Typha latifolia(Cattail)의 배양 및 미생물 생물증강을 위한 최적화된 방법

저희 연구는 씨앗에서 부들 재배 프로토콜이 부족한 문제를 다룹니다. 우리는 미래의 식물 미생물 연구를 지원하기 위해 씨앗 발아, 초기 성장, 미생물 생물 증강에 대한 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 씨앗부터 부들 재배나 성숙 추적에 관한 연구는 드물지만, 부들은 습지 복원 연구에서 흔히 사용됩니다.

대부분의 부들 연구는 실험실에서 부들 번식을 위해 뿌리줄을 구매하는 과정을 포함합니다. 씨앗에서 부들을 재배하는 연구는 거의 없어 표준화된 방법이 없습니다. 도입된 미생물의 지속적인 발아와 지속적인 정착을 달성하는 것이 큰 도전이었습니다.

우리는 씨앗 발아와 미생물 생물 증강을 위한 재현 가능한 방법을 개발했으며, 조기 접종이 장기적인 집락화를 지원하는 데 어떻게 도움이 되는지 입증했습니다. 우선, 정원 가위를 사용해 Typha latifolia 식물의 줄기를 꽃차례 기부 약 2cm 떨어진 곳에서 자릅니다. 꽃차례에서 씨앗을 떼어내어 실험실 블렌더에 옮기고, 블렌더가 약 1/4 정도 차려질 때까지 옮기세요. 이는 약 250밀리리터의 압축되지 않은 씨앗에 해당합니다.

이제 블렌더에 500밀리리터의 수돗물을 채워 10센티미터 헤드스페이스를 유지하세요. 혼합물을 중간 저속으로 20초간 섞은 후, 점성이 높은 내용을 즉시 1리터 비커에 옮깁니다. 씨앗 물 혼합물을 약 100밀리리터 정도 다시 믹서기에 넣습니다.

그 다음 신선한 수돗물 400에서 600밀리리터를 넣고 중고속으로 20초간 갈아줍니다. 내용물을 새 1리터 비커에 부으세요. 이제 비커에 최대 800밀리리터의 수돗물을 채웁니다.

60초간 두었다가 씨앗을 건드리지 않고 위에 떠다니는 슬러지를 퍼내고, 남은 물을 천천히 부어 씨앗을 100밀리리터 비커에 옮깁니다. 남은 씨앗 물 슬러지를 혼합하는 과정을 반복하세요. 다음으로 분리된 씨앗이 담긴 비커를 저어주는 접시 위에 올려놓습니다.

저은 후 비커 표면에 떠 있는 식물성 찌꺼기를 퍼내세요. 씨앗을 필터 종이를 진공청소기에 부착한 부흐너 깔때기에 부어 하룻밤 말리게 하세요. 건조 씨앗은 50밀리리터 원뿔형 폴리프로필렌 튜브에 20도 섭씨에서 보관하세요.

1% 식물성 한천과 함께 반 강도의 무라시게와 스쿠그 매체 플레이트를 준비하세요. 말린 씨앗 약 1밀리그램을 15밀리리터 원뿔형 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 그 다음 튜브에 멸균 이중 증류수 10밀리리터를 넣습니다.

튜브를 중고속으로 궤도 셰이커에 10분간 올려놓습니다. 이제 튜브에서 물을 빼고 멸균된 이중 증류수에 준비한 0.1% 폴리소르베이트 20 용액 5밀리리터를 추가합니다. 튜브를 중간 고속으로 10분간 흔들어 보세요.

폴리소르베이트 20 용액을 제거하세요. 이후 모든 단계는 화염 또는 층류 후드 앞에서 수행하세요. 용액을 멸균된 이중 증류수에서 30% 상업용 표백제 5밀리리터와 0.025% 폴리소르베이트 20 용액으로 교체하세요.

상환액을 멸균된 이중 증류수로 교체하세요. 그 다음 튜브를 중간 속도로 5분간 흔듭니다. 세 번째 헹굿 후에는 튜브를 저속으로 24시간 돌려 발아를 유도합니다.

다음 날에는 과도한 물을 제거하고 튜브 안에 3밀리리터의 액체가 남아 있도록 하세요. 이제 무균 상태로 1000마이크로리터 플라스틱 피펫 팁을 잘라냅니다. 잘라낸 피펫 팁을 사용해 피펫을 힘차게 피펫 채우고 씨앗을 팁 안에 띄워 두세요.

씨앗과 액체를 무라시게와 스쿠그 한천 플레이트 1위에 반 농도의 플레이트에 올립니다. 접시를 부드럽게 휘저어 씨앗이 고르게 퍼지게 하세요. 실험실 밀봉 필름으로 플레이트를 감싼 후, 23도 섭씨, 습도 70%에서 16시간 조명과 8시간 어두운 사이클을 거치는 성장실에 넣으세요.

부들씨앗에 접종하려면 시연과 같이 폴리소르베이트 20 표백제와 이중 증류수로 씨앗을 멸균하세요. 600나노미터에서 루테이모나스 분리 균의 하룻밤 배양 광밀도를 측정합니다. 배양액에서 희석하여 배양물을 1.0으로 정규화합니다.

이제 9, 300G에서 1밀리리터 배양액을 원심분리하여 2분간 사용하세요. 상청액을 제거하고 펠릿을 1밀리리터의 PBS에 다시 부유시킵니다. 원심분리하여 상청액을 다시 제거한 후, 박테리아 펠릿을 멸균 이중 증류수 1밀리리터에 재현탁합니다.

멸균된 씨앗을 사용한 후, 같은 튜브 안에서 0.025% 유기실리콘 계면활성제로 1에서 10 희석으로 접종물을 희석합니다. 씨앗 발아 전에 현탁액을 저속으로 24시간 흔들면 됩니다. 우선 멸균된 식물 성장실 유닛에 수돗물로 미리 적신 토양을 채우세요.

루어 락 끝부분을 알루미늄 호일로 덮고, 액체 사이클로 20분간 오토클레이브하세요. 다음으로, 멸균 조건에서 0.2마이크로미터 필터 유닛을 성장실의 루어 락 커넥터에 부착합니다. 챔버를 열고 멸균된 1% x 20x20 x 20 x 20 필터 500마이크로리터를 흙에 추가하세요.

토양을 멸균 주걱으로 섞으면서 동시에 멸균된 이중 증류수를 넣어 토양이 과포화되지 않도록 수분을 유지하세요. 이제 멸균 면도날로 약한 오래된 묘목 한 개가 담긴 플레이트에서 무라시게와 스쿠그 한천을 4등분합니다. 멸균 주걱을 사용해 묘목이 있는 한천 조각 중 한 조각을 성장실의 준비된 토양 위에 옮깁니다.

성장실 유닛을 16시간 조명, 8시간 어두운 주기, 섭씨 23도, 습도 70%로 설정한 식물 성장 인큐베이터로 옮깁니다. Typha 씨앗의 완전한 흉터 제거는 씨앗 성분이 눈에 띄게 분리된 반면, 불완전한 흉터 제거는 부리가 붙어 있고 흉터가 벗겨지지 않은 씨앗은 온전하게 유지되었습니다. 멸균 수경재배 시스템은 부들과 Juncus 종의 성장을 지원하는 것으로 나타났으며, 여기서는 Juncus로 이미지화되어 최대 1년간 불임 시스템 내에서 유지되었습니다.

30% 표백제와 폴리소르베이트 20 방법을 사용한 20.8%의 최고 씨앗 발아율이 관찰되었으며, 이는 1시간 염소 가스 방식을 제외한 모든 다른 멸균 처리보다 유의미하게 높았으며, 1시간 염소 가스 방법은 완전한 씨앗 불임을 달성하지 못했습니다. 흉터 후 7일째에 발아한 Typha 묘목은 비멸균 페트리 플레이트 환경에서 눈에 띄는 라디칼과 새싹 조직을 발달시켰다. 토양으로 이식된 후, 타이파의 일부 묘목은 성공적으로 정착하여 1주에서 2주 이내에 새로운 순 조직을 생산했습니다.

DsRed 플라스미드를 가진 루테이모나스 종에 접종한 후, 접종 16일째에 티파 묘목 뿌리 전체에 붉은 형광 박테리아 정착이 관찰되었습니다.