재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

이 구조-기능 방법의 전반적인 목표는 미성숙하거나 분화된 마우스 배아 줄기 세포에서 다른 단백질 도메인 또는 질병 관련 돌연변이의 역할을 분자 수준에서 해부하는 것입니다. 이 방법은 단백질의 다양한 잔류 물 또는 도메인이 주어진 세포 맥락에서 단백질의 기능에 어떻게 기여할 수 있는지 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 knock out 배아 줄기 세포 또는 ES 세포의 게놈에 대한 구조 구조를 매우 효율적으로 표적으로 삼고 다양한 세포 유형에서 이들의 역할을 조사할 수 있다는 것입니다.

이를 위해 우리는 세 가지 고효율 기술을 결합합니다. 여기에는 향상된 마우스 배아 줄기 세포 분리, 재조합 기반 표적화 인자 조립, 재조합 매개 카세트 교환(RMC)을 통한 ES 세포 표적화가 포함됩니다. 일부 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 기술자인 Jinke D'Hont입니다.

RMCE(Recombination-mediated cassette exchange)는 벡터와 게놈 유전자 자리 사이에서 DNA 단편을 교환할 수 있도록 합니다. RMCE는 교차 반응하지 않고 게놈 자리에 내장된 이종 특이적 재조합 부위를 활용합니다. 동일한 이종 특이적 부위 옆에 있는 DNA 단편을 포함하는 donor plasmid가 있는 경우, 재조합효소는 이중 동시 전좌로 인해 이 DNA 단편을 RMCE 호환 유전체 자리에 삽입합니다.

올바른 재조합 시에만 Rosa 26 도킹 부위에 포획된 프로모터가 없는 네오마이신 내성 유전자가 유입되는 표적 벡터의 PGK 프로모터를 통해 복원되어 약물 내성을 생성합니다. 이 네오마이신 저항성 트랩 시스템은 매우 높은 표적 효율을 제공하며, 종종 100%에 가깝습니다.배반포 분리 전날 12개의 잘 배양된 플레이트에 0.1%젤라틴을 추가합니다. 그리고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

젤라틴 용액을 흡입하십시오. 그런 다음 P2 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 바이알의 1/4을 MEF 배지에 파종하고 12웰 플레이트로 나눕니다. MEF의 12웰 플레이트를 섭씨 37도에서 2밀리리터의 MEF 배지로 배양합니다.

그리고 세포를 합류 단층으로 성장시킵니다. 그런 다음 밀리리터당 10마이크로그램의 미토마이신 씨앗을 웰에 추가합니다. 그리고 세포를 비활성화하기 위해 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양물을 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Rosa 26 유전자 자리에서 RMCE 카세트를 포함하는 이형접합 녹아웃 마우스를 선택한 후, 이형접합 녹아웃 마우스와 함께 RMCE 호환 이형접합 녹아웃 마우스를 번식시키기 위해 짝짓기를 설정합니다. 다음 날 아침, 이야기의 바닥으로 암컷을 들어 올려 교미 마개가 있는지 확인하고 질 입구에 희끄무레한 덩어리가 있는지 검사합니다. 플러그가 잘 보이지 않으면 각진 프로브를 사용하여 외음부의 입술을 약간 벌린 다음 플러그가 있는 암컷을 수컷과 분리합니다.

성교 후 3.5일 또는 DPC에 배반포를 수집합니다. 임신한 암컷을 안락사시킨 후 복부 중앙을 절개하고 가는 가위와 집게를 사용하여 자궁과 난관을 절개합니다. 그런 다음 M26 매체로 채워진 1ml 주사기에 부착된 2게이지 바늘을 45도 각도로 구부립니다.

그리고 난관에서 가장 가까운 자궁 끝에 바늘을 삽입합니다. 가는 집게를 사용하여 바늘을 제자리에 고정하고 플런저를 밀어 자궁의 배반포를 10cm 접시 뚜껑으로 씻어냅니다. 플러싱이 성공하면 자궁이 부풀어 오를 것입니다.

구강 피펫을 사용하여 M2 배지 한 방울에 모든 배아를 모으고 M2 배지 한 방울로 배아를 두 번 씻습니다. 배아를 세척한 직후, PBS를 사용하여 미토마이신-C가 비활성화된 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 구강 피펫을 사용하여 만능 또는 2I이 보충된 SRES 세포 배지에서 미토마이신-C 처리된 MEF의 별도 웰에 각 배반포를 플레이트

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양물을 배양합니다. 2-3일마다 SREF 세포 배지를 새로 고칩니다. 4X 배율의 실체 현미경으로 각 배반포를 검사하고 MEF 층의 부화 및 분리를 확인합니다.

10-12일 동안 배양한 후 실체 현미경으로 일회용 팁이 있는 P10 피펫을 사용하여 개별 icium 파생물을 선택합니다. 각 outgrowth를 약 10μl의 배지로 PBS당 30μlit를 포함하는 V자형 96-well plate로 옮깁니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 50마이크로리터의 0.25%트립신을 추가합니다.

그리고 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 3분 동안 배양합니다. 100마이크로리터의 사전 배양된 FPS 함유 ES 세포 배지를 첨가하고 10-15회 피펫팅하여 icium 파생물을 단일 세포로 해리합니다. 그런 다음 해리된 세포를 미토마이신-C 처리된 96웰 MEF 플레이트로 옮깁니다.

다음 날 SR 기반 매체를 변경합니다. 유사한 방식으로 ES 셀을 24웰 플레이트에서 6웰 플레이트로 확장합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 구출된 CDNA 벡터를 식별한 후, 파지 인코딩 인테그라제, 절제효소 및 박테리아 통합 숙주 인자를 포함하는 100 나노그램의 구조 CDNA 벡터, 150 나노그램의 사전 절제된 RMCEDV1 벡터 및 2마이크로리터의 재조합 효소 혼합물을 사용하여 10 마이크로리터 LR 반응을 준비합니다.

2시간 동안 섭씨 25도에서 반응을 배양합니다. 재조합된 벡터를 변형시키려면 2ml 스커트 스크류 캡 튜브에 각 혼합물 5마이크로리터를 열 충격 가능 E.Coli 박테리아 40마이크로리터에 추가합니다. 그리고 샘플을 얼음에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 튜브에 LB 배지 1ml를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 암피실린이 있는 한천 플레이트에 50마이크로리터를 플레이트합니다.

그리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 자랍니다. P200 팁을 사용하여 5개의 군체를 무작위로 선택하여 올바른 표적 벡터를 가진 군체를 식별합니다. 팁을 2-5밀리리터의 LB 배지가 들어 있는 유리 시험관에 옮기고 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다.

각 콜로니에서 DNA를 추출한 후 0.5-2마이크로그램의 DNA를 분해하여 샘플을 검증하고 1% 아가로스 겔에서 샘플을 분리합니다. RMCE 호환 녹아웃 ES 세포 배양을 시작하고 FBS 기반 ES 세포 배지에서 MEF에서 최소 2회 계대배양을 수행합니다. 그런 다음 젤라틴화된 6웰 플레이트에서 ES 세포를 분할합니다.

다음 날, 1.5ml의 FBS 기반 ES 세포 배지를 사용하여 약 50% confluent인 ES 세포를 새로 고칩니다. rescue CDNA를 함유한 1마이크로그램의 사전 절제된 RMCEDV1 표적 벡터와 1마이크로그램의 FLIPe 발현 플라스미드를 250마이크로리터의 순수 DMEM 배지에 결합합니다. 7마이크로리터의 리포펙틴 기반 형질주입 시약을 250마이크로리터의 순수 DMEM 배지에 첨가합니다.

그리고 용액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. DNA와 리포펙틴 용액을 결합합니다. 그리고 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 주입 혼합물을 새로 고친 ES 세포에 피펫으로 주입하고 부드럽게 휘젓습니다. 형질주입 하루 후, 튜브의 모든 ES 세포를 DR4 MEFS의 합류층과 10ml의 FPS 기반 ES 세포 배지가 있는 10cm 배양 접시로 분리합니다. transvection 2일 후, 배지에 G418을 첨가하여 올바른 FLIP-e 매개 카세트 교환이 있는 ES 세포 클론을 선택합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 표적이 아닌 군체에 대한 대량 살해는 3일에서 5일 후에 볼 수 있어야 합니다. 군체는 7일에서 10일 후에 나타나야 합니다. 이 군체를 선택한 다음 확장하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 클론을 확인합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Rosa 26 구동 구조 구조체로 녹아웃 ES 세포를 배양한 후 ES 세포를 배아체 또는 EB로 분화하기 위해 30일 동안 비부착성 접시에서 EB가 형성되도록 합니다. 2-3일마다 EB 현탁액을 50ml 튜브로 옮겨 배지를 새로 고칩니다. 그리고 EB가 중력에 의해 정착하도록 하십시오.

상층액을 제거하고 새로운 배지를 추가한 다음 EB 현탁액을 박테리아 등급 접시로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 면역형광 및 TEM으로 ES 세포와 EB를 분석합니다. 구조 함수 방법을 사용하여 100%의 효율로 5개의 사전 절제된 RMCEDV1 표적화 벡터를 생성했으며, 이러한 구조 구조체는 RMCE를 통해 97%의 효율로 P120 카테닌 녹아웃 ES 세포를 표적화했으며, 낭포 EB 형태학은 다양한 구조 구조체를 스크리닝하기 위한 표현형 판독으로 사용할 수 있습니다.

개념 증명으로 R26 구동 P120 카테닌 동형체 1A는 p120 카테닌 녹아웃 표현형을 구출했습니다. P120 카테닌의 E-cadherin 독립 막 고정이 CSYTIC EB 형성을 가능하게 하는지 여부를 테스트하기 위해 k-ras 막 표적 모티프인 CAAX를 P120 카테닌의 카르복시 말단에 융합하고 RMCE를 통해 P120 카테닌 녹아웃 ES 세포에 도입한 후 EB를 만들었습니다. 그러나, 이 구조체는 E-cadherin의 결합 및 안정화를 허용하지 않는 지배적인 음성을 제공합니다.

그리고 결과적으로, p120 카테닌 녹아웃 표현형을 구출하지 않습니다. 상피-중간엽 전이(EMT)는 ES 세포 분화 중에도 발생하는 필수 발달 과정입니다. p120 카테닌이 ES 세포를 녹아웃할 때, E-cadherin과 같은 다양한 상피 마커 유전자를 직접 억제할 수 있는 EMT 유도 물질인 ZEB1, ZEB2 또는 달팽이는 낭성 EB 형성을 회복하지 못했습니다.

마스터링이 완료되면 RMCE 호환 ES 셀을 1개월 이내에 분리할 수 있습니다. RMCE 호환 타겟팅 벡터는 1주일 이내에 생성될 수 있으며, 적절하게 수행된다면 이 기술을 사용하여 1개월 이내에 ES 세포의 표적 구조를 달성할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RMCE를 사용하여 미접촉 또는 분화된 배아 줄기 세포에서 구조 기능 연구를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.