Name: 마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 학습하세요 마이크로전극 어레이를 이용해 마우스 척수 후각각 회로의 네트워크 활동을 기록하는 방법을. 4-아미노피리딘 자극으로 안정적인 리듬 활동을 유도하고 진통제 후보 물질을 선별하는 플랫폼을 제공합니다.

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이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC) (B.A.G. 및 R.J.C.에 대한 631000, 1043933, 1144638 및 1184974 보조금)와 헌터 의학 연구소 (B.A.G. 및 R.J.C.에 대한 보조금)가 자금을 지원했습니다.

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
<li>Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+induces+expansion+of+cutaneous+receptive+fields+of+dorsal+horn+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells.</a> Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+oscillatory+Ca2%2B+waves+in+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn.</a> European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).</li>
<li>Egert, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).</li>
<li>Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays+for+electrophysiological+monitoring+of+hippocampal+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).</li>
<li>Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present+and+future+of+spike+sorting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Past, present and future of spike sorting techniques.</a> Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).</li>
<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+membrane+excitability+in+rat+spinal+lamina+I+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

통각적 신호전달, 처리 및 통증을 특징짓는 행동 및 정서적 반응에서 척추 DH의 중요성에도 불구하고, 이 영역 내의 회로는 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이 문제를 조사하는 데있어 중요한 도전은 이러한 회로 6,31,32를 구성하는 뉴런 집단의 다양성이었습니다. 광유전학과 화학유전학이 주도하는 트랜스제닉 기술의 최근 발전은 이러한 중요한 연관성을 풀고 감각 정보를 처리하는 미세 회로를 정의하기 시작했습니다 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 </su...

척수 DH 내의 특정 유형의 억제 및 흥분성 인터뉴런의 역할은 빠른 속도로 밝혀지고 있습니다 1,2,3,4. 함께, 인터뉴런은 DH에서 뉴런의 95% 이상을 차지하며 nociception을 포함한 감각 처리에 관여합니다. 또한, 이러한 인터뉴런 회로는 말초 신호가 신경축을 상승시켜 뇌에 도달하고 통증 5,6,7에 대한 인식에 기여하는지 여부를 결정하는 데 중요합니다. 현재까지 대부분의 연구는 시험관내 세포 내 전기 생리학, 신경 해부학 표지 및 생체 내 행동 분석 1,3,8,9,10,11,12,13,14의 조합을 사용하여 단일 세포 또는 전체 유기체 수준의 분석에서 DH 뉴런의 역할을 조사했습니다. . 이러한 접근법은 통증 처리에서 특정 뉴런 집단의 역할에 대한 이해를 상당히 향상 시켰습니다. 그러나 특정 세포 유형과 작은 매크로 회로가 마이크로 회로 수준에서 많은 뉴런 집단에 어떻게 영향을 미치는지 이해하여 DH의 결과, 행동 반응 및 통증 경험을 형성하는 데 차이가 남아 있습니다.
매크로 회로 또는 다셀 레벨 기능을 조사할 수 있는 기술 중 하나는 마이크로전극 어레이(MEA)15,16이다. MEA는 수십 년 동안 신경계 기능을 조사하는 데 사용되어 왔습니다17,18. 뇌에서 그들은 신경 발달, 시냅스 가소성, 약리학 적 스크리닝 및 독성 테스트17,18에 대한 연구를 촉진했습니다. 이들은 MEA의 유형에 따라 시험관내 및 생체내 적용 모두에 사용될 수 있다. 또한, MEA의 개발은 빠르게 발전해 왔으며, 현재 다양한 전극 번호와 구성을 사용할 수 있습니다19. MEA의 주요 장점은 여러 전극15,16을 통해 높은 공간 및 시간적 정확도로 많은 뉴런에서 전기 활동을 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 이것은 뉴런이 회로와 네트워크, 제어 조건 및 국부적으로 적용된 화합물의 존재하에 어떻게 상호 작용하는지에 대한 광범위한 판독을 제공합니다.
시험관내 DH 제제의 한 가지 과제는 진행중인 활성 수준이 전형적으로 낮다는 것이다. 여기서, 이러한 과제는 DH 회로를 화학적으로 자극하기 위해 전압 게이팅된 K+ 채널 차단제인 4-아미노프리딘(4-AP)을 사용하는 척수 DH 회로에서 해결된다. 이 약물은 이전에 급성 척수 절편의 DH와 급성 생체 내 조건20,21,22,23,24에서 리듬 동기 전기 활동을 확립하는 데 사용되었습니다. 이 실험은 4-AP 유도 활성20,21,22,23,24,25를 특성화하기 위해 단일 세포 패치 및 세포외 기록 또는 칼슘 이미징을 사용했습니다. 함께,이 연구는 리듬 4-AP 유도 활성에 대한 흥분성 및 억제 시냅스 전달 및 전기 시냅스의 요구 사항을 입증했습니다. 따라서, 4-AP 반응은 약물-유도된 에피현상이라기보다는 생물학적 관련성을 갖는 천연 폴리시냅스 DH 회로를 마스크해제하는 접근법으로 간주되어 왔다. 더욱이, 4-AP 유도 활성은 신경병증성 통증 상태로서 진통 및 항간질 약물과 유사한 반응 프로파일을 나타내며, 콘넥신20,21,22와 같은 신규한 척추 기반 진통제 표적을 제안하는데 사용되어 왔다.
여기에서, MEAs와 척추 DH의 화학적 활성화를 4-AP와 결합하여 매크로 회로 또는 네트워크 수준의 분석에서 이러한 nociceptive 회로를 연구하는 제제가 설명된다. 이 접근법은 순진하고 신경 병증적인 '통증과 같은'조건에서 nociceptive circuit을 조사하기위한 안정적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 제제는 또한 알려진 진통제의 회로 수준 작용을 테스트하고 과민성 척수에서 새로운 진통제를 스크리닝하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>4-아미노피리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>써모 피셔</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 긴 손잡이 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 공기 인터페이스 배양 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Thermo Fisher</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술 용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 순간 접착</td><td>볼트 및 산업 용품</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEA, 3차원</td><td>다채널 시스템</td><td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 질화티타늄(TiN) 전극(내부 기준 전극 1개 포함), 8x8 정사각형 그리드로 구성. 전극은 12 & 마이크로입니다. m 직경, 40 & 마이크로; m (100/12/40) 또는 50 &micro; m (200/12/50) 높고 등거리 간격 100 & 마이크로; m (100/12/40) 또는 200 & 마이크로; M(200/12/50) 간격.</td></tr><tr><td>MEA 헤드스테이지</td><td>다채널 시스템</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>MEA 인터페이스 보드</td><td>다채널 시스템</td><td>MCS-IFB 3.0 멀티부트</td><td></td></tr><tr><td>MEA 네트워크</td><td>다채널 시스템</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>MEA 관류 시스템</td><td>다채널 시스템</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>MEA, 평면</td><td>다채널 시스템</td><td>60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti</td><td>1개의 내부 기준 전극이 있는 60개의 질화티타늄(TiN) 전극, 8x8 정사각형 그리드(200/30) 또는 6x10 직사각형 그리드(500/30)로 구성됨. 전극은 30 & 마이크로입니다. 직경이 m이고 등거리 간격이 있는 200 &마이크로; m (200/30) 또는 500 &micro; m(500/30) 간격.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Motic</td><td>Moticam X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 분석기 소프트웨어</td><td>다중 채널 시스템</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>다중 채널 실험자 소프트웨어</td><td>다중 채널 시스템</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>소형 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>소형 수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>써모 피셔</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td></td><td></td><td>cyanoacrylate 접착제</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>진동 차단 테이블</td><td>Newport</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

척수 등쪽 뿔 (DH) 내의 특정 유형의 뉴런의 역할과 연결성은 척추 통증 처리를 뒷받침하는 회로에 대한 점점 더 상세한 시각을 제공하기 위해 빠른 속도로 묘사되고 있습니다. 그러나, DH에서의 더 넓은 네트워크 활성에 대한 이러한 연결의 효과는 대부분의 연구가 단일 뉴런 및 작은 미세 회로의 활성에 초점을 맞추기 때문에 덜 잘 이해되고 있다. 대안으로, 많은 셀에 걸친 전기적 활동을 모니터링할 수 있는 미세전극 어레이(MEA)의 사용은 신경 활동의 높은 공간적 및 시간적 분해능을 제공한다. 여기에서, 4-아미노피리딘 (4-AP)으로 DH 회로를 화학적으로 자극함으로써 유도된 DH 활성을 연구하기 위해 마우스 척수 절편과 함께 MEAs의 사용이 기술된다. 생성된 리듬 활성은 피상적 DH로 제한되고, 시간이 지남에 따라 안정하며, 테트로도톡신에 의해 차단되고, 상이한 슬라이스 배향에서 조사될 수 있다. 함께,이 제제는 순진한 동물, 만성 통증의 동물 모델 및 유 전적으로 변경된 nociceptive 기능을 가진 마우스의 조직에서 DH 회로 활성을 조사하는 플랫폼을 제공합니다. 또한, 4-AP 자극 척수 절편에서의 MEA 기록은 척수 DH에서의 활성을 방해하는 신규한 항항민성 화합물의 능력을 평가하기 위한 신속한 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다.

척수 등쪽 경적의 네트워크 활동 모델 4-AP의 적용은 척수 DH에서 동기식 리듬 활동을 확실하게 유도한다. 이러한 활동은 EAP 및 LFP의 증가로 나타납니다. 후술하는 신호는 MEA 기록(30)에서 이전에 설명되었던 저주파 파형이다. 약물 적용 후 EAP 및/또는 LFP 활성의 변화는 변경된 신경 활성을 반영한다. EAP 및 LFP의 예는 그림 3B 및 그림 4에 나와 있습니다. 여기서 초점은 EAP/LFP 데이터의 파라미터 또는 특징에 있습니다: 주파수, 총 카운트, 활성 전극 카운트, 여러 전극에서 검출된 동시 입사 이벤트의 수, 연결된 인접 전극의 수 및 인접한 전극 간의 결합 강도를 특징으로 하는 동시성. 대표적인 결과는 표 3 및 도 3, 도 4, 도 5</stron...

척수 등쪽 경적에서 네트워크 수준의 nociceptive 활성을 조사하기 위한 마이크로전극 어레이 기술과 4-아미노피리딘-유도된 화학적 자극의 조합된 사용이 개략적으로 설명된다.

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

귀하에게 설명된 MEA 4-AP 척추 슬라이스 준비는 등쪽 경적 회로의 연결성과 척추 감각 처리 중에 이러한 네트워크가 어떻게 상호 작용하는지 연구하는 플랫폼을 제공합니다. 제시된 방법론은 등쪽 경적 회로 활동을 거시적 인 지역 해상도 수준에서 조사 할 수있게합니다. 이 준비는 척추 감각 회로에서 신호 전달을 방해하는 화합물의 능력을 평가하는 신속한 스크리닝 도구로 사용될 수 있습니다.이 방법은 특정 세포 유형과 작은 마이크로 회로의 활동이 어떻게 많은 뉴런 집단에 영향을 미치는지에 대한 우리의 이해의 격차를 해소하여 등쪽 뿔 행동 반응의 결과와 궁극적으로 통증 경험을 형성하는 데 도움이됩니다. 시작하려면 MEA를 30 분 동안 말 혈청으로 잘 채 웁니다. 혈청을 제거한 후 증류수가 거품이 없을 때까지 MEA를 증류수로 다섯 번 완전히 헹구십시오.그런 다음 인공 CSF로 우물을 채 웁니다. 마취된 마우스를 무력화시킨 후, 엉덩이 수준에서 피부를 작게 절단하여 복부 부위 위의 피부를 제거한다. 그런 다음 모든 피부가 흉곽 케이지의 상단에서 골반 상단까지 심실 및 등쪽으로 제거 될 때까지 절단의 양쪽에있는 피부를 로스트랄로 당깁니다.시체를 얼음 위에 놓은 후, 복부 접근법을 사용하여 내장을 제거하고 갈비뼈를 통해 흉골에 옆으로 절단하여 척추 기둥을 노출시킵니다. 견갑골과 하지와 골반의 복부 흉곽을 제거하십시오. 척추 컬럼 및 늑골 제제를 얼음 차가운 수크로오스 인공 CSF를 함유하는 해부 욕조로 옮깁니다.허리 근육과 부착 된 위쪽 갈비뼈를 통해 핀을 배치하여 준비의 네 모서리를 모두 고정하십시오. rongeurs로 척추의 복부 표면 위에 놓인 모든 근육 및 결합 조직을 제거하고 T12-L2 척추 몸체 아래에있는 요추 - 천골 확대에 대한 척추 영역을 확인하십시오. 요추 - 천골 확대 부위에 척추 신체 꼬리를 제거하여 척추관에 앉아있는 척수에 접근하십시오.구부러진 스프링 가위를 사용하여 척추 페디클을 양측으로 자르고 척추 몸을 로스트랄로 들어 올리고 당겨 척추의 복부와 등쪽 측면을 분리하고 척수를 노출시킵니다. 요추 - 천골 확대를 드러내기 위해 척추 시체를 제거하면 코드가 자유롭게 떠 다닐 때까지 봄 가위로 척수를 고정시키는 나머지 뿌리를 조심스럽게 제거하십시오. 요추 - 천골 확대 위와 아래의 로스트랄 및 꼬리 절단으로 척수를 분리하여 코드의 대상 부위가 자유롭게 떠 다니도록하십시오.횡단 슬라이스의 경우, 중앙에 얕은 채널이 절단된 프리컷 폴리스티렌 블록에 부착된 경로로 요추-천골 세그먼트를 들어 올려 놓습니다. 그런 다음 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 블록 및 코드를 단면화 플랫폼에 부착하고 얼음 냉장 자당 인공 CSF 슬러리를 함유 한 절단 욕조에 놓습니다. 일단 300 마이크로미터 두께의 슬라이스가 얻어지면, 슬라이스를 산소화된 인공 CSF를 함유하는 공기 계면 인큐베이션 챔버로 옮기고 슬라이스가 실온에서 한 시간 동안 평형화되도록 한다.등쪽 뿔 활동 기록을 시작하려면 인공 CSF로 채워진 대형 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 인큐베이터에서 MEA 웰로 슬라이스를 옮기고 추가 인공 CSF를 추가하십시오. 미세한 짧은 머리 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 60 전극 기록 어레이 위에 놓습니다. 그런 다음 가중 목을 조직 위에 올려 놓고 제자리에 고정시키고 MEA 전극과의 좋은 접촉을 촉진하십시오.MEA를 기록 헤드 스테이지에 배치합니다. 반전 현미경을 사용하여 전극 위의 조직의 위치를 확인하여 가능한 한 많은 전극이 피상적 인 DH 아래에 있는지 확인하십시오. 적어도 두 개에서 여섯 개의 전극이 슬라이스에 닿지 않도록 하십시오. 카메라를 장치에 연결한 후 분석 중에 사용할 MEA를 기준으로 슬라이스의 참조 이미지를 촬영합니다.그런 다음 기록 소프트웨어에서 시작 DAQ를 누르고 모든 전극이 명확한 신호를 수신하는지 확인합니다. 다음으로, 관류 입구 및 출구 라인을 인공 CSF로 채워진 MEA 웰에 부착하고 관류 시스템을 켭니다. 유속을 확인하고 유출이 수퍼 퓨세이트의 오버플로를 방지하기에 충분한지 확인하십시오.조직을 다섯 분 동안 평형화시킨 후, 다섯 분 동안 원시 기준선 데이터를 기록한다. 관류 유입 라인을 인공 CSF에서 4-아미노피리딘 용액으로 이동시키고, 4-아미노피리딘 유도 리듬 활성이 정상 상태에 도달할 때까지 12분 동안 기다린다. 그 후, 4-아미노피리딘 유도 활성의 오분을 기록하고, 약물을 시험하거나 4-아미노피리딘의 안정성을 확인하기 위해 후속 기록을 준비한다.각 녹음 세션이 끝나면 인공 CSF로 선을 헹구십시오. 헤드 스테이지에서 MEA를 제거하고 MEA 웰에서 그물 및 조직을 제거한 후, 인공 CSF로 MEA와 그물을 헹구고 새로운 슬라이스로 전체 과정을 반복하십시오. 분석 소프트웨어를 열고 미리 만들어진 분석 레이아웃을 로드합니다.관심 있는 파일을 열고 참조 전극 및 과도하게 시끄러운 것으로 간주되는 전극의 선택을 취소합니다. 분석할 시간 창을 설정합니다. 그런 다음 교차 채널 필터 탭으로 이동합니다.실험 중에 찍은 이미지와 메모를 기반으로 복잡한 참조 및 참조 전극을 선택하고 계속하기 전에 탐색을 누릅니다. EAP 필터 탭으로 이동하고 두 번째 순서 하이패스 버터워스 필터를 적용하여 LFP 활동을 제거합니다. LFP 필터 탭으로 이동하고 두 번째 순서 대역 통과 버터워스 필터를 적용하여 EAP 활동을 제거합니다.EAP 검출기 탭에서 자동 임계값을 선택하고, 상승 및 하강 에지 박스를 체크하고, 데드 타임을 세 밀리초로 설정하십시오. 양수 및 음수 임계값을 설정하려면 원시 데이터 분석기 화면으로 돌아가 시간 마커를 이동한 다음 EAP 검출기 탭으로 돌아가 탐색을 눌러 데이터를 검사합니다. 설정된 검출 임계값이 잡음 또는 비생리적 활성을 포착하지 않고 EAP를 캡처할 때까지 이 과정을 반복한다.LFP 검출기 탭에서 수동 임계값을 선택하고 상승 및 하강 에지 박스를 체크한 다음 데드 타임을 세 밀리초로 설정하십시오. 하나의 전극에 대한 임계값을 설정하고 충족되면 모두 적용을 선택한 다음 분석 시작을 누릅니다. 전압 게이팅된 나트륨 채널 길항제 테트로도톡신의 배쓰 적용은 EAP 및 LFP 활성을 모두 폐지하여, 이들 신호의 스파이크 의존성을 확인하였다.4-아미노피리딘 유도 활성 파라미터의 안정성은 EAP 또는 LFP를 특징으로 하였다. LFPs에 대한 모든 활성 특성 플러스 활성의 우연의 일치는 4-아미노피리딘 적용 후 12분과 15분 후에서의 4-아미노피리딘 유도 활성의 유사성에 기초하여 안정하였다. 이 기능의 EAP 또는 LFP는 여러 전극에서 감지되는 일치 이벤트의 수가 증가하는 것이 특징입니다.연결된 인접 전극의 수, 및 4-아미노피리딘 자극 후 상대적인 안정성에 뒤따르는 인접한 전극과 LFPs 사이의 결합의 강도. 슬라이스 배향은 시험관내 제제를 위한 중요한 고려사항이다. 4-아미노피리딘 자극은 슬라이스 배향에 관계없이 SDH에서 유사한 리듬 활성을 유도하였다.마지막으로, DH 네트워크의 4-아미노피리딘 활성화의 관련성에 대해 추가로 밝히기 위해, 상승된 칼륨 인공 CSF 용액을 도포하고 4-아미노피리딘 자극에 대한 유사한 DH 반응을 불러일으키는 것으로 나타났다. 프로토콜의 주요 단계는 조직 준비 및 절편의 배치에 있으며, 신중을 통해 조직이 건강하다는 것을 보장하지만시기 적절하고 해부 된 MEA 상의 조직의 섬세한 최적 위치는 양질의 결과를 얻는 데 도움이됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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microelectrode array-based assessment of neuronal networks in mouse spinal cord slices(쥐 척수 절편에서 신경 네트워크에 대한 Microelectrode Array-based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices)

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쥐에서 좌골 신경 C-섬유의 생체 내 단일 섬유 기록

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

우리는 동시에 응답 nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 electrocorticography와 로컬 필드 전위를 기록 하는 기술을 개발 했다. 이 기술은 nociceptive 정보를 뇌에서 처리 조사를 용이 하 게 electrocortical 신호는 생체 및 거시적인 수준에서의 직접적인 관계를 설정 하는 데 도움이 됩니다.

대뇌 피 질의 로컬 필드 전위 및 응답 Nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 Electrocorticograms의 동시 녹음

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

APTrack은 Open Ephys 플랫폼용으로 개발된 소프트웨어 플러그인으로, 실시간 데이터 시각화 및 뉴런 활동 전위의 폐쇄 루프 전기 임계값 추적을 가능하게 합니다. 우리는 이것을 인간 C-섬유 통각수용체와 마우스 C-섬유 및 Aδ-섬유 통각수용체에 대한 미세신경조영술에서 성공적으로 사용했습니다.

중개 통증 연구를 위한 오픈 소스 실시간 폐쇄 루프 전기 임계값 추적

여기서는 급성, 마취, 생체 내 쥐 실험에서 두 가지 유형의 척수 전기생리학적 측정을 사용하여 신경섬유 아형의 활동을 구별할 수 있는 두 가지 유형의 측정법인 국소장 전위 및 광역 동적 범위 단일 뉴런 기록을 평가하는 방법을 제시합니다.

마취된 쥐에서 말초 통증 차단을 평가하는 전기생리학적 방법

학습하세요 마이크로전극 어레이를 이용해 마우스 척수 후각각 회로의 네트워크 활동을 기록하는 방법을. 4-아미노피리딘 자극으로 안정적인 리듬 활동을 유도하고 진통제 후보 물질을 선별하는 플랫폼을 제공합니다.

마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록

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