일회용 진단을위한 Microfluidic 응용

제 이름은 Catherine CloudBridge이며, 보스턴 대학교의 제조 공학, 공학 및 의생명공학 교수입니다. 또한 저는 의생명 마이크로 소자 및 마이크로 환경 연구실의 소장을 맡고 있습니다. 저희 연구실은 주로 자원이 제한된 환경에서 사용할 수 있는 일회용 진단 기기를 개발하는 연구를 수행하고 있습니다.

따라서 이러한 장치들을 제작하기 위해 미세유체 기술을 사용합니다. 저희는 실제로 두 가지 연구 분야에 관심을 두고 있습니다. 우선, 생체 분자와 세포가 플라스틱 폴리머 표면과 어떻게 상호작용하는지 살펴보는 것에 주된 관심을 가지고 있습니다.

이것이 저희의 주요 연구 범위입니다. 해당 연구는 일회용 진단 기기를 위한 미세유체 응용 분야로 구체화됩니다. 따라서 연구실에서 저희가 제작하는 것은 미세유체 장치입니다.

열가소성 소재의 경우, 일반적으로 실험실에서 미세유체 장치를 제작할 때 가장 많이 사용하는 고무 성질의 소재인 PDMS를 사용하지 않습니다. 저희는 열가소성 수지로 장치를 제작합니다. 저희의 관심사는 이러한 열가소성 장치를 이용하여, 중앙 집중식 실험실에서 멀리 떨어진 현장에서도 분자 생물학 실험을 수행할 수 있도록 마이크로 규모의 분자 생물학 기술을 구현하는 것입니다.

실험실에서 이것이 실제로 어떻게 구현되는지 설명하자면, 저희는 작은 플라스틱 카드를 제작하고 그 내부에 고상 추출 컬럼, 세포 용해 컬럼 또는 혼합 컬럼을 탑재합니다. 또한 검출 기술로서 칩 위에서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행합니다. 이 모든 요소는 하나의 소형 장치로 통합되며, 연구의 장기적인 전망으로는 원심 분리기나 가열 배양기 등 모든 부속 설비를 갖춘 대규모 실험실을 이용할 수 없는 현장이나 환경에서도 휴대하여 사용할 수 있는 통합 장치를 만드는 것이 목표입니다.

우리는 이상적으로 혈액, 소변, 대변 또는 비인두 면봉 검체(예를 들어 점액)와 같은 인체 샘플로 시작하여, 칩의 출력 단계에서 특정 미생물에 감염되었는지 여부에 대한 예 또는 아니오라는 답을 얻을 수 있기를 바랍니다. 이를 위해 환자의 샘플 내에서 해당 미생물의 종류에 따라 특정 DNA 또는 RNA를 검출하는 방식을 사용합니다.

따라서 발생하는 기술적 과제들은 주로 샘플 준비 단계에 집중되어 있습니다. 혈액, 대변 또는 소변과 같은 시료로 시작할 때, 많은 입자성 물질이나 PCR 및 기타 증폭 기술의 억제제가 포함된 복잡한 인체 샘플 상태에서 시작해야 합니다. 그리고 최종적으로는 매우 깨끗하게 용출된 핵산 샘플을 얻어, 이를 통해 찾고자 하는 미생물이 존재했는지 알려줄 특정 DNA 또는 RNA를 증폭하거나 탐색할 수 있어야 합니다.

따라서 이러한 샘플들을 정제하기 위해 몇 가지 단계를 거쳐야 합니다. 먼저 샘플을 필터링해야 하는데, 샘플의 종류에 따라 칩에 로딩하기 전 거친 여과(course filtration)나 짧은 원심분리(spin step) 과정이 포함될 수 있습니다. 저희는 항상 임상의로부터 받은 상태 그대로의 샘플로 시작하려고 노력합니다.

따라서 소변, 대변 및 비인두 도말 검체의 경우, 저희의 목표는 임상의가 평소와 다름없이 업무를 수행하고 평소 방식대로 검체를 채취하도록 하는 것입니다. 그런 다음 해당 검체를 칩에 넣습니다. 만약 그 단계에서 추가적인 여과가 필요하다면, 그 여과는 칩 내부에서 이루어지게 됩니다.

두 번째 단계에서는 분자 분석을 수행하기 때문에 샘플 내의 세포와 미생물을 용해시켜야 합니다. 따라서 보통 작은 공극 크기를 가진 필터에 샘플을 통과시키는 용해 단계를 수행합니다. 때로는 이 필터에 날카로운 모서리를 가진 탄소 나노튜브와 같은 나노입자가 포함되어 있어, 저희가 다루는 그람 양성균이자 용해가 매우 어려운 C difficile과 같이 세포벽이 더 견고한 일부 미생물들을 파쇄하는 데 사용될 수 있습니다.

따라서 더 강력한 용해 컬럼이 필요합니다. 일반적으로 우리는 칩 내부에서 화학적 및 기계적 용해를 병행하여 수행합니다. 그 후, 용해물을 이용하여 정제된 핵산을 추출하는 것이 목표입니다.

그 다음 용해물을 마이크로유체 칩 내부에 내장된 고체상 추출 컬럼으로 통과시킵니다. 이 고체상 추출 컬럼은 플라스틱으로 제작되었으며, 마이크로유체 채널이 이미 제작된 후 내부에서 광개시 화학 반응을 통해 만들어졌습니다. 또한, 핵산을 결합하고 방출시켜야 하므로 보통 실리카 입자가 함침되어 있습니다.

어떤 경우에는 예를 들어 mRNA를 특이적으로 결합하고 방출하기 위해 oligo DT 비드를 통합하거나, 특정 단백질을 결합하고 방출하기 위해 특정 항체가 부착된 비드를 사용하기도 합니다. 그리고 이러한 모든 기능을 수행하는 추출 컬럼을 제작할 수 있습니다. 하지만 오늘은 실리카 비드를 이용해 sase 추출 컬럼을 만드는 방법을 보여드리겠습니다.

그다음, 용해물을 실리카 컬럼에 통과시킵니다. 이 과정은 거시 규모 실험실에서 사용하는 Qiagen 키트와 동일한 방식으로 작동합니다. 이후 원치 않는 모든 성분, 즉 세포 용해물 및 나머지 인체 시료에 포함된 모든 탄수화물, 지질 및 기타 불순물을 제거하기 위해 세척 과정을 거칩니다. 그리고 마지막 단계에서 물로 용출합니다.

이러한 마이크로 규모 고상 추출 컬럼의 장점은 보통 1~5 µL 정도의 매우 적은 양의 물로 용리할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 투입한 핵산의 거의 대부분을 회수할 수 있으며, 해당 채널에서 회수되는 처음 10 µL 내에서 약 70~90%의 효율을 얻을 수 있습니다.

따라서 2~10 µL로 두 번 세척하면, 투입한 핵산의 거의 대부분을 회수할 수 있습니다. 이는 PCR이 가능한 깨끗한 샘플일 뿐만 아니라, 일반적인 벤치탑 키트로 얻을 수 있는 것보다 훨씬 더 고농도로 농축된 샘플이라는 것을 의미합니다. 이러한 모든 샘플 준비 기술의 최종 목표는 다른 연구자들이 수행한 작업들과 호환 가능한 결과물을 만드는 것입니다.

칩 위에서 PCR 증폭을 수행할 수 있음을 보여주는 매우 훌륭한 연구입니다. RNA 바이러스를 다루거나 유전자 발현 실험을 하고자 한다면, 칩 위에서 역전사 반응을 진행할 수 있습니다. 저희의 시료 준비 기술은 칩 상의 PCR과 직접 결합할 수 있으므로, 벤치에서 별도의 정제 및 시료 준비 과정을 거칠 필요가 없습니다.

또한, 소형 칩에서 다중 PCR을 수행하는 데 필요한 극소량의 시료를 얻기 위해 거쳐야 하는 농축 단계에 대해서도 설명하겠습니다. 따라서 오늘 보여드릴 실험에서는 PDMS가 아닌 열가소성 수지로 제작된 미세유체 칩을 어떻게 조립하는지, 그리고 일반적인 방식과는 조금 다른 칩 제작 및 밀봉 공정은 어떻게 이루어지는지를 보여드리겠습니다.

그 다음으로 칩 내부에서 광개시 화학 반응을 통해 세포 용해와 고상 추출 모두에 사용되는 폴리머 모놀리스를 제작하는 방법을 설명하겠습니다. 현재 실험실에서는 이러한 과정들이 모듈식으로 진행되고 있으나, 이를 통합할 수 있으며 실제로 통합해 왔습니다. 이 과정의 최종 결과물로 물에 녹아 있는 고농도의 핵산(RNA 및 DNA) 샘플을 얻게 되며, 이는 이후 PCR 모듈이나 다른 증폭 모듈로 전달되어 미생물이나 감염 여부를 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 현재 저희는 보스턴 의료 센터(Boston Medical Center)로부터 인플루엔자 A 감염 여부가 확인되지 않은 환자들의 인간 샘플을 수집하기 시작한 연구 과제를 수행하고 있습니다. 현재 독감 시즌이므로 해당 샘플들을 수집하고 있는 중입니다.

그리고 실험실에서는 인플루엔자 A 감염 여부를 확인하기 위해 표준 검사법인 배양 검사를 수행하는데, 이는 완료까지 수일이 소요됩니다. 이와 병행하여, 현재 저희 칩의 모듈에 이 시료들을 통과시키고 있습니다. 즉, 용해 컬럼과 고상 추출 컬럼에 시료를 통과시킨 후 PCR을 수행하여 표준 검사법과 비교했을 때 어느 정도의 성능을 보이는지 확인합니다.

이것이 현재 저희가 도달한 단계입니다. 이러한 실험들이 성공적으로 진행된다면, 향후 4년에서 6년 정도 후에는 통합 칩과 인플루엔자 A를 위한 완전한 분석법을 보유한 상황이 될 것으로 생각하며, 또한 clostridium difficile 및 분변 샘플에 대해서도 연구를 진행하고 있습니다. 저희는 장치뿐만 아니라 분석법까지 통합하는 단계에 매우 근접해 있습니다.

따라서 분석법 개발과 칩 설계는 반드시 병행되어야 합니다. 특정 애플리케이션을 통해 현장 진단(bedside) 단계에 도달하기 위해서는 그것이 진정으로 표적 지향적인 프로세스가 되어야 합니다. 현장 진단 용도로 칩을 최적화하기 위해서는 시작 시료와 찾고자 하는 미생물이 무엇인지 정확히 알고 있어야 합니다.

따라서 프로토타입 방식으로 그것을 실현하는 단계에 매우 가까워졌다고 생각합니다. 그것이 저희의 최종 목표이므로, 곧 달성할 수 있기를 바랍니다.