Name: 유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 학습하세요 유중수 에멀젼 원심분리법을 이용한 거대 소포체 제조 방법을 합성생물학 및 인공세포 연구에 활용하는 기술입니다. DOPC와 Texas Red DHPE를 사용하여 미세구체를 캡슐화하는 실험 절차를 익히세요.

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우리는 그림 1에 개략적 인 이미지를 그리기 위해 야마구치 토모코 감사합니다. 본 연구는 자연 과학의 theNational 연구소의 통합적인 생명의 오카자키 연구소의 오카자키 ORION 프로젝트 (NINS)에 의해 지원되었다; 우주 생물학 센터 프로젝트 NINS의 (. 더 AB281010)에 의해; (. 어떤 25102008) 혁신 분야의 과학 연구 (통합 기능의 창조를위한 생체 분자 시스템의 역학적 순서) 과학 진흥 일본 사회에서에 대한 보조금의 원조 (JSPS)에 의해; 젊은 과학자에 대한 보조금의 원조 (B)에 의해 (KK에, 15K17850 없음.) JSPS에서; andby 그랜트 -에 - 보조 연구 활동 스타트 업에 대한 (YN에, 아니. 15H06653) JSPS에서. 추가 지원은 노구치 연구소, 예술과 과학의 카오 재단 보조금, 그리고 쿠 리타 물과 환경 재단 보조금에서 교부금에 의해 제공되었다.

원 / O 에멀젼 원심 분리 방법에 의해 GVS 1. 준비 <ol><li> 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린의 원액 (DOPC, 25 mM)을 텍사스 레드 1,2- dihexadecanoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine의 원액, 트리 에틸 소금 (텍사스 레드 준비 DHPE, 0.20 클로로포름 밀리미터) 및 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장합니다. </li><li> 오일 솔루션을 준비합니다. <ol><li> DOPC 스톡 용액 (51.0 μL, 질소 가스 흐름하에 텍사스 ​​레드 DHPE 스톡 용액 (19.2 μL)의 혼합물을 증발시켜 5 mL 유리 병의 내부 표면에 지질 막을 형성한다. </li><li> 하룻밤 감압 필름을 품어 다음 (g / cm 3 0.86-0.89) 유리 병에 액체 파라핀 1.0 ml에 추가 할 수 있습니다. 알루미늄 호일의 병을 감싸고 나머지 80 ° CO / N에 그것을 품어. 3 밀리미터 - DOPC 텍사스 레드 DHPE의 최종 농도는 1.3 및 3.8 × 10이다각각 및 DOPC : 0.3 : 텍사스 레드 DHPE 몰비는 100이다. </li></ol></li><li> 내부 수성 분산액을 준비합니다. <ol><li> 1.5 ml의 뚜껑있는 마이크로 튜브에 1.0 μm의 비 형광 마이크로 스피어 (2.5 부피 %), 1.0 ㎛의 형광 마이크로 스피어 (2.5 부피 %)의 분산액 12.5 μL의 분산액 237.5 μL를 혼합; 형광 마이크로 스피어에 비 형광 5 (v / v)의 비율이 95에 대응한다. </li><li> 트리스 완충 용액 125 μL (TBS, 1 M) 및 탈 이온수 875 ㎕를 다음 자당의 64 mg을 추가합니다. 미소 구체의 최종 부피 분율은 0.5 체적 %이고, 트리스 - 염산 (pH를 7.5) 수크로오스의 최종 농도는 각각 0.1 M 및 0.15이다. </li><li> 소용돌이 30 초에 대한 마이크로 튜브 후 10 분 정도 초음파 처리. </li></ol></li><li> 외부 수용액을 준비합니다. <ol><li> 트리스 완충 용액 10 ㎖를 제조 한 후 (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M glucOSE) 내 수성 매질과 같은 절차에 마이크로 튜브를 뚜껑이있는 1.5 ml의 용액 1 ㎖를 배치했다. 소용돌이 30 초에 대한 마이크로 튜브 후 10 분 정도 초음파 처리. </li></ol></li><li> 마이크로 스피어를 포함하는 아 / O 에멀젼을 준비합니다. <ol><li> 1.5 ml의 마이크로 튜브의 내부 수용액 300 μL와 오일 용액 (액체 파라핀 함유 DOPC 및 텍사스 레드 DHPE) 1 mL를 섞는다. </li><li> 기계적 균질 기 (고속 회전 블레이드 교반기)를 사용하여 모세관의 두 성분들을 유화 실온에서 2 분 동안 10,000 rpm으로 작동. </li></ol></li><li> GVS을 침전. <ol><li> 부드럽게 마이크로 튜브를 뚜껑이있는 1.5 ml의 4 ° C에서 외측 수용액 1 ㎖의 상면 w / o 에멀젼의 300 μl를 층을 포함한다. 4 ℃에서 10 분 동안 마이크로 튜브를 진정. </li></ol></li><li> GVS를 수집합니다. <ol><li> 즉시 마이크로 튜브를 차게 한 후,30 분 동안 18,000 x g에서이를 원심 분리. 압정으로 마이크로 튜브의 바닥을 관통하고 멸균 1.5 ml의 마이크로 튜브에 한 방울을 수집하여 침전 GVS를 얻습니다. </li><li> 얻어진 GVS 관찰을 어렵게 할 정도로 다량으로 얻어진 경우 희석 석출 GV는 외측 수성 용액 부피 10-100 배 액적. </li></ol></li></ol> GVS 2. 현미경 관찰 <ol><li> 현미경 표본을 준비합니다. <ol><li> 현미경 커버 유리 상단에 현장 중합 효소 연쇄 반응 및 혼성화 (챔버 크기 두께 9mm X 9mm X 0.3 mm)에 대한 접착 배양 챔버를 놓습니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 희석 기탁 25 μL가 검지 영역 GVS 침전 즉시 배양 챔버의 상부에 다른 커버 유리 (약 0.15 mm 두께)를 배치했다. </li></ol></li><li> 기록 미분 간섭 콘트라GVS의 t 현미경 이미지. <ol><li> 12V100WHAL-L 할로겐 램프가 장착 된 현미경 (10X, 20X, 40X 및 목적)와 소포의 기록 현미경 이미지. </li></ol></li><li> 형광 현미경 관찰을 실시한다. <ol><li> 현미경으로 U-FBNA 및 U-FMCHE 형광 미러 장치를 삽입합니다. 각각 각각 510-550 nm의 600-690 nm의 빛을 전송 방출 ​​필터 470-495 nm의 565-585 nm의 여기 필터와 장치를 장착한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

<html> 내부 수계 분산매 및 외측 수성 용액의 비중은 신중하게 선택되어야한다. 원 / O 에멀젼을 원심 분리시의 외측 수성 용액에 침전하기 위해서는 내부 수계 분산 매체의 비중 외측 수용액보다 커야한다. 우리는 설탕없이 내부 및 외부 솔루션을 사용하여 GVS을 준비하려고했으나 내부 수용액이 두 단계 사이의 간섭을 통과하기에 충분한 질량을 가지고 있지 않았기 때문에 우리는 이러한 조건에서 더 GVS을 얻을 수 없습니다. 축소하거나 파열 될 수도 외측 수용액에 침전 두 솔루션 GVS 사이에 큰 삼투압 차이가있는 경우. 따라서, 내부와 외부 GVS 삼투압은 같아야합니다. 이를 위해, 우리는 외측 수성 용액에 용질로서 내측 수성 분산액 및 글루코스 용질로서 자당을 사용하는; 모두 당 동일한 농도로 하였다. 두 소금SS = &quot;외부 참조&quot;&gt; 설탕 22 23, 35, 38 등의 목적으로 사용되고 있지만, 덜 독성 염보다 용해성 때문에 당 보통 사용된다. 설탕을 너무 많이 첨가하면 그러나 GVS 커버 유리와 붕괴의 바닥과 접촉 할 수있다. 이를 피하기위한 몇 가지 전략이있다. 하나의 전략은 GVS 온화한 조건 하에서 침전되도록 내측 및 외측 수성 용액 사이의 비중 차이를 감소시키는 것이다; 구체적으로는, 침전 GV 분산액의 상등액 부력의 결과로서 덮개 유리를 접착하여 소포 파괴의 가능성을 줄이기 위해 내부 수용액 동일한 용액으로 교환 될 수있다. 또 다른 전략은 얇은 지질막 29 커버 유리를 모두 프리 코트한다. 에멀젼의 적절한 준비와 배양된다중대한. 우리는 오일 용액을 제조하는 액체 파라핀을 사용했다. 미네랄 오일 26, 31, 21 도데 칸, (33)과 스쿠알렌 (33), (39)는 종종 용매 오일로 사용된다. 이들 재료는 비중, 점도 및 표면 장력에 차이가 있으므로 동일한 원심 분리 조건 (33)을 사용하는 경우, 소포 상이한 개수도 형성한다. 타겟 특성 소포를 얻기 위해서는,이 비중 및 내외 수용액의 점도뿐만 아니라 오일상의 원심 acceleration.For 제제를 최적화하는 것이 필수적이며, 배양 높은 온도에서 건조 발생해야 환경 인큐베이터 또는 탈수기 등. 본 연구에서는 완전히 지질 molecules.In 첨가 용해 80 ° C로 유동 파라핀을 가열하여 에멀젼해야필요하고는 제조 직후 불안정하므로 즉시 원심 분리한다로만 제조 할 방울이 쉽게 서로 융합 / O w 에멀젼 초음파, 볼 텍싱 또는 탭하여 대량으로 제조 할 수있다. 다만, 호모 게 나이저를 사용하면 고점도 오일 에멀젼 다량의 신속한 제조 쉽게 유화 가능하다. 이 에멀젼은 부드럽게 신속하고 4 ℃에서 후 냉장 외부 수용액에 적층하는 것이 중요하다. 유화 원심 분리 사이의 시간을 단축하기 위해, 오일 외측 수용액 시스템은 에멀젼이 그 상에 적층하기 전에 예냉 할 수 있고, 백탁이 빠르거나 느린 평소보다 기계적 표시 immediately.If 전체 시스템은 원심 분리 될 수있다 균질는 철저하게 청소 세제를 제거하는 세척해야합니다. 또한, 유화 전, 오일 용액, 내측 수성 용액 및 유화제 R 있어야실온 eturned. 적절한 원심 가속도도 중요하다. 18,000 x g에서 원심 분리함으로써 고농도로 캡슐화 한 내장재로 GVS을 제조 할 수 있었다. 복수의 재료의 밀봉이 요구되는 때, 원심 가속도를 저감하는 것이 좋다. 예를 들어, 일곱 화합물을 캡슐화 액틴 조립 시스템은 350 미만의 X g에서 원심 분리 (35)로 이루어졌다. 원심 분리가 바람직 인 경우 GVS는 당 농도를 조정하거나 그 자체 매스 (38), (40), (41)의 영향 하에서 에멀젼을 침전에 의해 얻어 질 수있다. 여기에보고 된 방법은 두 가지 제한 사항이 있습니다. Weit 의해 지적 된 바와 같이 하나의 GV 막 가용화 할 수있다 (이 경우에는 파라핀)이 오일 분자 인Z 그룹 21. GV 막으로 세포막 단백질의 삽입이 요구되는 경우 단백질에 공존 오일 분자의 영향이 고려되어야한다. 다른 제한은 체적 분율의 변화이다. 본 연구에서는 GVS 미소 구의 부피 분획을 4-30 부피 %에서 원거리 추정; 부피 분획 GV 제제에 사용되는 내부 수용액의 부피비 동일하지 않았다. 우리는 현미경 관찰 충분히 높은 부피비에서 GVS에 미세 캡슐화 할 수 있었지만,이 방법은 균일 한 부피 분율 분포 GVS의 제조에 적합하지 않다. 이는 미세 체적 분율의 분포가 원심 34 중의 변경 것으로보고되었다. 원 / O 에멀젼을 원심 분리 방법은 일반적으로 캡슐화 된 물질을 함유 GVS의 형성에 사용된다. 그러나, 몇 가지 보고서는 페이지를 설명했다마이크로 재료 (34), (42)을 캡슐화 GVS의 배상. 최근에 캡슐화 된 DNA 장치 또는 분자 장치를 포함하는 분자 로봇 (44) (43)로 구성되어있다. 구획 GVS는 이러한 종류의 응용 프로그램에 대한 첫 번째 선택이다; 따라서, 다양한 표면 작용으로 자성 구체 및 미세 캡슐화에 사용될 수 등 우리 같은 기술은, 44 유용한 것으로 예상 될 수있다.

<html> 건설적인, 또는 합성 생물학 접근 방식은 생활 사이의 경계를 탐구하고 문제를 무생물을위한 매력적인 수단이다. 셀은 생활에 필요한 최소 단위이기 때문에 우리는 현재를 이해, 다양한 연구자 인공 세포 내에서 발생하는 현상을 연구 할 수 있도록 해명의 궁극적 인 목표와 함께, 간단한, 잘 알려진 화학 물질 인공 세포를 구성하는 시도 삶의 기원과 살아있는 세포 1, 2, 3의 기본적인 기능을 연구. 특히, 4 소포 양친 매성 분자로 이루어지는 구형의 미세 구획은 이러한 단백질 5, 6, DNA 7, 8, 9 등의 생체 분자를 캡슐화 할 수있는,아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; (10)는 종종 생체막의 모델로 이용되고있다. 소체는, 크게 (직경 &lt;1 ㎛) 또는 거 (직경&gt; 1 ㎛) (&lt;100 nm의 직경을 갖는 것으로 정의 됨) 소형으로 분류 될 수있다. 들은 크기, 형상 및 구조로 살아있는 세포 유사하기 때문에 거대 소체 (GVS)은 광범위하게 연구되어왔다. GVS의 크기에 의해, GV 멤브레인의 형태 학적 변화를 용이하게 광학 현미경으로 실시간으로 관찰 할 수있다. GVS 제조 방법은 여러 가지 수화 제 12, 13, 동결 융해 법 (14), 전기 주조 방법 (15, 16), 상기 유체 기기에있어서 17, 18를 포함하여 11보고되었다. 그러나, 캡슐화 단백질 및 기타 macrom이러한 방법에 의한 고농도 GVS에 olecules 어렵다. 특히, 셀 (19), (20) 내부의 혼잡 환경을 모방하기에 충분한 양 (20 내지 30 부피 %)의 생체 물질을 캡슐화하는데 매우 도전적이다. GVS 즉시, 바이 츠 동료 유화 원심 분리 방법 (21, 22) (W / O) 유중 설립 형성한다. 이 방법은 다섯 가지 중요한 기능을 가지고 있습니다. 이 방법에 의해 제조 GVS 낮은 lamellarity 23 (24)을 가지고 있기 때문에 첫째, 세포막은 쉽게 변형 될 수있는 정도로 얇다. FtsZ (세균 세포 분열 단백질), 튜 불린 및 기타 거대 분자에 의해 유도 GV 막의 변형은 27, 26, 25 (28)을 연구하고 있으며, 우리는 polyhe 관찰<html> 구체 (29) (30)의 밀봉에 의한 GV 막의 dron 형상 변형. 둘째, 막 단백질 31 어려움 불구이 방법에 의해 소포 막에 삽입 될 수있다. 예를 들어, Yomo 그룹은 막 단백질 α-32의 용혈 관내 합성 및 기공 형성 활성을 연구하기 위해이 방법을 사용 하였다. 셋째, 내측 및 외측 소엽의 지질 성분이 다른 22되는 비대칭 GVS를 생성 할 수있다. 예를 들어이 Whittenton 외. 음으로 하전 된 폴리 뉴클레오티드를 캡슐화하는 내부 전단지에 양이온 성 지질,와 외부 전단지에 중성 지질과 생성 비대칭 GVS는 독성과 특이 세포 흡수 (33)을 감소시킵니다. 넷째, GVS 내부 물질의 농도 및 부피 분율이 상대적으로 높을 수있다S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 28, 34. 다섯째, 재료의 여러 가지 유형 (35)을 캡슐화 할 수있다. 예를 들면은, 니시무라 외. GVS로 시험 관내 전사 번역 시스템을 캡슐화하고 GVS 36에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 시스템을 사용 하였다. 이 다섯 기능은 유화 원심 분리 세포 흉내 GVS를 생성하기위한 필수적인 방법 O / w를 확인합니다. 이전 연구에서, 원심 분리에 의해 생성 GVS 최종 수용액 (22)의 일부를 포함하는 길이 16 G 스테인리스 바늘이 장착 된 주사기를 이용하여 수집 하였다. 미숙 기술자의 손이 수집 방법 쉽게 오일의 일부와 GV의 오염을 초래할 수있다. 본 연구에서 우리는 Yomo 기 (23), (37)에 의해 개발 된 W / O 에멀젼을 원심 분리 프로토콜을 사용구멍들이 제조되는 원심 관의 하단 연 통하여있는 GVS 침전을 수거한다. 우리는 세포 내 소기관의 크기와 비슷합니다 1.0 μm의 미소를 캡슐화 GVS를 준비했다. 마이크로 스피어의 사용은 우리가 체적 분율을 계산하여 농도를 추정 할 수 있었다. 물질이 조밀되는 GVS의 제조 방법의 확립 인공 세포를 생성하기위한 중요한 공정이다. 내부 재료의 다양한 유형에 대한 우리의 프로토콜의 유틸리티를 확인하려면, 우리는 또한 GFP와 작은 수용성 형광 분자 (uranine)가 GVS에 캡슐화 될 수 있음을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Vesicular membrane molecule</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1M 트리스-HCl (pH 7.5)</td><td>일본 유전자 (</td>주)<td>318-90225</td><td>완충 용액</td></tr><tr><td>D(+)-포도</td>당 <td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>외부 수용액용</td></tr><tr><td>자당</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>내부 수용액</td></tr><tr><td>Polybead 카르복실레이트 마이크로스피어 1.0 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>비형광, 2R = 1.0 &마이크로; m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 카르복실레이트 마이크로스피어 1.0 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>형광등, 2R = 1.0 &마이크로; m</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 카르복실레이트 마이크로스피어 0.10 &마이크로; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>형광등, 2R = 0.10 &마이크로; m</td></tr><tr><td>플루오레세인 나트륨 염 (우라닌)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP 표준 (재조합)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>원심분리기 로터: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>핸디 마이크로 균질화 기</td></tr><tr><td>발전기 샤프트</td><td>Microtec (주)</td><td>NS-4</td><td>균질화 장치 부착</td></tr><tr><td>in situ PCR 및 혼성화를위한 프레임 씰 인큐베이션 챔버</td><td>Bio-Rad Laboratories SLF0201</td><td></td><td>혼성화 챔버 부피 : 25 &micro; L 챔버 크기 : 9 &times; 9 &번; </td></tr><tr><td>in situ PCR 및 혼성화를 위한 0.3mm Frame-Seal 인큐베이션 챔버</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>혼성화 챔버 용량: 65 &마이크로; 엘&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 챔버 크기: 15 &times; 15 &번; 0.3mm</td></tr><tr><td>Microman E</td><td>Gilson FD10006</td><td></td><td>점성 액체용 피펫. 우리는 이것을 사용하여 액체 파라핀을 측정했습니다.</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>미러 유닛</td><td>올림푸스</td><td>U-FBNA</td><td>여기 필터: 470 - 495 nm 방출 필터: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>미러 유닛</td><td>올림푸스</td><td>U-FMCHE</td><td>여기 필터: 565 - 585 nm 방출 필터: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

건설적인 생물학 및 인공 생명을 만드는 합성 생물학 접근 방식은 생물학적 또는 비 생물학적 물질의 상향식 (bottom-up) 어셈블리를 포함한다. 이러한 접근 방식은 생활과 무생물 문제 사이의 경계에 대한 연구에 상당한 관심을받은 지난 20 년 동안 인공 세포를 구성하는 데 사용되었다. 특히, 거대 소포 (GVS)는 종종 인공 세포막로서 사용되어왔다. 본 논문에서는 고도로 응축 된 생체 분자를 포함하는 셀의 모델로 높은 포장 마이크로 캡슐화 GVS의 준비에 대해 설명합니다. GVS 간단한 유 중수 에멀젼을 원심 분리 방법에 의해 제조 하였다. 즉, 균질의 물질이 캡슐화 함유하는 수용액에 용해 인지질을 함유하는 오일을 유화하는 데 사용하고, 생성 된 에멀젼을 다른 수용액의 표면 상에 조심스럽게 적층했다. 계층화 된 시스템은 t을 원심 분리O를 GVS를 생성합니다. 이 강력한 방법은 작은 분자 미립자에 이르는 물질을 캡슐화하기 위해 사용되었다.

원 / O 에멀젼을 원심 분리 방법은 사진으로도 1에 개략적으로 도시되어있다. 도 1의 개략적 인 화상이 방법의 성공의 가장 중요한 결정 인자가 GVS 원심 동안 침전되도록 내측 수용액의 비중 외측 수용액보다 커야한다는 것을 의미한다. 또한, w / O 인터페이스에서 지질 단일 층의 형성은 에멀젼 외측 수용액에 적층 된 후 시스템이 10 분 동안 냉각 될 것을 요구한다. 승 / O 인터페이스를 통해 에멀젼 방울의 이동에 의해 GVS 양식 때문에, 내부 및 외부 수성 층의 삼투 압력은 동일해야합니다. 컨트롤 실험으로서, 프로세스에 의해 더 미세 함유하지 않는 우리 GVS 또한 제조도 1에 도시 된 내측 수용액 것을 제외하고는 단계 1.3마이크로없이 준비했다. 원심 분리 후 침전 된 GVS의 컬렉션 그림 2에 표시됩니다. 마이크로 튜브의 바로 아래쪽의 반투명 위상뿐만 아니라, 또한 외주 수용액 (도 2a)에 백색 혼탁 중간 위상을 관찰 하였다. 아래 단계는 GVS를 포함하는 반면이 중간 단계는, 미소와 석유의 집계 풍부했다. 따라서, 고정 핀 (도 2b)으로 모세관의 바닥을 관통 한 결과 GVS 대량 함유 처음 드롭 (도 2C)을 수집 하였다. 더 이상 두 방울 수집하지 않습니다 있는지 확인하는 것이 중요하다; 추가 하락은 GVS의 낮은 밀도가 발생합니다 미소와 지질의 집계를 포함 할 수있다. 얻어진 소포 분산은 종종 GVS 외부 캡슐화 물질을 포함 ofte GVS 때문에원심 분리 동안 n 개의 파열. 단 GVS 얻으려면 투석, 겔 여과 또는 형광 - 활성화 세포 분류와 같은 방법은 캡슐화 물질의 크기로 인해, 정렬이 선택되어야한다. 석출 GVS 사용되어야하는 목적을 위해 필요한 경우, 이들은 외측 수성 용액으로 희석 될 수있다. 어떤 경우에는, 중간상을 형성하는 소포가 오일에 의해 함께 결합 된 것을 시사 튜브의 하부로 연장. 우리는 마이크로없이 GVS의 미분 간섭 현미경과 형광 현미경 이미지를 획득 (그림 3A, 3B) 및 마이크로와 (그림 3C -3 F). 이전 보고서 (23), (37)과 일치, 낮은 lamellarity와 GVS는 우리의 프로토콜에 의해 형성되었다. 빨간 fluores을 방출 텍사스 레드 DHPE와 결합 지질그 소포 형성 직접 박막의 시각화에 의해 확인 될 수 있도록 cence가 사용되었다. 우리 얻어진 160 GVS 중 55 미세 캡슐화, 105 34 %의 캡슐화의 비율을 제공 비어 있었다. 우리는 다음의 방법에 의하여 미소 GVS에서의 체적 분율 (φ, 부피 %)을 결정 하였다. 각 GV가 수백 마이크로 스피어에 수십 포함되어 있기 때문에 광학 현미경으로 모든 미소를 계산하는 것은 도전이다. 따라서, 수동 형광 현미경으로 계수 하였다 형광 미소 소량과 비 형광 1.0 ㎛의 미립자를 혼합 하였다. 미세 캡슐의 총 수 (N)는 (20)가 수동으로 계산 형광 미립자의 개수 (N)를 곱하여 계산 하였다 (: 비 형광 형광 미소 행의 5의 V / V] 비 일본어 95 기준). 의 값(66); 다음 V는 미소 구체의 부피이고, V는 각각 GV의 볼륨 수 NV 100 / V로 추정되었다. n은 N의 추정 계산 오류가 발생한다 참고 및 φ를 계산할 때이 오류가 고려되어야한다. φ의 값은 20 N으로 직접 계산 N, 추정, 차례로 이는 φ 확률 초래했다 정확하게 진정한 가치는 50 % &lt;입니다 나타냅니다. 사실, N 20 N의 주위에 어느 정도 변동, 그래서 우리는 내가 N의 오류이고, (N I를 ±) 20로 고려해야합니다. 우리는 N의 확률 난 포아송 분포에 기초하여 얻어진 50 % 이상이 될 수 있음을 위해 ± I 추정. 우리는 다시 우리가 20를 계산 (N I를 ±)과의 값을 할 수있는, 내가 예상(66); 즉, 10 및 15 μm의 (표 1)의 직경 GVS에 대한 오류를 계산에 포함. 이 절차에 따라,도 3c에 도시 GV의 미립자의 체적 분율은 11 ± 3 부피 %로 추정되었다. 계산 된 체적 분율의 정밀도 10-30 %였다. 우리의 결과는 우리가 성공적으로 높은 부피 분율에 GVS 1 μm의 마이크로 캡슐을 나타냅니다. 우리는 같은 외부 수용액과 같은 프로토콜 (도 4)를 이용하여도 100 몰 % DOPC GVS에 다른 물질을 캡슐화 할 수 있었다. 즉, 0.1 ㎛의 미립자를 함유 GVS 0.1 M 트리스 -HCl 1.0 ㎛의 미립자를 함유 GVS 대해 기재된 프로토콜을 통해 (PH 7.5), 0.15 M 수 크로스, 0.5 부피 % 형광 마이크로 스피어 (함유하는 트리스 완충 용액으로부터 제조 된 그림 4a). 프로토콜 설명 abov에 따라즉, GFP (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M 슈 크로스, 100 μg의 / ㎖의 GFP;도 4b)를 포함 DOPC GVS 및 uranine 함유 GVS (0.1 M 트리스 -HCl [pH가 7.5, 0.15 M 슈 크로스, 30 μM uranine;도 4c)도 준비 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 엔 </td><td> 엔 </td><td> φ (10 μm의 직경) </td><td> φ (15 μm의 직경) </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6.0 ± 2.0 </td><td> 1.8 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8.0 ± 2.0 </td><td> 2.4 ± 0.6 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3.0 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3.6 ± 1.2 </td></tr><tr><td> (10) </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0.9 </td></tr><tr><td> (20) </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> (30) </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> 본문에 설명 된 바와 같이 에러는 측정 하였다; n은 수동으로 계산 미소의 수; 캡슐화 된 마이크로 스피어의 N은 = 총 수입니다. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 마이크로 스피어 (A)의 번호 및 볼륨 분획 (φ, 부피 %). 본문에 설명 된 바와 같이 에러는 측정 하였다; n은 수동으로 계산 미소의 수; 캡슐화 된 마이크로 스피어의 N은 = 총 수입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> 그림 1 : 흐름 장<html> 예술과 / W O 에멀젼 원심 분리 방법의 개략도. (가) DOPC 텍사스 레드 DHPE로 구성된 오일 솔루션 : 액체 파라핀에 (100 0.3 몰비). (b) 트리스 - 염산 완충액 크로스 및 미립자로 구성된 내부 수성 분산액. (c) 트리스 - 염산 완충액에서 글루코스로 이루어진 외측 수성 용액. (d) 석유 액 1ml 및 내측 수성 분산액을 300 μL의 혼합물. 균질화 (10,000 rpm으로 2 분)와 (E) 유화. (f) 상기 w / O 에멀젼. 외측 수용액 1 ㎖에 에멀젼의 300 μL의 (g) 레이어링. (시간) 석출 GVS 직후 원심 분리. (ⅰ) W / O 에멀젼을 원심 분리 방법의 원리의 개략도. 검은 색 화살표는 원심 가속도의 방향을 나타냅니다..JPG &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> 그림 2 : 마이크로 튜브의 피어싱. (a)에 석출 GVS 단지 (또한도 1 시간에 도시) 원심 분리 후. 붉은 타원 석출 GV 분산액의 액 적을 나타낸다. 압정으로 마이크로 튜브의 (b)에 피어싱. GVS 함유 펠렛 압정으로 아래쪽에 마이크로 튜브를 관통하여 구멍으로부터 액적들을 수집하여 수득 하였다. 외측 수용액으로 희석 한 분산 체 (노란 화살표) 침전 GVS의 (c) 방울. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3 : GVS의 현미경 사진. 미소없이 GV의 (a) 차동 간섭 콘트라스트 현미경 이미지. GV의 직경은 약 10 ㎛,. 스케일 바는 10 μm의 =. 미소없이 GV의 (b) 형광 현미경 이미지. 빨간색 형광 텍사스 레드 DHPE에 의해 방출되었다. 미립자를 함유하는 GV의 (c) 차등 간섭 콘트라스트 현미경 이미지. GV 내부 1.0 μm의 미소 (YG 카르복시산 미립자)의 (d) 형광 현미경 이미지. 카운트 형광 마이크로 스피어 (N)의 수는 우리는 포아송 분포에 기초하여 상기 오차 (I = 2) 약 6이었다. 그 다음 우리는 ((N I를 ±) N = 20) 내부 미소의 총 수를 추정 120 ± 40이었다. 이것은 것으로 계산되었다GV는 V는 미소 구체의 부피이고, V는 GVS 부피 약 11 ± 3 부피 %의 체적 분율 (φ = 수 NV 100 / V)에서 1.0 ㎛의 미립자를 함유 하였다. GV 막 (E) 형광 현미경 이미지. 빨간색 형광 텍사스 레드 DHPE에 의해 방출되었다. (바) 패널 D와 E의 이미지의 이미지를 병합. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> 그림 4 : 다른 캡슐화 된 재료와 GVS의 미분 간섭 대비 및 형광 현미경 이미지. 미분 간섭 대비 현미경 (위)과 형광 현미경 (아래)의 이미지(a) 0.1 ㎛의 미립자, (B) GFP, 및 (c)를 함유 uranine GVS. 스케일 바는 10 μm의 =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

이 수중유(water-in-oil) 에멀젼 원심분리법의 전반적인 목적은 박층 거대 소포(thin layer giant vesicle)를 용이하게 제조하는 것입니다. 이 방법은 거대 소포 기반의 인공 세포 생성과 같은 합성 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 클로로포름에 DOPC 25 millimolar 스톡 용액과 Texas Red DHPE 0.2 millimolar 스톡 용액을 준비하십시오.다음으로, 흐르는 질소 가스 하에서 DOPC와 Texas Red DHPE 표준 용액 혼합물을 증발시켜 5 mL 유리 바이알의 내부 표면에 지질 박막을 형성합니다. 감압 상태에서 밤새 박막을 배양한 후, 바이알에 액체 파라핀 1 mL를 첨가합니다. 바이알을 알루미늄 호일로 감싸고 혼합물을 80 °C에서 밤새 배양합니다.1.5 mL 뚜껑付き 마이크로튜브에 1 µm 비형광 마이크로비드 237.5 µL와 1 µm 형광 마이크로비드 12.5 µL를 혼합합니다. 여기에 sucrose 64 mg을 넣고, 이어서 1 M Tris 완충 용액 125 µL와 탈이온수 875 µL를 마이크로튜브에 첨가합니다. 혼합물을 30초 동안 볼텍싱한 후, 10분 동안 초음파 처리합니다.10 mL의 Tris 완충 용액을 준비한 후, 1.5 mL 뚜껑付き 마이크로튜브에 1 mL를 넣습니다. 용액을 볼텍싱 및 초음파 처리한 후, 1.5 mL 마이크로튜브에서 오일 용액 1 mL와 내부 수성 용액 300 µL를 혼합합니다. 상온에서 10,000 rpm으로 2분 동안 기계식 균질기를 사용하여 마이크로튜브 내의 두 성분을 유화시킵니다.다음으로, 4 °C에서 1.5 mL 뚜껑付き 마이크로튜브에 담긴 1 mL의 외부 수용액 상층부에 300 µL의 수중유 에멀젼을 조심스럽게 층층이 쌓습니다. 마이크로튜브를 10분 동안 냉각시킨 직후, 혼합물을 18,000 ×g에서 30분 동안 원심분리합니다. 완료 후, 푸시핀으로 마이크로튜브 바닥을 뚫어 한 방울을 멸균된 1.5 mL 마이크로튜브에 수집함으로써 침전된 거대 소포(giant vesicles, GV)를 얻습니다.현미경 커버 글라스 위에 NC two 중합효소 연쇄 반응 및 하이브리드화를 위한 접착식 배양 챔버를 배치합니다. 마이크로피펫을 사용하여 희석된 침전 GVs 25 µL를 시료 영역에 분주하고, 즉시 0.15 mm 두께의 커버 글라스를 배양 챔버 위에 덮습니다. 소포의 현미경 이미지를 기록한 후, 먼저 UFBNA 및 UFMCHE 형광 미러 유닛을 현미경에 삽입하여 형광 현미경 관찰을 수행합니다.그 다음, 분석을 위해 여기 필터와 방출 필터를 장착합니다. 워터-인-오일(water-in-oil)법의 성공을 결정짓는 가장 중요한 요인은 내부 수용액의 비중이 외부 수용액의 비중보다 커야 하며, 그래야만 원심분리 과정 중에 GV가 침전된다는 점입니다. 마이크로스피어가 포함되지 않은 GV와 포함된 GV에 대한 미분 간섭 현미경 및 형광 현미경 관찰을 통해 층수가 적은 GV가 형성되었음을 확인했습니다.얻어진 160개의 GV 중 55개는 마이크로스피어를 캡슐화하였고 105개는 비어 있어, 캡슐화 비율은 34%였습니다. GV 내 마이크로스피어의 부피 분율은 약 11 ± 3 volume percent로 추정되었으며, 계산된 부피 분율의 정밀도는 10~30%였습니다. 동일한 외부 수용액과 프로토콜을 사용하여 100 mole percent DOPC GV에 다른 물질을 캡슐화하는 과정이 미분 간섭 현미경 및 형광 현미경 관찰을 통해 성공적임이 확인되었습니다. 이 절차 이후에는 모델링된 세포의 규명과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 유세포 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 캡슐화된 물질을 포함한 거대 소포(giant vesicles)를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

세포 및 입자의 관성 주문과 monodisperse 드롭 생성을 결합하여, 우리는 kHz에서 속도에서 한 방울의 세포 또는 입자의 원하는 숫자를 캡슐하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 번 단일 및 이중 입자 술을 정렬되지 않은 캡슐 분들을 초과 효율성을 보여줍니다.

높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질...

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

여기 postfusion bilayer에이 막 단백질의 세제 무료 배달 대상 지질 bilayers와 fusogenic proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 및 같은 proteoliposomes의 융합에 대 한 두 개의 초고속 프로토콜 선물이. 이러한 방법의 복잡 한 다중 구성 요소 막 시스템의 신속 하 고 쉽게 제어 조립이 있습니다.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

본 연구는 나노리포솜 제제에 대한 얇은 지질 막 방법을 이용한 고전적인 수분 공급에 대해 설명하고 나노입자 특성화에 이어. 47 kDa-친수성 및 구형 단백질인 타린(tarin)은 안정성을 개선하고, 빠른 클리어런스를 피하며, 통제된 방출을 촉진하는 전략으로 성공적으로 캡슐화되었습니다. 이 방법은 소수성 분자 캡슐화에 적응될 수 있다.

생리 활성 친수성 구형 단백질의 함정에 대한 나노 리포좀의 준비 및 특성화

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

이 초보자 가이드는 액적 전달 방법을 통해 GIV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시하고, 중요한 단계를 논의하고, 합성 생물학 및 마이크로로보틱스를 포함한 다양한 응용 분야에 필요한 가능한 조정에 도움이 되는 통찰력을 제공합니다.

액적 전달 방법을 사용하여 거대한 단층 소포를 안정적으로 준비

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

학습하세요 유중수 에멀젼 원심분리법을 이용한 거대 소포체 제조 방법을 합성생물학 및 인공세포 연구에 활용하는 기술입니다. DOPC와 Texas Red DHPE를 사용하여 미세구체를 캡슐화하는 실험 절차를 익히세요.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

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