조건부 Stat3 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석

유전자 조작 마우스 모델은 in vivo에서 인간 질병의 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 생쥐의 골격 표현형을 분석하는 것이 골격 연구의 기초입니다. 이 입자는 골격 표현형을 분석하기 위한 몇 가지 일반적인 기술을 설명하며, 이는 골격 조직 연구를 처음 접하는 사람들에게 흥미로울 수 있습니다.

이 입자를 시도할 때 동물 실험에는 시간이 걸리므로 단기간에 필요하지 않더라도 각 실험에서 가능한 한 많은 고품질 샘플을 수집해야 한다는 점을 명심하십시오. 먼저 안락사된 쥐를 누운 자세로 눕히고 손으로 양측 고관절을 부드럽게 탈구합니다. 안과 가위를 사용하여 원위 경골의 피부를 수직으로 잘라낸 다음 뒷다리의 모든 피부를 제거합니다.

오른쪽 고관절과 무릎 관절의 관절 인대를 가위로 잘라 뒷다리를 분리합니다. 그런 다음 뼈를 4% PFA에 완전히 담그기 위해 양쪽 끝의 뼈를 자릅니다. trochanter와 비골의 접합부를 자릅니다.

뒷다리를 4% PFA에 담그고 파라핀 절편에 적합한 뒷다리를 유지합니다. 왼쪽 엉덩이와 무릎 관절의 관절 인대를 가위로 자르고 연조직을 부드럽게 제거합니다. 경골과 대퇴골을 분리하고 75% 에탄올에 따로 담급니다.

마이크로 CT 스캔을 위해 대퇴골을 유지하고 칼세인 및 알리자린 레드 이중 라벨링을 위해 경골을 유지하십시오. 파라핀 절편을 준비하려면 고정된 오른쪽 뒷다리를 PBS로 10분 동안 부드럽게 세 번 씻습니다. 그런 다음 뼈가 구부러질 수 있을 때까지 3-4주 동안 초음파 석회질 제거제와 15% EDTA로 석회질을 제거하고 격일로 석회질 제거액을 교체합니다.

석회질 제거 후 PBS로 표본을 세 번 세척하고 섭씨 4도의 75% 에탄올에 밤새 담그십시오. 둘째 날에는 검체를 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자일렌에 각각 1시간 동안 순차적으로 담그십시오. 표본을 크실렌 반과 파라핀 반에 30분 동안 담근 다음 섭씨 65도의 파라핀에 밤새 담근다.

표본을 삽입하려면 파라핀에 담그고 대퇴골과 경골을 90도 각도로 배치합니다. 파라핀이 완전히 냉각되면 매립 탱크에서 시편을 제거합니다. 번호를 매기고 밤새 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

파라핀 부분을 섭씨 65도에서 30분 동안 구운 다음 자일렌에 10분 동안 담가 왁스를 드십시오. 매번 신선한 자일렌으로 섹션을 세 번 담그십시오. 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올 및 증류수에 각각 5분 동안 순차적으로 담그어 섹션을 재수화합니다.

TRAP 염색 키트를 사용하여 염색 용액을 준비하고 섭씨 37도로 예열합니다. 각 섹션에 50-100마이크로리터의 염색 용액을 추가하고 섭씨 37도의 습한 챔버에서 20-30분 동안 배양합니다. 빨간색 다핵 파골세포가 보일 때까지 5분마다 광학 현미경으로 파골세포의 염색 상태를 확인합니다.

그런 다음 물로 반응을 끝내십시오. 헤마톡실린 용액에 절편을 30초 동안 counterstaining하고 1%암모니아 용액에 1분 동안 침지시켜 안정된 청색을 만듭니다. 그런 다음 천천히 흐르는 수돗물로 헹굽니다.

중성 발삼이 있는 커버 슬립을 사용하여 섹션을 장착하고 밤새 말리십시오. 현미경으로 3-5개의 시야를 캡처하고 이미지 J.로 섬유주 둘레를 분석합니다.직선 도구를 사용하여 눈금 막대의 길이를 L1으로 측정합니다. 그런 다음 segmented line 도구를 사용하여 섬유주 둘레의 길이를 L2로 측정합니다. 물리적 길이를 계산하고 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 세포의 수를 계산합니다. 고정 후 PBS로 경골을 3회 부드럽게 세척하고 표본을 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자일렌에 각각 5분씩 순차적으로 담그십시오.

표본을 아세톤에 12시간 동안, 아세톤 절반과 수지 절반을 2시간 동안 담근 다음 순수 수지에 건조 오븐에서 밤새 담급니다. 적절한 실리카겔 매립 탱크에 순수 수지를 넣고 기포를 피하면서 시료를 탱크에 넣습니다. 수지를 섭씨 60도의 건조 오븐에서 48시간 동안 중합합니다.

회전식 마이크로톰을 사용하여 표본을 5마이크로미터 두께의 절편으로 연속적으로 절단하고 나머지 샘플은 건조제와 함께 실온에서 보관합니다. 75% 에탄올 한 방울에 핀셋으로 섹션을 부착하고 중성 발삼을 사용하여 커버 슬립으로 장착합니다. 형광 현미경으로 빨간색과 녹색 형광 라벨을 캡처합니다.

파골세포 분화에 대한 Stat3 결실의 영향을 연구하기 위해 파골세포 특이적 Stat3 결실 마우스를 생성했습니다. 마이크로 CT에 의한 대퇴골 재건 및 정량 분석은 Stat3 Ctsk 마우스의 골량이 야생형 마우스에 비해 증가했음을 나타냅니다. 야생형 및 Stat3 Ctsk 마우스의 대퇴골의 히스토 형태학을 H 및 E 염색을 통해 검사했습니다.

TRAP 염색을 사용하여 골형성 활성을 검출했습니다. 파골세포는 여러 개의 핵을 가진 큰 TRAP 양성 세포입니다. TRAP 양성 파골세포의 수는 야생형 마우스에 비해 Stat3 Ctsk 마우스에서 더 적었으며, 이는 Stat3 결핍이 파골세포 형성을 손상시켰음을 나타냅니다.

골형성은 칼세인(calcein)과 알리자린(alizarin) 적색 이중 표지로 측정하였다. 칼세인(calcein)과 알리자린(alizarin) 적색 형광 사이의 영역은 새로 형성된 뼈를 나타냅니다. 파골세포에서 삭제된 Stat3는 뼈 동화작용에 영향을 미치지 않았습니다.

나중에 연골이 대칭을 이루고 명확한 M자형 선이 여기에 사용되었음을 보여주는 시상 파라핀 절편. 연구를 위해 기계적 특성과 같은 골격계의 더 많은 특성을 포함할 것입니다.