구슬에 갈렉틴-3 - U1 snRNP 복합체에 의한 접합 활동의 보완

이 보고서는 galectin-3 U1 snRNP complex가 pre mRNA 기질에 결합하여 기능성 복합체를 형성하고 스플라이싱 반응의 산물로 이어진다는 문서에 대한 실험적 증거를 제공합니다. 이 프로토콜은 항-gal3 항체에 공유 결합된 비드에서 선택된 galectin-3 U1 snRNP 면역을 활용하여 스플라이싱 반응을 시작하여 완료까지 진행할 수 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 galectin-3 U1 snRNP 복합체를 포함하는 비드를 펠릿화한 후 액체를 조심스럽게 제거하고 스플라이싱 반응을 시작하는 데 즉시 사용하는 것입니다.

핵 추출물에서 U1 snRNP를 고갈시키려면 200마이크로리터의 핵 추출물을 100마이크로리터의 항-U1 비드로 배양합니다. 혼합물에 5마이크로리터의 RNA를 추가하고 1시간 동안 섭씨 4도에서 마이크로 튜브 헤드를 꼬리 위로 회전시킵니다. 원심분리로 혼합물을 펠렛화하고 Hamilton 주사기를 사용하여 결합되지 않은 물질을 수집합니다.

분도 4도에서 60% 완충액 D에 대해 75분 동안 교반하면서 마이크로 투석기의 별도 구획에 원래의 비고갈 핵 추출물의 별도 50마이크로리터 분취액과 함께 U1 고갈 핵 추출물의 전체 부피를 투석합니다. 분자량이 8K 절단된 투석막을 사용하십시오. 투석 직후, 제제를 20마이크로리터 분취액으로 나누어 드라이 아이스 에탄올 수조에 넣어 얼려 영하 80도에서 보관합니다.

사용 직전에 0.5ml의 TX 세척 버퍼로 anti-gal3 비드를 두 번 세척하십시오. 세탁할 때마다 세척 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 먼저 마이크로피펫으로 상층액을 제거한 다음 Hamilton 주사기로 비드에서 액체를 제거합니다.

핵 추출물을 12%에서 32%의 글리세롤 구배로 분획합니다. 10S 영역 근처에 있는 글리세롤 구배 분획 3, 4, 5를 결합하고 혼합합니다. 3에서 5까지 결합된 구배 분획의 150마이크로리터 분취량 2개를 준비하고 50마이크로리터의 anti-gal3 비드에 넣습니다.

동시에 각각 150마이크로리터의 분획 1이 있는 두 개의 샘플을 준비하고 50마이크로리터의 안티-gal3 비드에 넣습니다. 대조군으로, 150마이크로리터의 60%버퍼 D를 50마이크로리터의 안티-갈3 비드에 넣습니다. 튜브를 두드려 부드럽게 섞은 다음 섭씨 4도에서 1시간 동안 머리 위로 꼬리 위로 돌립니다.

부드러운 원심분리로 샘플을 펠렛화합니다. 마이크로피펫으로 대부분의 상층액을 제거합니다. 해밀턴 주사기를 사용하여 바늘 끝을 비드 바닥에 조심스럽게 삽입하여 상층액을 제거합니다.

접합 반응을 위해 비드를 즉시 사용하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 스플라이싱 반응을 조립하고 한 세트의 비드 샘플에 추가합니다. 총 부피가 24마이크로리터이지만 U1이 고갈된 핵 추출물이 없는 동일한 스플라이싱 반응 세트를 조립하고 다른 비드 세트에 추가합니다.

총 부피 12 μl에 비드가 없는 상태에서 수행할 제어 접합 반응을 준비합니다. 이 제어 반응에는 핵 추출물, 60% 버퍼 D 및 방사성 접합 기판이 포함됩니다. 튜브를 두드려 부드럽게 혼합하고 섭씨 30도에서 90분 동안 머리 위로 회전시킨 다음 부드러운 원심분리로 혼합물을 펠릿으로 만듭니다.

비드가 들어 있는 튜브에 24마이크로리터의 2X SDS 샘플 버퍼를 추가하고 핵 추출물이 들어 있지만 비드는 없는 제어 튜브에 2X SDS 샘플 버퍼 12마이크로리터를 추가하여 반응을 중지하고 비드에서 단백질을 용리시킵니다. 각 튜브를 소용돌이치십시오. 튜브를 섭씨 100도에서 7분 동안 가열합니다.

1, 10 15 초 동안 실내 온도에 진동하는 물통 회전자에 있는 000 시간 G에 관을 원심분리기. 상등액을 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다. 단백질분해효소 K당 20mg을 첨가하여 단백질을 소화하고 용해시킵니다.

튜브를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 부드럽게 원심분리합니다. 비드 elusions를 39.5 μlit TE 및 10 μl의 3 molar sodium acetate로 희석합니다.

핵 추출물 대조군을 63.5마이크로리터 TE 및 10마이크로리터의 아세트산나트륨으로 희석합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 RNA를 추출하고 분석합니다. anti-gal3에 의해 침전된 글리세롤 구배 면역침전의 10S 영역에서 U1 snRNP 및 gal3 U1 snRNP 복합체가 고갈된 핵 추출물을 스플라이싱 반응에서 혼합했습니다.

이 반응 혼합물은 U1 snRNA와 U1 특이적 단백질 U1-70K를 함유했습니다. 예상대로, anti-gal3는 gal3를 침전시켰다. U1 snRNA, U1-70K 단백질 및 gal3는 면역 조절 전 침전에서 발견되지 않았습니다.

양성 대조군으로 수행된 비고갈 핵 추출물과 비교하여 U1 snRNP가 고갈된 핵 추출물은 접합 활성을 나타내지 않았습니다. U1이 고갈된 핵 추출물의 스플라이싱 활성은 비드 결합 gal3 U1 snRNP 복합체에 의해 재구성될 수 있습니다. 스플라이싱 반응의 두 생성물은 모두 중간 생성물뿐만 아니라 결찰된 엑손과 절제된 인트론 라리아트가 발견되었습니다.

분획 3에서 5까지의 성분은 U1이 고갈된 핵 추출물의 접합을 복원하는 데 중요했습니다. 이러한 분획을 완충액 단독으로 대체했을 때 접합 활성이 관찰되지 않았으며, 이는 anti-gal3 비드가 U1이 고갈된 핵 추출물에서 접합 활성의 복원에 책임이 없음을 나타냅니다. 보다 설득력 있게 말하자면, 면역침전 절차에서 분획 3에서 5를 분획 1로 대체한 다음 U1이 고갈된 핵 추출물에 첨가했을 때, 스플라이싱 반응의 중간체 또는 생성물이 발견되지 않았습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 한 사람은 면역침전을 완료하고 다른 사람은 가능한 한 적은 지연으로 스플라이싱 반응을 준비해야 합니다.

U1이 고갈된 핵 추출물에 대한 스플라이싱 활성을 회복시키는 갈렉틴-3 U1 SNRP의 폴리펩타이드 조성에 대한 단백질체 분석은 큰 관심사가 될 것입니다.