공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 싱크로트론 기반 X선 마이크로 단층 촬영 기술을 활용하여 식물의 혈관 수송 구조와 기능을 탐구하는 것입니다. 이는 먼저 척 홀더 또는 라이브 플랜트 홀더에 설치할 샘플을 준비하고, 스캔할 부분이 가능한 한 수직인지 확인하고, 필요한 예비 생리학적 측정을 수행하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 준비된 샘플 또는 살아 있는 식물을 A LS Beamline 8.3 0.2 허치에 넣고 스캔을 위해 허치를 고정하는 것입니다. 다음.

샘플을 적절하게 배치한 후 스캔이 시작됩니다. 마지막 단계는 3D 시각화 프로세스를 위해 데이터를 VISO로 전달하기 전에 워크스테이션 컴퓨터를 활용하여 스캔 품질을 정규화, 재구성 및 평가하는 것입니다. 궁극적으로, X-ray 마이크로 단층 촬영은 식물의 물 전도 혈관 구조의 상호 연결 및 기능 상태에 대한 미세한 세부 사항을 밝히는 데 사용됩니다.

연속 절편 및 광학 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전례 없는 해상도로 모든 방향에서 식물 조직을 탐색할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 식물의 물 수송의 근본적인 측면부터 가뭄, 동결 내성, 숙주 식물에서 병원체가 체계적으로 이동하는 방법에 이르기까지 식물 생물학 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 설명된 바와 같이 이 프로토콜은 고급 광원에서 작동하도록 설계되었습니다.

8.3 0.2. 다른 싱크로트론 시설에서의 작업을 위해 빔라인 조정이 필요할 수 있습니다. 살아있는 식물에 대한 샘플 준비를 시작하기 위해 이러한 시설 사용에 필요한 안전 및 방사선 교육을 따르십시오.

먼저 직경 약 10cm의 화분에서 식물을 재배하고 스캔할 식물의 주요 줄기 또는 다른 부분이 가능한 한 중앙에 있고 화분에서 수직으로 향하도록 합니다. HRCT 기기 Hutch의 물리적 치수는 살아있는 식물의 높이를 약 1미터로 제한합니다. 결과적으로 살아있는 식물의 이미징은 묘목이나 묘목에서 가장 잘 수행됩니다.

작은 화분에서 자란 것은 맞춤형 단단한 알루미늄 화분 홀더를 사용하여 살아있는 화분에 심을 식물을 장착합니다. 상판 높이는 다양한 냄비 높이를 수용할 수 있도록 조정해야 합니다. 여기에서 판의 상단은 토양 표면의 상단과 정렬되도록 설계되었으며 식물은 두 부분으로 구성된 플레이트의 중심에서 돌출

홀더에 장착되면 SHO 착륙선 스타일의 압력 챔버 또는 클립온 잎 매개변수를 사용하여 줄기 수분 전위를 측정하여 스캔하기 전에 식물의 생리학적 상태를 확인합니다. 줄기 주위에 작은 구리선 조각을 꼬아 반복적으로 스캔할 식물에서 일관된 스캔 위치를 보장하기 위한 수탁자 역할을 합니다. 이제 알루미늄 식물 홀더 위에 있는 식물 위에 얇은 벽의 아크릴 실린더를 놓고 나사로 제자리에 고정하여 샘플을 안정화합니다.

이미지 왜곡을 유발할 수 있는 식물 부품의 진동과 움직임을 더욱 최소화하기 위해 추가 플라스틱 랩, 종이 타월 및 테이프를 사용해야 합니다. 맞춤형 냄비 홀더를 에어 베어링 스테이지에 부착하고 X-ray 소스와 이미징 센서 및 카메라 장비 사이에 위치한 제자리에 고정합니다. 줄기를 가능한 한 수직으로 배치하고 샘플을 마그네틱 척 베이스의 중앙에 배치하여 시야에 유지되도록 하십시오.회전하는 동안 신선한 식물 재료, 일반적으로 줄기 또는 애완 동물은 살아있는 식물에서 즉시 제거한 후 스캔할 수 있습니다.

실험의 목적이 물관부 네트워크 전체를 시각화하는 것이라면 먼저 용기 내의 물을 배출하고 공기로 교체해야 합니다. 이렇게 하려면 비방 스타일의 압력 챔버에 샘플을 장착하고 약 5분 동안 저압으로 샘플을 통해 압축 공기 또는 질소를 밀어 넣습니다. 선박 네트워크를 대피시키는 데 필요한 시간이 종마다 다릅니다.

신선한 식물 조직에서 색전증 형성 정도를 평가하려는 경우, 신선한 면도날을 사용하여 수중에서 절단한 부위를 사용하여 식물에서 샘플을 절제합니다. 다음으로, 스캔 중 건조를 방지하기 위해 샘플을 파라폼 층으로 감싸고, 에어 베어링 스테이지 중앙에 나사로 고정된 금속판에 고정된 드릴 척에 샘플을 장착하고, 샘플이 시야에 남아 있도록 앞에서 설명한 대로 샘플을 수직으로 향하게 합니다. 건조된 목질 조직에서 샘플을 준비하려면 먼저 샘플을 약 6cm 길이로 자릅니다.

대상 스캔 영역에서 가능한 한 직선이고 직경이 약 1cm인 샘플을 선택하십시오. 다음 단계는 최적의 조직 샘플 시각화 및 이미지 대비를 보장하기 위해 전체 샘플을 천천히 탈수하는 것입니다. 목질 조직 샘플을 저온의 건조 오븐에 넣어 조직에 균열이나 균열을 일으키지 않고 샘플을 천천히 건조시킵니다.

일부 상황에서는 샘플에 신탁 마커를 부착하는 것이 바람직할 수 있습니다. 이를 통해 주사 전자 현미경을 사용한 후속 해부 및 시각화가 HRCT 이미지의 특정 지점을 향할 수 있습니다. 이렇게하려면 퍼퓸을 사용하여 금속 또는 유리 구슬 또는 와이어를 줄기 바깥쪽에 부착하십시오.

마지막으로, 스캔하기 전에 위에서 설명한 대로 드릴 검사와 중앙에 샘플을 장착합니다. 응용 프로그램에 가장 적합한 배율을 결정하십시오. 여기에 사용된 A LS Beamline 8.3 0.2는 2 x 5 x 및 10 x 배율의 렌즈로 스캔할 수 있는 기능이 있습니다.

X선 에너지를 15킬로 전자 볼트로 설정합니다. 노출 시간은 일반적으로 샘플의 두께와 밀도에 따라 달라지며 범위는 100에서 1000밀리초 사이입니다. 응용 프로그램에 적합한 각도 증분을 선택하십시오.

샘플은 스캔 중에 180도 회전하며, 회전 중에 촬영된 이미지의 수는 데이터 세트의 크기, 스캔 간격의 길이 및 최종 이미지 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적인 스캔은 0.25도 단위로 수행되며 스캔당 513개의 이미지를 얻을 수 있습니다. 연속 단층 촬영 설정을 사용하면 스캔 간격을 단축할 수 있으며, 이 기간 동안 샘플이 계속 회전하는 동안 각 스캔에 대한 이미지가 캡처되며, 명시야 및 암시야 이미지도 수집해야 합니다.

명시야 이미지는 빔에 샘플이 없는 이미지입니다. 이는 종종 샘플을 수평으로 번역하여 샘플 스캔 전후에 수집됩니다. 어두운 필드는 X-ray 셔터를 닫아 수집합니다.

이것은 카메라가 X-ray 없이 표시하는 신호의 양을 측정합니다. 스캔이 완료되면 원본 2D TIFF 이미지를 획득 컴퓨터에서 파일 서버로 전송한 다음 데이터 처리에 사용할 컴퓨터로 내보냅니다. 다음으로, 이미지를 퍼센트 전송 스케일로 변환해야 합니다.

Beamline 8.3 0.2에는 무료로 제공되는 소프트웨어 패키지와 함께 다운로드하여 사용할 수 있는 사용자 지정 배경 정규화 플러그인이 있습니다. Image J 또는 Fiji는 정규화된 이미지를 Octopus 소프트웨어 패키지에 로드한 다음 지정된 처리 단계를 사용하여 2D 원시 TIFF 이미지 파일에서 3D 데이터 세트를 재구성합니다. 다음으로, 이미지 스택은 다양한 소프트웨어 패키지 중 하나에서 시각화할 수 있습니다.

여기서 aviso 소프트웨어 패키지가 사용되어 데이터 세트를 시스템 메모리에 로드하고 샘플을 가상 가로, 세로 또는 방사형 슬라이스 방향으로 표시합니다.데이터 세트의 3D 속성으로 인해 샘플을 통한 가상 슬라이스는 관심 영역에 정렬하기 위해 모든 평면에서 회전할 수 있습니다. 세분화가 완료되면 대상 식물 구조 또는 부피, 길이, 너비, 물, 공기 등의 존재 또는 부재 등의 기능적 변화를 정량화할 수 있습니다. 싱크로트론 HRCT 스캔은 Beamline 8.3 0.2를 사용하여 다양한 식물 조직 및 종에 성공적으로 구현되었으며, 전례 없는 3D 해상도로 식물 물관부의 구조와 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 3D 재구성이 제공하는 시각화 및 탐색 기능을 통해 소비세 샘플과 살아있는 식물 모두에서 Xylem 네트워크를 사용하여 구조의 위치와 방향을 정확하게 결정할 수 있습니다. 여기에서 우리는 가뭄 스트레스를 받는 삼나무 줄기의 3D 재구성을 보고 공기와 물로 채워진 기관을 모두 보여줍니다. 이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 몇 분 안에 수행할 수 있습니다. 주사 전자 현미경과 같은 다른 방법을 사용하여 식물 내부에서 볼 수 있는 구조를 검증하고 크기 임계값을 제시한 다음 데이터 분석에 사용하는 처리 프로그램에 공급할 수 있습니다.