이미징 기술이다 . 2,010, 2,011, 2012a, b). HRCT 이미징은 의료 중부 표준시 시스템과 같은 원칙을하지만, 높은 공간 해상도의 높은 강도 싱크로트론 X-선 소스 결과에 따라와 이미지 획득 시간을 감소합니다. 여기, 우리는 Avizo 소프트웨어 (VSG 주식회사, 버 링턴, 미국 MA)와 함께 HRCT는 (고급 광원 - LBNL 버클리, CA, USA에서 수행)에 식물 목질부를 탐험하는 데 사용되는 방법을 싱크로트론 기반 상세 설명 조직 및 거실 식물을 excised. 이 새로운 이미징 도구는 사용자가 기존의 정적, 2D 빛이나 전자 micrographs 및 비행기에서 가상 시리얼 섹션을 사용하여 학습 샘플을 넘어 이동할 수 있습니다. 어떤 방향으로 C에서 조각의 무한한는 동일한 샘플 전통적인 현미경 방법을 사용하여 물리적으로 불가능 기능을 만들 수. 결과 HRCT는 풀의와 우디 식물 종 및 식물 기관의 범위 (즉, 잎, petioles, 줄기, 줄기, 뿌리) 모두에 적용 할 수 보여줍니다. 여기에 제시된 수치는 대표 식물 혈관의 해부학 적 구조의 범위와 해안 레드 우드 (세쿼이아 sempervirens), 호두 (Juglans 종.), 오크 (Quercus 종.)과 단풍 나무 (에 대한 검사를 포함 HRCT 데이터 집합에서 추출 세부 유형을 모두 보여 도움이 에이서 종은.) 나무 해바라기 (Helianthus annuus), grapevines (Vitis 종.), 그리고 양치 (Pteridium aquilinum 및 Woodwardia fimbriata)에 묘목. 우디 종 Excised 및 건조 샘플을 검사하고 일반적으로 가장 좋은 이미지를 얻을 수 있도록 쉬운입니다. 그러나, 최근 개선 (예 : 더 빠른 스캔 및 샘플 안정화)는 포스 한녹색 조직 (예 : petioles)와 식물이 시각화 기법을 사용 였죠. 계기로 수화 녹색 식물 조직의 일부 수축이 문제가 설명되어 있습니다 방지하기 위해 블러과 방법으로 이미지를 발생합니다. HRCT로이 최근 발전 플랜트 혈관 기능에 긍정적 새로운 통찰력을 제공합니다.

Synchotron HRCT 스캔이 성공적으로 식물 조직 및 빔라인 8.3.2 (그림 5)를 사용하여 종의 다양한에서 구현되었으며, 3D로 전례없는 해상도 식물 목질부의 구조와 기능에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 3D reconstructions가 제공하는 시각화 및 탐색 기능 (같은 모양으로 6-8을 설명, 1-3 및 영화)가 excised 샘플 모두에서 목질부 네트워크와 구조의 위치와 방향의 정확한 결정와 식물에서 할 수 있습니다. 어떤 상황에서는, 샘플의 움직임이나 의도 진동를 사용할 수 없게 스캔 (예를 들면 그림 4) 렌더링, 최종 이미지에 왜곡을 야기했지만, 스캔 시간을 줄일 수있는 개선 (연속 단층 촬영 포함)로 인해 이러한 데이터 손실의 해로운 효과를 최소화 한 많은 자세한 검사는 현재 제한된 beamtime에 완료 할 수 있습니다각 사용자에게 할당...

고해상도 X 선 계산 단층 촬영 (HRCT)는 3D로 공장 vasculature의 구조와 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 비파괴 진단 이미징 기술이다. 우리는 식물 조직 및 종의 다양한 범위에 걸쳐 목부 네트워크 탐색을 용이하게하는 방법 HRCT 보여줍니다.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

이 절차의 전반적인 목표는 싱크로트론 기반 X선 마이크로 단층 촬영 기술을 활용하여 식물의 혈관 수송 구조와 기능을 탐구하는 것입니다. 이는 먼저 척 홀더 또는 라이브 플랜트 홀더에 설치할 샘플을 준비하고, 스캔할 부분이 가능한 한 수직인지 확인하고, 필요한 예비 생리학적 측정을 수행하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 준비된 샘플 또는 살아 있는 식물을 A LS Beamline 8.3 0.2 허치에 넣고 스캔을 위해 허치를 고정하는 것입니다. 다음.샘플을 적절하게 배치한 후 스캔이 시작됩니다. 마지막 단계는 3D 시각화 프로세스를 위해 데이터를 VISO로 전달하기 전에 워크스테이션 컴퓨터를 활용하여 스캔 품질을 정규화, 재구성 및 평가하는 것입니다. 궁극적으로, X-ray 마이크로 단층 촬영은 식물의 물 전도 혈관 구조의 상호 연결 및 기능 상태에 대한 미세한 세부 사항을 밝히는 데 사용됩니다.연속 절편 및 광학 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전례 없는 해상도로 모든 방향에서 식물 조직을 탐색할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 식물의 물 수송의 근본적인 측면부터 가뭄, 동결 내성, 숙주 식물에서 병원체가 체계적으로 이동하는 방법에 이르기까지 식물 생물학 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 설명된 바와 같이 이 프로토콜은 고급 광원에서 작동하도록 설계되었습니다.8.3 0.2. 다른 싱크로트론 시설에서의 작업을 위해 빔라인 조정이 필요할 수 있습니다. 살아있는 식물에 대한 샘플 준비를 시작하기 위해 이러한 시설 사용에 필요한 안전 및 방사선 교육을 따르십시오.먼저 직경 약 10cm의 화분에서 식물을 재배하고 스캔할 식물의 주요 줄기 또는 다른 부분이 가능한 한 중앙에 있고 화분에서 수직으로 향하도록 합니다. HRCT 기기 Hutch의 물리적 치수는 살아있는 식물의 높이를 약 1미터로 제한합니다. 결과적으로 살아있는 식물의 이미징은 묘목이나 묘목에서 가장 잘 수행됩니다.작은 화분에서 자란 것은 맞춤형 단단한 알루미늄 화분 홀더를 사용하여 살아있는 화분에 심을 식물을 장착합니다. 상판 높이는 다양한 냄비 높이를 수용할 수 있도록 조정해야 합니다. 여기에서 판의 상단은 토양 표면의 상단과 정렬되도록 설계되었으며 식물은 두 부분으로 구성된 플레이트의 중심에서 돌출되어 있습니다.홀더에 장착되면 SHO 착륙선 스타일의 압력 챔버 또는 클립온 잎 매개변수를 사용하여 줄기 수분 전위를 측정하여 스캔하기 전에 식물의 생리학적 상태를 확인합니다. 줄기 주위에 작은 구리선 조각을 꼬아 반복적으로 스캔할 식물에서 일관된 스캔 위치를 보장하기 위한 수탁자 역할을 합니다. 이제 알루미늄 식물 홀더 위에 있는 식물 위에 얇은 벽의 아크릴 실린더를 놓고 나사로 제자리에 고정하여 샘플을 안정화합니다.이미지 왜곡을 유발할 수 있는 식물 부품의 진동과 움직임을 더욱 최소화하기 위해 추가 플라스틱 랩, 종이 타월 및 테이프를 사용해야 합니다. 맞춤형 냄비 홀더를 에어 베어링 스테이지에 부착하고 X-ray 소스와 이미징 센서 및 카메라 장비 사이에 위치한 제자리에 고정합니다. 줄기를 가능한 한 수직으로 배치하고 샘플을 마그네틱 척 베이스의 중앙에 배치하여 시야에 유지되도록 하십시오.회전하는 동안 신선한 식물 재료, 일반적으로 줄기 또는 애완 동물은 살아있는 식물에서 즉시 제거한 후 스캔할 수 있습니다.실험의 목적이 물관부 네트워크 전체를 시각화하는 것이라면 먼저 용기 내의 물을 배출하고 공기로 교체해야 합니다. 이렇게 하려면 비방 스타일의 압력 챔버에 샘플을 장착하고 약 5분 동안 저압으로 샘플을 통해 압축 공기 또는 질소를 밀어 넣습니다. 선박 네트워크를 대피시키는 데 필요한 시간이 종마다 다릅니다.신선한 식물 조직에서 색전증 형성 정도를 평가하려는 경우, 신선한 면도날을 사용하여 수중에서 절단한 부위를 사용하여 식물에서 샘플을 절제합니다. 다음으로, 스캔 중 건조를 방지하기 위해 샘플을 파라폼 층으로 감싸고, 에어 베어링 스테이지 중앙에 나사로 고정된 금속판에 고정된 드릴 척에 샘플을 장착하고, 샘플이 시야에 남아 있도록 앞에서 설명한 대로 샘플을 수직으로 향하게 합니다. 건조된 목질 조직에서 샘플을 준비하려면 먼저 샘플을 약 6cm 길이로 자릅니다.대상 스캔 영역에서 가능한 한 직선이고 직경이 약 1cm인 샘플을 선택하십시오. 다음 단계는 최적의 조직 샘플 시각화 및 이미지 대비를 보장하기 위해 전체 샘플을 천천히 탈수하는 것입니다. 목질 조직 샘플을 저온의 건조 오븐에 넣어 조직에 균열이나 균열을 일으키지 않고 샘플을 천천히 건조시킵니다.일부 상황에서는 샘플에 신탁 마커를 부착하는 것이 바람직할 수 있습니다. 이를 통해 주사 전자 현미경을 사용한 후속 해부 및 시각화가 HRCT 이미지의 특정 지점을 향할 수 있습니다. 이렇게하려면 퍼퓸을 사용하여 금속 또는 유리 구슬 또는 와이어를 줄기 바깥쪽에 부착하십시오.마지막으로, 스캔하기 전에 위에서 설명한 대로 드릴 검사와 중앙에 샘플을 장착합니다. 응용 프로그램에 가장 적합한 배율을 결정하십시오. 여기에 사용된 A LS Beamline 8.3 0.2는 2 x 5 x 및 10 x 배율의 렌즈로 스캔할 수 있는 기능이 있습니다.X선 에너지를 15킬로 전자 볼트로 설정합니다. 노출 시간은 일반적으로 샘플의 두께와 밀도에 따라 달라지며 범위는 100에서 1000밀리초 사이입니다. 응용 프로그램에 적합한 각도 증분을 선택하십시오.샘플은 스캔 중에 180도 회전하며, 회전 중에 촬영된 이미지의 수는 데이터 세트의 크기, 스캔 간격의 길이 및 최종 이미지 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적인 스캔은 0.25도 단위로 수행되며 스캔당 513개의 이미지를 얻을 수 있습니다. 연속 단층 촬영 설정을 사용하면 스캔 간격을 단축할 수 있으며, 이 기간 동안 샘플이 계속 회전하는 동안 각 스캔에 대한 이미지가 캡처되며, 명시야 및 암시야 이미지도 수집해야 합니다.명시야 이미지는 빔에 샘플이 없는 이미지입니다. 이는 종종 샘플을 수평으로 번역하여 샘플 스캔 전후에 수집됩니다. 어두운 필드는 X-ray 셔터를 닫아 수집합니다.이것은 카메라가 X-ray 없이 표시하는 신호의 양을 측정합니다. 스캔이 완료되면 원본 2D TIFF 이미지를 획득 컴퓨터에서 파일 서버로 전송한 다음 데이터 처리에 사용할 컴퓨터로 내보냅니다. 다음으로, 이미지를 퍼센트 전송 스케일로 변환해야 합니다.Beamline 8.3 0.2에는 무료로 제공되는 소프트웨어 패키지와 함께 다운로드하여 사용할 수 있는 사용자 지정 배경 정규화 플러그인이 있습니다. Image J 또는 Fiji는 정규화된 이미지를 Octopus 소프트웨어 패키지에 로드한 다음 지정된 처리 단계를 사용하여 2D 원시 TIFF 이미지 파일에서 3D 데이터 세트를 재구성합니다. 다음으로, 이미지 스택은 다양한 소프트웨어 패키지 중 하나에서 시각화할 수 있습니다.여기서 aviso 소프트웨어 패키지가 사용되어 데이터 세트를 시스템 메모리에 로드하고 샘플을 가상 가로, 세로 또는 방사형 슬라이스 방향으로 표시합니다.데이터 세트의 3D 속성으로 인해 샘플을 통한 가상 슬라이스는 관심 영역에 정렬하기 위해 모든 평면에서 회전할 수 있습니다. 세분화가 완료되면 대상 식물 구조 또는 부피, 길이, 너비, 물, 공기 등의 존재 또는 부재 등의 기능적 변화를 정량화할 수 있습니다. 싱크로트론 HRCT 스캔은 Beamline 8.3 0.2를 사용하여 다양한 식물 조직 및 종에 성공적으로 구현되었으며, 전례 없는 3D 해상도로 식물 물관부의 구조와 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.여기에서 볼 수 있듯이 3D 재구성이 제공하는 시각화 및 탐색 기능을 통해 소비세 샘플과 살아있는 식물 모두에서 Xylem 네트워크를 사용하여 구조의 위치와 방향을 정확하게 결정할 수 있습니다. 여기에서 우리는 가뭄 스트레스를 받는 삼나무 줄기의 3D 재구성을 보고 공기와 물로 채워진 기관을 모두 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 몇 분 안에 수행할 수 있습니다. 주사 전자 현미경과 같은 다른 방법을 사용하여 식물 내부에서 볼 수 있는 구조를 검증하고 크기 임계값을 제시한 다음 데이터 분석에 사용하는 처리 프로그램에 공급할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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