유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

이 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법의 전반적인 목표는 얇은 층의 거대 소포를 쉽게 준비하는 것입니다. 이 방법은 거대한 소포를 기반으로 한 인공 세포의 생성과 같은 합성 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 DOPC의 25밀리몰 스톡 용액과 클로로포름의 Texas Red DHPE의 영점 2밀리몰 스톡 용액을 준비합니다.

다음으로, 유동 질소 가스 아래에서 DOPC와 Texas Red DHPE 원액의 혼합물을 증발시켜 5ml 유리 바이알의 내부 표면에 지질 필름을 형성합니다. 밤새 감압된 상태에서 필름을 배양한 후 바이알에 1ml의 액체 파라핀을 추가합니다. 바이알을 알루미늄 호일로 싸서 섭씨 80도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1 포인트 5 밀리리터 뚜껑 마이크로 튜브에서 237 포인트 5 마이크로 리터의 1 마이크로 미터 비형광 마이크로 스피어와 12 포인트 5 마이크로 리터의 1 마이크로 미터 형광 마이크로 스피어를 혼합합니다. 이제 64mg의 자당과 125마이크로리터의 1몰 트리스 완충 용액과 875마이크로리터의 탈이온수를 마이크로튜브에 추가합니다. 혼합물을 30초 동안 소용돌이친 다음 10분 동안 초음파 처리합니다.

10ml의 Tris 완충 용액을 준비한 후 1포인트 5ml 뚜껑이 있는 마이크로튜브에 1ml를 넣습니다. 용액이 와류화되고 초음파 처리되면 1 점 5 밀리리터 마이크로 튜브에 1 ml의 오일 용액과 300 마이크로 리터의 내부 수용액을 혼합합니다. 10, 실내 온도에 2 분 동안 000 분당 회전수에서 운영한 기계적인 homoginizer를 사용하여 microtube에 있는 2개 분대를 유화하십시오.

다음으로, 300 마이크로 리터의 유중수 에멀젼을 섭씨 4 도에서 1 밀리리터의 외부 수용액의 상부 표면에 1 점 5 밀리리터 뚜껑이 달린 마이크로 튜브에 부드럽게 층을 이룹니다. microtube를 10 분 동안 식힌 직후, 18, 000 시간 G에 30 분 동안 혼합물을 원심 분리하십시오. 완료되면 푸시 핀으로 마이크로튜브의 바닥을 뚫고 멸균된 1포인트 5밀리리터 마이크로튜브에 한 방울을 모아 침전된 거대 소포 또는 GV를 얻습니다.

NC 2 중합효소 연쇄 반응 및 혼성화를 위한 접착 배양 챔버를 현미경 커버 유리 위에 놓습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 희석 된 침전 된 GV 25 마이크로 리터를 표본 영역에 증착하고 즉시 배양 챔버 위에 5mm 두께의 영점 커버 유리를 놓습니다. 소포의 현미경 이미지를 기록한 후 먼저 UFBNA 및 UFMCHE 형광 미러 장치를 현미경에 삽입하여 형광 현미경 검사를 수행합니다.

그런 다음 해석을 위해 여기 필터와 방출 필터가 있는 단위를 맞춥니다. 유중수(water-in-oil) 방법의 성공을 결정하는 가장 중요한 요인은 내부 수용액의 비중이 외부 수용액의 비중보다 커야 원심분리 중에 GV가 침전된다는 것입니다. 미세구가 없는 GV와 미세구가 있는 GV의 미분 간섭 현미경 및 형광 현미경 검사는 낮은 층상성을 가진 GV가 형성되었음을 확인했습니다.

얻어진 160개의 GV 중 55개의 캡슐화된 마이크로스피어와 105개의 마이크로스피어가 비어 있어 캡슐화의 34% 비율을 제공했습니다. GV에서 마이크로스피어의 부피 분율은 약 11 플러스 또는 마이너스 3 부피 퍼센트로 추정되었고, 계산된 부피 분율의 정밀도는 10 내지 30%였으며, 동일한 외부 수용액 및 동일한 프로토콜을 사용하여 다른 물질을 100 몰 퍼센트 DOPC GV로 캡슐화하는 것은 미분 간섭 현미경 및 형광 현미경 검사에 의해 나타난 바와 같이 성공적이었습니다. 이 절차에 따라 모델링된 세포의 설명과 같은 추가 질문에 답하기 위해 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 캡슐화된 재료로 거대한 소포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.