Name: 단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 광분해성 링커와 UV 용출을 이용한 단일 단계 RNA/단백질 복합체 정화 방법. 이 기술은 세포 내 소량 존재하는 복합체를 기능성을 유지하며 질량 분석이 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리가 우리의 일을 우리의 동료와 공동 작업자 들 감사합니다. 이 연구는 NIH에 의해 지원 되었다 GM 29832 부여.

1. 기판 준비
참고: ~ 65 뉴클레오티드 보다 짧은 RNA 기판 biotin (B)와 사진 쪼갤 (pc) 링커 (통칭 사진 쪼갤 biotin 또는 pcB) covalently RNA 5' 끝 (cis 구성)에 연결 된 화학적으로 합성 될 수 있다. 상당히 긴 바인딩 사이트를 포함 하는 RNA 기판 생성 된 생체 외에서 T7 (SP6) 전사에 의해 있어야 하 고 이후 5' 끝 (트랜스 에 pcB moiety를 포함 하는 짧은 보완 어댑터 oligonucleotide를 단련 구성) (그림 1).
<ol><li>미만 ~ 65 뉴클레오티드로 구성 된 바인딩 사이트 사용 상업 제조 업체 (자료 테이블) 화학적 관심의 RNA 합성 pcB와 covalently RNA 5' 끝 (그림 1A 및 그림 2A)에 첨부. 원하는 농도 달성 하 여-80 ° c.에 작은 aliquots에 저장 살 균 물에 용 해</li>
	<li>바인딩 사이트 크게 이상 ~ 65 뉴클레오티드, 형태는 생체 외에서 의 부분적인 이중 생성 관심과 5' 끝 (그림 3A)에 pcB moiety를 포함 하는 상호 보완적인 어댑터 oligonucleotide의 RNA.<ol>
<li>선형화 플라스 미드 DNA 또는 적절 한 PCR 템플릿을 관심 ~ 20-뉴클레오티드 임의의 순서에 의해 3' 끝 확장의 바인딩 사이트와 RNA 생성에 T7 전사를 수행 합니다.</li>
		<li>상업적인 제조 업체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 3' 확장 T7 생성 RNA에 무료 이며 5' 끝 (그림 3A)에 pcB를 포함 한 어댑터 oligonucleotide를 화학적으로 합성. 참고: 두 명의 18-원자 스페이서와 2-3 비 보완 뉴클레오티드는 바인딩된 복잡 하 고 streptavidin 구슬 사이 잠재적인 입체 방해를 줄이기 위해 oligonucleotide의 5' 끝에 배치할 수 있습니다. 그것은 또한 바람직한는 oligonucleotide 2' O-메 틸 그룹 이중의 강도 강화 하 고 다양 한 nucleases에 대 한 저항을 제공 하기 위해 수정 균일 하 게 됩니다.</li>
		<li>PcB 어댑터 oligonucleotide T7 생성 RNA anneal<ol>
<li>RNA의 믹스 20 pmol 및 어댑터 pcB oligonucleotide (1:5 어 금 니 비율) 1.5 ml에서의 100 pmol 튜브 바인딩 버퍼 다음 구성의 포함 100 µ L: 75 m m KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% 글리세롤 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA). 참고: 그것은 어 닐 링 반응에 사용 되는 (만약에 모두 아닙니다) 대부분 사전 mRNA 기판와 쌍 신 회로 형성 하기에 충분 한 어댑터 oligonucleotide의 최소 금액을 사용 하는 것이 중요. 이 편리 하 게 다양 한 버퍼 조건 및 모니터링의 보존 32P, 어 닐 링 사용 하 여 어댑터 oligonucleotide 양의 증가 함께 레이블이 기판 5' 끝에 RNA 기판 라벨에 의해 결정 될 수는 바인딩 버퍼와 구슬의 여러 세척 후 streptavidin 구슬에 방사성 신호.</li>
			<li>끓는 5 분 동안 물에 튜브를 놓습니다.</li>
			<li>실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 물을 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 복잡 한 어셈블리
<ol><li>추출 물에 존재 하는 일반적인 금속 종속 nucleases 차단 10 mM의 최종 농도에 80 mM EDTA ph 8 마우스 핵 추출 물 (또는 선택의 다른 추출) 1 mL를 보충. 참고:이 귀 착될 것 이다 바인딩 버퍼에서 것과 같은 구성에 추출에서 버퍼를 조정 (단계 1.2.3.1 참조). EDTA는 생체 외에서 히스톤 사전-mRNAs의 처리에는 영향을 미치지 않습니다 하지만 단백질 또는 단백질 복합물 마그네슘 종속 방식으로 조립 하는 정화에 해로울 수 있습니다. 이러한 경우에 EDTA는 피해 야 한다.</li>
	<li>Cis 에서 pcB moiety 태그로 RNA 기판의 5-10 pmol 추가 (단계 1.1 참조) 또는 트랜스 (단계 1.2.3.3 참조) 10 mM EDTA를 포함 하는 추출 물의 1 ml. 참고: RNA의 양을 신중 하 게 일련의 시험 실험에서 평가 될 필요가 있다. 어쩌면 비 생산적, 크게 증가 하는 일반적인 RNA 의무적인 단백질의 배경을 특정 단백질의 수익률에 영향 없이 복잡 한 제한의 정화에 대 한 너무 많은 RNA 기질을 사용 하 여.</li>
	<li>가끔 샘플 혼합 얼음에 5 분 동안 추출 된 RNA 기판 품 어. 참고: 두 시간 및 온도 외피의 경험적으로 설립 될 필요가 RNA 또는 단백질 복합물의 특정 특성에 따라 크게 다를 수 있습니다.</li>
	<li>어떤 잠재적인 침전 제거 하 고 신중 하 게 표면에 뜨는 피하 펠 릿 전송 수집 하 10000 x g에서 10 분에 대 한 사전 냉각된 microcentrifuge에 인큐베이션 혼합물을 회전 합니다.</li>
</ol>3. Streptavidin 구슬에 RNA 또는 단백질 복합물의 동원 정지.
<ol><li>1.5 mL 튜브에 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 ~ 100 µ L streptavidin agarose 구슬에 서 스 펜 션의 전송 및 바인딩 버퍼 (75 m m KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% 글리세롤, 10 mM EDTA) 볼륨을 증가. 참고:이 버퍼는 어 닐 링 혼합물 및 복잡 한 어셈블리 (단계 2.1) 사용 하는 추출 것과 동일한 구성을 해야 합니다.</li>
	<li>25 x g 2-3 분 동안 회전 하 여 튜브의 하단에 비즈를 수집 하 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>2-3 번 같은 세척/회전 절차를 반복 바인딩 버퍼와 구슬 equilibrate에. 참고:이 단계의 끝에, 구슬의 펠 릿 있어야의 볼륨 ~ 30 µ L.</li>
	<li>조립된 복잡 (단계 2.4)를 포함 하는 상쾌한 equilibrated streptavidin agarose 구슬에 로드 합니다.</li>
	<li>RNA와 구슬에 바인딩된 단지 무력화 하 4 ° C에서 1 시간 회전할.</li>
	<li>25 x g 2-3 분 동안 회전 하 여 튜브의 하단에 비즈를 수집 합니다. 참고:로 터 밖으로 스윙을 사용 하 여 손실을 방지 하기 위해 상당한 구슬의 경우 그들은 터의 각도에서 튜브의 측면을 준수 하는 경향이.</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 구슬 같은 원심 분리 조건을 사용 하 여 바인딩 버퍼의 1 mL로 두 번 씻어.</li>
	<li>바인딩 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 샘플 4 ° c.에 1 시간 회전 참고:이 단계는 기판에 형성 하는 복잡 한 해리 경향이 경우 단축 될 수 있습니다.</li>
	<li>25 x g 2-3 분 위한 구슬 아래로 회전 시키십시오, 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 새 튜브를 정지를 전송.</li>
	<li>추가 1 시간 또는 더 짧은, 복잡 한 경우, 스핀 다운 25 x g 2-3 분 위해를 바인딩 버퍼의 200 µ L에 500 µ L 튜브에 비즈를 전송.</li>
</ol>4입니다. UV-차입입니다.
<ol><li>고 강도 완전 광채를 도달 하기 전에 5-10 분에 대 한 365 nm 자외선을 방출 하는 자외선 램프를 켭니다. 참고: 이것은 방사선의 시작에서 UV 방출의 최대 에너지를 달성 하 게 근본적 이다.</li>
	<li>단단히 포장 얼음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m)의 하단을를 접시의 뚜껑 위에 스택 수 있습니다.</li>
	<li>짧게 소용돌이 고정된 복잡 한, 포함 된 튜브 자리 가로에 얼음과 커버 샘플 전구의 표면의 2-3 cm의 거리에서 되도록 미리 예 열된 램프와. 참고: 거리 너무 큰 경우 사용 하 여 추가 접시 또는 다른 적합 한 개체 전구에 가까운 샘플을가지고.</li>
	<li>30 분, 자주 반전 및 vortexing의 총 비추는 튜브 UV 정지의 균일 한 노출을 보장 하 고 과열을 방지 하기 위해. 참고: 추가 냉각을 제공 하기 위해 UV 차입 단계 수행할 수 있습니다 밖으로 추운 방에. 과도 한 얼음 녹는 경우 신선한 얼음 페 트리 접시로 전환.</li>
	<li>25 x g 2-3 분 위한 구슬 아래로 회전 시키십시오 고는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>다시 동일한 조건을 사용 하 여 상쾌한 회전 하 고는 상쾌한을 수집 합니다. 참고: 잔여 비즈를 전송 하지 않으려면 아래에서 상쾌한의 작은 금액을 남겨 주세요.</li>
</ol>5. 샘플 분석은 얼룩이 다음 질량 분석.
<ol><li>사용 SDS/polyacrylamide 젤 전기 이동 법 UV eluted 상쾌한의 분수와 UV 차입 다음 구슬에 남은 재료의 동일한 부분을. 참고: 분석 UV 차입 하기 전에 샘플에서 철회 구슬의 약 수를 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>상용은 얼룩 키트를 사용 하 여 분리 된 단백질을 포함 하는 젤을 얼룩.</li>
	<li>단백질에 존재 하는 UV eluted 상쾌한 고 UV 조사에 따라 구슬에 그의 농도 비교 하 여 UV 차입의 효율성을 평가 합니다.</li>
	<li>관심의 단백질 밴드를 삭제할 고 표준 프로토콜10,15를 사용 하 여 질량 분석에 의해 그들의 정체성을 결정 합니다.</li>
</ol>6. 글로벌 질량 분석에 의해 UV eluted 샘플의 분석.
<ol><li>직접 질량 분석 편견으로 순화 된 물자의 전체 프로테옴을 결정 하 여 UV eluted 상쾌한의 일부분을 분석 합니다. 참고:이 해질 수 있다 순화 된 샘플의 솔루션에서 처리 하 여 표준 질량 분석 프로토콜 생성 펩 티 드10,15의 id를 확인을 다음 트립 신으로.</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
<li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases%3A+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li>
<li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+3%27+end+of+histone+mRNA%3A+getting+closer+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li>
<li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+%27-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li>
<li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+%27-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila%3A+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li>
<li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li>
<li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2%27-+O-methyl+oligoribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li>
<li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs%3A+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component%2C+Lsm11%2C+in+histone+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li>
<li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10%2C+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li>
<li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+%27-End+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li>
<li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide%3A+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5%27-end-labeling%2C+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li>
<li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li>
<li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li>
<li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3+%27+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+%27+end+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li>
<li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3%27hExo%2C+a+3%27+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3%27+end+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li>
<li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+histone+mRNA+stem-loop%2C+human+stem-loop+binding+protein%2C+and+3%27hExo+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li>
<li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li>
<li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs%3A+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li>
<li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+%27+end+processing+of+histone+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Rna-a+Publication+of+the+Rna+Society%22%5BJournal%5D)">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li>
<li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li>
<li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eri1%3A+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li>
<li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3%27+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li>
</ol>

저자 공개할 게 없다

여기 설명 하는 방법을 간단 하 고 통합 사진 쪼갤 링커 외 이며 UV 차입 단계 biotin와 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용을 활용 하는 일반적으로 사용 되는 방법에서 다 하지 않습니다. UV 차입 단계 일반적으로 고정된 하는 RNA의 75% 이상 방출 매우 효율적 이며 streptavidin 구슬, 구슬에 비 특히 묶는 단백질의 높은 배경 뒤에 떠나는에서 단백질 관련. 제거 함으로써이 배경, UV 차입 단계 실버 얼룩, 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 너무나 순수한 샘플 직접 분석에 적합을 생성 합니다.
상대적으로 몇 가지 간단한 단계를 포함, 결과로 UV 차입 방법은 매우 재현성, 마우스의 작은 100 µ L에서 실버 얼룩 U7 snRNP의 충분 한 양을 제공 하 고 초파리 핵 추출15. 방법은 다른 실험 전략 이전 RNA/단백질 복합물, RNA 기판 MS2 바인딩 사이트 태그 등 immob...

진핵생물, RNA 중 합 효소 II 생성 mRNA 선구자 (pre-mRNAs) 세포질에서 단백질 합성에 대 한 완전 한 기능 mRNA 템플릿이 되기 전에 핵에서 여러 성숙 이벤트를 받 다. 이러한 이벤트 중 하나는 3' 끝 처리입니다. 사전 mRNAs의 대부분, 3' 끝 처리 polyadenylation 결합 절단을 포함 한다. 상대적으로 풍부한 복잡 하 여이 2 단계 반응 촉매는 15 개 이상의 단백질1의 구성 된. 동물 복제 종속 히스톤 사전 mRNAs 3' 끝에 핵심 역할 U7 snRNP, ~ 60 뉴클레오티드 및 여러 단백질2,3 의 U7 snRNA 구성 된 복잡 한 낮은 풍부에 의해 재생 됩니다. 다른 메커니즘에 의해 처리 됩니다. . 히스톤 사전-mRNA와 U7 snRNP의 소 단위 중에 특정 순서로 U7 snRNA 기본적인 쌍 catalyzes 분열 반응, 성숙한 히스톤 생성 mRNA는 많은 없이 꼬리. 히스톤 사전-mRNA의 3' 끝 처리도 필요 줄기 루프 바인딩 단백질 (SLBP), 보존된 줄기 루프 위치를 바인딩하는 분열 사이트의 업스트림 기판2,3U7 snRNP의 채용을 향상 시킵니다. U7 snRNP의 개별 구성 요소를 식별 하기 위한 연구에 동물 세포에서 U7 snRNP의 낮은 농도와 해리 또는 부분 베이스를 사용 하 여 결과로 정화 동안 받아야 복잡 한 경향이 도전 되었습니다. 온화한 세제4,,56, 높은 소금 세척 및/또는 여러 컬럼에 단계7,,89.
최근, U7 종속 처리 기계의 구성 결정, 3' 또는 5'에서 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 조각 핵 추출으로 incubated 했다 및 조립된 단지 streptavidin 입히는에 체포 되었다 agarose 구슬5,,610. Biotin과 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용으로 인해 단백질 streptavidin 구슬에 움직일 SDS에 끓는 조건을 변성 시키기에서 eluted 되었고 실버 얼룩 및 질량 분석에 의해 분석. 이 간단한 접근 U7 snRNP의 구성 요소 번호를 식별 하는 동안 그것은 상대적으로 원유 샘플, 종종 nonspecifically streptavidin 구슬, 잠재적으로 마스크의 일부 구성 요소에 바인딩된 배경 단백질의 많은 오염 나왔고 처리 기계 및 실버에 그들의 탐지를 방지 젤5,,610스테인드. 중요 한 것은,이 방법은 또한 추가 방법으로 격리 된 물자와 동질성을 더 정화의 어떤 기능 연구를 배제.
수정 수 중 상호 작용을 약하게 하거나에 화학적으로 쪼갤 스페이서 팔 제공 하 여 설계 되 고 그들의 대부분과 함께 비타민 b 복합체/streptavidin 상호 작용의 거의 돌이킬 수 없는 자연을 해결 하기 위해 시간이 지남에 제안 합니다 biotin 포함 시 약11,12. 이러한 모든 수정의 단점은 그들은 크게 무결성 또는 순화 된 단백질의 활동을 위태롭게 차입 단계 방법을 자주 필요한 비 생리 적 조건의 효율성 감소 했다.
여기, 우리 고유의 문제를 해결 하려면 다른 방법을 설명 RNA를 사용 하 여 비타민 b 복합체/streptavidin 전략의 기판에 biotin covalently에 연결 5' 를 통해 끝내는 사진 쪼갤 1도-(2-nitrophenyl)은 에틸 moiety 장파 UV13,14에 민감한. 우리는 초파리 에서 제한 U7 종속 처리 기계의 정화에 대 한이 접근을 테스트 하 고 포유류 핵15를 추출 합니다. 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 외피와 핵 추출와 사진 쪼갤 링커, 조립된 처리 단지는 streptavidin 구슬에 움직일 수 철저 하 게 세척, 부드럽게 네이티브에서 솔루션 출시 ~ 360 nm UV 빛에 노출에 의해 형태. UV-차입 방법은 매우 효율적, 신속 하 고 간단, 저조한 은색 추출15의 작은 100 µ L에서 얼룩에 의해 그것의 구성 요소를 시각화 하기 위해 U7 snRNP의 충분 한 양을. UV eluted 자료 배경 단백질의 무료 이며 직접 질량 분석 분석, 추가 정화 단계 및 효소 분석 실험에 적합. 동일한 방법은 비교적 짧은 RNA 바인딩 사이트를 필요로 하는 다른 RNA 또는 단백질 복합물의 정화에 대 한 채택 될 수 있습니다. Biotin과 사진 쪼갤 링커 수 또한 covalently 장착할에 단일 및 더블-좌초 DNA, 잠재적으로 다양 한 DNA/단백질 복합물의 정화에 대 한 UV 차입 메서드를 확장.
Covalently 포함 된 RNA 기판의 화학 합성 연결 biotin 이며 사진 쪼갤 링커만 ~ 65 뉴클레오티드를 초과 하지 않는 시퀀스와 실용적인 비싸고 시간이 오래 시퀀스 비효율적 되고있다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 또한 훨씬 더 긴 RNA 바인딩 대상에 적합 한 대체 접근을 개발 했다. 이 방법에서는, 어떤 길이 뉴클레오티드 순서의 RNA 생성 된 생체 외에서 SP6 또는 T7 전사에 의해 이며 biotin과 5' 끝 (트랜스 에 사진 쪼갤 링커 포함 하 고 하는 짧은 보완 oligonucleotide를 단련 구성)입니다. 결과 이중은 이후 개별 바인딩 단백질 또는 고분자 복합물 streptavidin 구슬 같은 프로토콜 covalently 첨부 사진 쪼갤 biotin 포함 된 RNA 기판에 대 한 설명 다음에 정화 하는 데 사용 됩니다 (cis 구성). 이 수정 사진 쪼갤 biotin에서 생체 외에서 생성 된 성적 정화의 광범위 한 범위의 RNA/단백질을 위한 UV 차입 메서드를 확장 하는 뉴클레오티드의 수백을 포함와 함께에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Streptavidin-Agarose</td><td>Sigma</td><td>S1638-5ML</td><td></td></tr><tr><td>고강도, 장파 UV 램프</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-00</td><td></td></tr><tr><td>교체 전구</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-97600-19</td><td>100와트 Mercury H44GS-100M 전구 366nm 자외선(Sylvania)</td></tr>을 방출하는 <tr><td>RNA 및 올리고뉴클레오티드(cis</td><td>Dharmacon(콜로라도주 라파예트) 또는 Integrated DNA Technologies, Inc.(아이오와주 코럴빌)</td><td></td><td>Dharmacon</td></tr><tr><td>Beckman GH 3.8 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템(T7 중합효소)</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템(SP6 중합효소)</td><td>Promega</td><td>P1280</td><td></td></tr><tr><td>피어스 실버 스테인 키트</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>24612</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 단계 정화 rna biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

많은 년간, biotin와 streptavidin 사이의 매우 강력 하 고 급속 하 게 형성 된 상호 작용은 생물학으로 중요 한 RNA 또는 단백질 복합물의 부분 정화에 대 한 성공적으로 이용 되어. 그러나,이 전략의 광범위 한 사용을 제한 하는 하나의 주요 단점에서 고통: biotin/streptavidin 상호 작용 또한 따라서 제외 eluted 단지의 무결성을 중단 시킬 조건을 변성 시키기의 밑 에서만 깨진 수 있습니다 그들의 이후 기능 분석 및/또는 다른 방법으로 추가 정화. 또한, eluted 샘플 자주 nonspecifically streptavidin 구슬, 순화 된 단지의 분석은 얼룩 및 질량 분석에 의해 복잡 하 게 연관 배경 단백질 오염. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리는 biotin 사진 쪼갤 링커를 통해 RNA 기판에 연결 된와 streptavidin 구슬에 움직일 단지는 선택적으로 eluted 솔루션에 biotin/streptavidin 전략의 변종 개발을 장파 UV, 구슬에 배경 단백질을 떠날에 의해 기본 형태. 짧은 RNA 바인딩 기판 수 수 합성 화학적으로 biotin과 covalently는 RNA의 5' 끝에 첨부 된 사진 쪼갤 링커 반면 긴 RNA 기판 보완 oligonucleotide에 의해 두 그룹으로 제공 될 수 있다. UV-차입 방법의이 2 개의 이체 3' 끝 히스톤 사전-mRNAs를 쪼개 U7 snRNP 종속 처리 단지의 정화에 대 한 테스트 되었습니다 그리고 그들은 둘 다 이전 다른 호의 베 풀 비교 하 정화 방법을 개발 입증. UV eluted 샘플 포함 쉽게 감지 양의 U7 snRNP 주요 단백질 오염 물질의 무료 하 고 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 직접 분석에 적합 했다. 설명된 메서드를 쉽게 다른 RNA 바인딩 복합물의 정화에 대 한 적응 하 고 DNA 특정 단백질 및 고분자 복합물 정화 단일 및 이중 가닥 DNA 바인딩 사이트와 함께 사용 될 수 있습니다.

UV-차입 메서드 covalently pcB moiety (cis 구성)에 5' 끝에 연결 된 두 개의 화학적 합성된 RNA 기판 테스트 했다: pcB-SL (그림 1) 및 pcB-dH3/5 m RNAs (그림 2). 31-뉴클레오티드 pcB-SL RNA 포함 5 뉴클레오티드 단 하나 좌초 된 꼬리 뒤 줄기 루프 구조와 그 시퀀스는 성숙한 히스톤의 3' 끝 mRNA (즉., 히스톤 사전-U7 snRNP에 의해 mRNA의 분열 후). 이 독특한 시퀀스 두 단백질 현재 포유류 세포질 분수에 대 한 알려진된 바인딩 사이트입니다: SLBP 3' hExo16,,1718. pcB...

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

이 방법은 RNA 단백질 복합체를 분리하고 질량 분석법에 의하여 그들의 조성물을 확인하는 것을 시도하는 연구원에게 주의해야 합니다. 우리는 우리의 프로토콜이 제한된 양으로 세포에 존재하고 긴 다단계 정화 절차 동안 해리하는 경향이 있는 복합체를 정화하는 데 특히 유용할 것이라고 믿습니다. 이 방법의 주요 장점은 단일 정화 단계만 을 포함하고 모든 길이및 서열의 RNA 결합 부위와 함께 사용될 수 있다는 것입니다.일부 단계를 시연하는 것은 우리 그룹의 선임 연구 기술자인 샤오쿠이 양이 될 것입니다. 65개의 뉴클레오티드보다 훨씬 긴 결합 부위의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 T7 생성 된 RNA 및 어댑터 PCB 올리고뉴클레오티드를 얻습니다. 결합 완충제의 100 마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 어댑터 올리고뉴클레오티드의 100 피코몰과 RNA의 20 피코몰을 혼합.튜브를 끓는 물에 넣고 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 물이 실온으로 식힙니다. pH 8에서 80 밀리머 EDTA를 함유한 마우스 핵 추출물의 1 밀리리터를 10 밀리머의 최종 농도로 보충합니다.그런 다음 PCB 모이티로 태그된 RNA 기판의 5 그리고 10 피코몰을 추가합니다. 5분 동안 얼음에 배양하여 샘플을 섞는 경우가 있습니다. 다음으로 전냉각된 미세원심분리기를 섭씨 4도에서 원심분리하여 10분 동안 10, 000배 g에서 혼합물을 원심분리하여 잠재적침전을 제거합니다.펠릿 이송을 피하기 위해 주의하면서 얼음에 새로운 튜브로 상체를 조심스럽게 수집합니다. 약 100 마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로즈 비드 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기다. 구슬 세척을 시작하기 위해 약 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다.2-3분 동안 25배 g의 원심분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 2~3회 반복하여 구슬을 바인딩 버퍼로 평형화합니다. 이전에 수집된 상체를 평형 구슬 위에 조립된 복합체가 들어 있는 로드합니다.튜브 회전기를 사용하여 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전하여 RNA를 고정하고 복합체를 구슬에 고정시하십시오. 다음으로 튜브의 바닥에 구슬을 수집하기 위해 2~ 3 분 동안 25 배 g에서 튜브를 회전시십시오. 상체를 흡인합니다.그리고 이전에 설명된 세척 공정을 사용하여 바인딩 버퍼로 구슬을 두 번 헹구는 다. 두 번째 세척의 상체를 제거한 후, 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가하고 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전시합니다. 2-3분 동안 25배 g로 샘플을 회전시.다음으로 바인딩 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 서스펜션을 새 튜브로 전송합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 최대 1시간 동안 회전시합니다. 2~3분 동안 25배 g의 고정된 복합체원심분리기.그런 다음 슈퍼나탈을 흡인하고 200 마이크로리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다. 구슬을 500 마이크로리터 튜브로 옮기습니다. 365 나노미터에서 UV 광을 방출하고 전체 광채에 도달 할 수있는 고강도 UV 램프를 켭니다.페트리 접시의 바닥을 꽉 포장된 얼음으로 채우면 접시 뚜껑 위에 쌓입니다. 고정 된 복합체를 포함하는 튜브를 간략하게 소용돌이. 그런 다음 얼음 위에 수평으로 놓고 미리 데워진 램프로 덮어 샘플이 전구 표면에서 2~3cm 떨어져 있는지 확인합니다.균일한 노출을 보장하고 과열을 방지하기 위해 튜브를 자주 반전하고 소용돌이치면서 총 30 분 동안 샘플을 조사하십시오. 그 후 25회 g에서 2-3분간 구슬을 스핀다운하고 상수모를 수집합니다. 원심 분리는 동일한 조건을 사용하여 다시 한 번이 상신합니다.잔류 구슬을 옮기지 않도록 튜브 바닥에 소량을 두는 결과 상체를 수집합니다. SDS-PAGE 전기포고증을 사용하여 UV 용출 후 구슬에 남아 있는 물질로부터 UV 용출 된 상신제의 일부와 해당 분획을 분리합니다. 다음으로 시판되는 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 염색합니다.UV 에로테인초상체에 존재하는 단백질의 강도와 UV 조사 후 구슬에 남은 단백질의 강도를 비교하여 UV 용출의 효율을 평가한다. 관심있는 단백질 밴드를 소비하고 질량 분석법에 의해 자신의 정체성을 결정합니다. 그 후, 질량 분광법에 의해 UV 용출 된 상체의 일부를 직접 분석하여 정제 된 물질의 전체 프로테오메를 편견없는 방식으로 결정합니다.이 연구에서는, 광클레이블 비오틴으로 태그된 줄기 루프 RNA는 마우스 골수종 세포로부터 얻어진 세포질 S100 추출물의 1밀리리터로 배양된다. 그리고 자외선 용출의 효과와 효율은 은 염색에 의해 분석됩니다. 많은 단백질이 자외선 용출 전에 스트렙타비딘 구슬에서 검출됩니다.긴 파도 UV를 가진 조사는 구슬에 비특정 배경을 남기는 상체로 이 단백질의 단지 몇몇을 풀어 놓습니다. 이것은 UV 용출 단계의 중요성을 강조합니다. 질량 분석법은 주요 UV 용출 단백질을 3'hExo 및 SLBP로 식별하며 SLBP는 전체 길이 단백질과 다수의 짧은 분해 제품으로 표현되고 있습니다.다양한 RNA 결합 단백질로 확인된 소량의 다른 단백질도 UV 조사에 의해 용액으로 선택적으로 방출된다. 핵 추출물로 배양된 광클형 비오틴으로 태그된 고정된 Drosophila histone 의 UV 용출은 구슬에 남아 있는 비특이적 단백질의 강렬한 배경을 가진 소수의 단백질만 초상체에 선택적 방출을 초래하였다. 질량 분석법은 이러한 단백질을 U7 snRNP의 성분으로 식별합니다.그들은 히스톤 프리 mRNA에 U7 snRNP의 결합을 차단하는 처리 경쟁자의 존재에서 검출되지 않습니다. 고강도 UV 램프를 사용하고 조사된 샘플과 가까운 거리를 배치하는 동시에 과열되지 않도록 하는 것이 중요합니다. UV 용출 방법은 주요 오염 물질이 부족하고 추가 정화 단계 및 기능적 작용에 직접적으로 적합한 네이티브 RNA 단백질 복합체를 산출합니다.자외선 조사 중에 눈과 피부 노출을 피하십시오.

single-step-purification-macromolecular-complexes-using-rna-attached

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 mRNA에서 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부 요소(ARE) 염기서열과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질(RBP)을 식별하기 위한 체외 RNA 풀다운 분석을 보여줍니다. 세포 용해물의 표적 RBP는 RNA 프로브와 혼합되어 RNA 단백질 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 RNA 프로브의 desthiobiotin 라벨과 streptavidin-labeled magnetic bead의 친화성을 활용하여 친화성 정제를 통해 분리됩니다.

친화성 추출을 통해 RNA 결합 단백질을 분리하기 위한 RNA-단백질 풀다운 분석

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 &lt;35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

여기에서 우리는 인간 세포의 총 단백질 추출물, 비오티닐화 RNA로 코팅된 스트렙타비딘 비드 및 질량 분석 분석을 사용하여 특정 RNA 서열의 단백질 상호작용자를 발견, 정량화 및 검증하기 위한 최적화된 시험관 내 방법을 제시합니다.

짧은 비오티닐화 RNA를 사용한 RNA 결합 단백질의 최적화된 정량적 풀다운 분석

배우세요 광분해성 링커와 UV 용출을 이용한 단일 단계 RNA/단백질 복합체 정화 방법. 이 기술은 세포 내 소량 존재하는 복합체를 기능성을 유지하며 질량 분석이 가능하게 합니다.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

더 많은 동영상 탐색